СПОСОБ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ СБРАЖИВАЕМЫХ САХАРОВ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/14 C12P19/02 C12P19/04 C12N9/42 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, области биотехнологической переработки лигноцеллюлозных материалов, и может быть использовано для получения сбраживаемых сахаров, предназначенных для выработки этанола или других продуктов микробного синтеза, а также для использования в качестве кормовых добавок.

Широко известно, что мультиферментные комплексы карбогидраз, содержащие целлюлозолитические, бетаглюканолитические, гемицеллюлозолитические, ксилоглюканолитические и другие ферменты, лизирующие клеточную стенку растений, как и отдельные карбогидразы, могут быть использованы для биотехнологической переработки целлюлозо - и гемицеллюлозосодержащих субстратов, а также лигноцеллюлозных материалов, в том числе отходов лесодобывающей и лесоперерабатывающей промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации клеточных стенок растений, а также в пищевой и спиртовой промышленности, в пивоварении, в качестве добавок к кормам, для силосования кормов в сельском хозяйстве.

Известен способ гидролиза материалов с использованием ферментативного катализа с получением сбраживаемых сахаров [S.Mukataka, S.Negishi, S.Sato. J.Takahashi. Effect of presoaking treatment of support material on the activity of immobilized glucoamylase. Enzyme Microb. Technol. 1993. V.15, N 3. р.229-233], при этом в качестве ферментного катализатора используют биокатализатор, полученный путем иммобилизации глюкоамилазы на носителе - предварительно обработанных частицах костного материала свиньи, с последующей сшивкой адсорбированного фермента глутаровым альдегидом. В этом биокатализаторе глюкоамилаза сохраняет до 60% от ее активности в растворе - максимальная удельная активность иммобилизованной глюкоамилазы составляет 19,7 ЕА/мг белка, в среднем 2-5 ЕА/мг. Этот биокатализатор обладает относительно высокой стабильностью как в условиях периодического проведения процесса получения глюкозы (за 10 циклов, по 48 часов каждый, сохраняется до 70% первоначальной активности), так и при непрерывном функционировании (за 700 часов работы активность практически не изменяется).

Недостатком известного катализатора следует признать его непригодность для получения сбраживаемых сахаров из лигноцеллюлозных материалов.

Известен также (Saxena A. Simultaneous saccharification and fermentation of waste newspaper to etanol. Bioresour. Technol., 1992, №1, р.13-15) способ получения сбраживаемых сахаров из углеродсодержащего субстрата, в качестве которого использовано растительное сырье, с применением грибов Trichoderma reesei. При реализации известного способа растительную биомассу предварительно обрабатывают 1,1%-ным раствором серной кислоты при температуре 100°С в течение 10 минут, при этом удаляется до 93% гемицеллюлозной фракции, увеличивается поверхность контакта ферментов и целлюлозы. Ферментативный препарат добавляют к оставшейся лигноцеллюлозе, продуктом переработки которой является глюкоза.

Недостатком известного способа следует признать низкую активность ферментативного препарата.

Известен также способ (RU, патент 2167197 С12N 11/14, 2001) осахаривания крахмала в присутствии биокатализатора, включающего фермент глюкоамилазу и твердый носитель, при этом используют биокатализатор, в котором глюкоамилаза иммобилизована на поверхности зауглероженного носителя, предпочтительно алюмосиликата. Процесс проводят в непрерывном режиме с использованием неподвижного слоя биокатализатора при температуре не ниже 50°С.

Недостатком известного способа следует признать низкую активность используемого биокатализатора, что приводит к потере части целевого продукта.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого способа, состоит в разработке технологии получения сбраживаемых сахаров с использованием нового ферментативного препарата.

Технический результат, получаемый при реализации способа, состоит в обеспечении высокого выхода сбраживаемых сахаров - восстанавливающих сахаров (ВС) и глюкозы.

Для получения указанного технического результата предложено использовать способ биотехнологического получения сбраживаемых сахаров из лигноцеллюлозных материалов. При реализации предлагаемого способа проводят гидролиз предварительно обработанных целлюлозных или лигноцеллюлозных материалов ферментным препаратом, полученным культивированием штамма Penicillium funiculosum S-2006 на среде, содержащей в г/л: целлюлозу - 50-60, глюкозу - 10-30, KH₂PO₄ - 8÷12, (NH₄)₂SO₄ - 3÷7, MgSO₄×7H₂O - 0,2÷0,4, CaCl₂×2Н₂О - 0,2÷0,4, при 26-30°С и при поддержании рН в диапазоне 4,5-5,5 путем подачи кислоты или щелочи (предпочтительно, соляной кислоты или гидроксида аммония) при перемешивании и аэрации, причем гидролиз проводят при интенсивном перемешивании и при температуре 45-55°С в слабокислой среде, а количество ферментного препарата подбирают таким образом, чтобы активность по фильтровальной бумаге (АФБ) была 9÷11 ед. на 1 г сухого субстрата. Предпочтительно, чтобы рН реакционной среды составлял 5. Желательно, чтобы количество ферментативного препарата обеспечивало АФБ 10 ед. на 1 г сухого субстрата.

Для получения ферментативного препарата используют мутантный штамм Penicillium funiculosum S-2006 (полученный с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Pen. funiculosum BKM F-3661), имеющий следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки штамма

При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 36 мм на 7 сутки при росте при 25°С. Колонии плотные, ровные с выпуклым центром. Мицелий светлый, пушистый. Обратная сторона палево-красновато-оранжевая. Конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом на 7-е сутки имеют 27-30 мм в диаметре, складчатые, с ровным краем, поверхность шерстистая. Мицелий светлый, желтоватый. Обратная сторона - палево-оранжевая. Конидиогенез слабый.

Гриб не растет на среде с глицерином и на агаре Чапека при 5°С. При культивировании на агаре Чапека при 37°С колонии имеют 18 мм в диаметре, складчатые, средней плотности, обратная сторона буровато-красноватая.

Конидиогенез: кисточки бивертициллятные, метулы прижатые, гладкие (8-10×2,5-3,0). Фиалиды ацерозные (8-9×2,5-3,0), с короткой шейкой. Конидии эллиптические, мелкие (2,2×1,5-2,0), гладкие.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, α-глюкане, лихенине, пектине и галактоманнане. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз значительно снижена.

Полученный мутантный штамм по своим морфологическим признакам при росте на глюкозо-картофельном агаре, на агаре для споруляции (СМ-агаре) отличается от исходного штамма существенно сниженной интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор и окраской колонии (светло-зеленовато-желтые) с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах более медленным ростом на твердых средах, повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу целлюлаз и других, кроме целлюлазы, карбогидраз - бета-глюкозидаз (целлобиаз), бета-глюканаз, ксиланаз, ксилоглюканаз, амилаз, маннаназ.

С использованием вышеохарактеризованного штамма ферментативный препарат получают следующим образом.

Предпочтительно культивируют штамм Pen. funiculosum S-2006, на водной среде, содержащей в г/л: целлюлозу - 60, глюкозу - 30, КН₂PO₄ - 10, (NH₄)₂SO₄ - 5, MgSO₄×7H₂O - 0,3, CaCl₂×2Н₂O - 0,3 при 26-30°С при поддержании рН в диапазоне 4,5-5,5 путем подачи HCl или NH₄OH при перемешивании и аэрации, при этом культуральную жидкость, содержащую ферменты, отделяют через 120-144 часа после начала культивирования от грибной биомассы, подвергают ультрафильтрации, а ультрафильтрат высушивают с получением ферментативного препарата.

Оценку эффективности предлагаемого способа проводят, сравнивая полученный, как указано выше, ферментативный препарат с аналогичными препаратами, рекомендованными для проведения гидролиза лигноцеллюлозных материалов.

При этом были использованы следующие ферментативные материалы, реактивы и методики.

В работе были использованы коммерческие (промышленные) и лабораторные препараты целлюлаз, перечисленные ниже:

Ферментные препараты на основе грибов рода Pemcillium - препарат S-2006 (получен как указано выше), лабораторный препарат B1 (P. verruculosum), разработанный в Институте биотехнологии, г. Лейпциг, лабораторный препарат В40 (P.verruculosum), разработанный в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, препараты Cellulase 2000L, Cellulase, HK70, Beta-glucanase 200L (P. fumculosum) компании Erbslöh Geisenheim Getränketechnologie GmbH & Co. KG, Германия, препарат Rovabio Excel (P. fumculosum), компании Adisseo, Франция; ферментные препараты на основе грибов рода Trichoderma (Т. viride, Т. longibrachiatum): Целловиридин Г20Х (Т. longibrachiatum), компании OOO "Промфермент" (Россия), лабораторные препараты T. longibrachiatum TW-1, TW-307, разработанные в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, препарат Fibrilase HDL 160 (T. reesei), компании logen, Канада, препараты BioACE, Xylanase XL, ULTRA L-1000 компании Dyadic International, США (T.longibrachiatum), препарат Celluclast 1.5L (T. reesei) компании Novozymes, Дания.

В качестве субстратов для определения ферментативной активности используют: натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) средней вязкости, глюкуроноксилан из березы, ксилоглюкан тамаринда, □-глюкан из ячменя, n-НФ-β-D-глюкопиранозид производства фирмы "Sigma" (США); бумага хроматографическая №1 производства фирмы "Whatman" (Англия); микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) авицел РН 105 производства фирмы "Serva" (ФРГ).

В качестве целлюлозосодержащих материалов используют образцы древесины пихты, сосны, тополя, клена, пшеничной соломы, предварительно обработанных органозольвом или по методу парового взрыва. При паровом взрыве образцы древесины были сначала пропитаны 4,5% SO₂, выдержаны в течение 4,5 мин при 195°С и затем подвергнуты декомпрессии. Обработку органозольвом (50%-ный этанол, рН которого был доведен до 2,4 с помощью 10%-ной серной кислоты) проводили в течение 40 мин при 195°С под давлением 3,2 МПа. Кроме того, в качестве целлюлозосодержащих материалов используют свекловичный жом, отход целлюлозно-бумажного производства - коротковолокнистую целлюлозу, а также обрезки пергамента.

Активность целлюлаз по фильтровальной бумаге (АФБ) определяют стандартным методом [Ghose Т.К.Measurement of cellulase activity. Pure Appl. Chem., 1987, v.59, p.257-268] при 50°С и pH 4, 8, используя бумагу хроматографическую №1 производства фирмы "Whatman" (Англия) и динитросалициловый метод анализа ВС. Ферментативные активности по отношению к КМЦ, авицелу, -глюкану, ксилану и ксилоглюкану определяют по начальным скоростям образования ВС (за 5-10 мин ферментативной реакции) методом Шомоди-Нельсона [А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов, Учебное пособие, - М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156] из соответствующего субстрата (5 г/л) при рН 5,0 (0,1 М Na-ацетатный буфер) и 50°С (активность по авицелу определяли при 40°С).

Активность по отношению к n-нитрофенил-β-глюкозиду определяют при рН 5,0 и 40°С. Аликвоту (0,05 мл) запасного раствора субстрата (10 мМ) смешивают с 0,85 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, смесь предварительно прогревают при 40°С в течение 5 мин и далее начинают ферментативную реакцию внесением 0,1 мл предварительно разбавленного и подогретого таким же образом раствора фермента. Ровно через 10 мин инкубации раствора при 40°С реакцию останавливают, добавляют 0,5 мл 1 М раствора Na₂CO₃. Далее на спектрофотометре измеряют поглощение раствора при 400 нм против кюветы сравнения, в которой находился контрольный раствор субстрата, приготовленный точно так же, но в который вместо раствора фермента вносили 0,1 мл ацетатного буфера. Количество выделившегося n-нитрофенола рассчитывают, используя его коэффициент экстинкции (D₄₀₀=18300 М^-1 см^-1).

Во всех случаях за единицу активности принимают количество фермента, которое приводит к гидролизу 1 мкмоль гликозидных связей либо к образованию 1 мкмоль продукта (ВС или n-НФ) в 1 мин при указанных условиях реакции.

Удельные активности ферментных препаратов (в ед/мг белка) приведены в таблице.

ПрепаратИсточникАФБАвицелазаКМЦ-азаβ-глюканазаβ-глюкозидазаКсиланазаКсило-Глюканаза  50°С40°С50°С50°С40°С50°С50°СS-2005P.funiculosum1,920,8228,245,41,7032,320,1В1Penicillium0,270,3311,721,90,2023,622,6В40 0,310,5413,626,50,6415,115,0Cellulase 2000L 0,800,1015,418,41,2421,211,0Cellulase HK70 0,660,1118,922,81,1223,313,1Beta-Glucanase 200L 0,580,2920,920,91,1122,212,0Rovabio Excel 1,120,2524,840,82,2537,917,5BioACETrichoderma0,830,477,48,00,140,90,5ULTRA L-1000 0,480,198,58,80,141,80,8Xylanase XL 0,380,226,810,40,3730,210,7TW-1 1,670,7717,615,50,153,818,3TW-307 0,660,6718,413,90,168,84,5Целловиридин Г20Х 0,790,3518,412,00,2411,95,6Celluclast 1.5L 0,910,3614,016,70,192,12,1Fibrilase HDL 1,020,2620,418,30,651,51,5

Из данных таблицы очевидно, что наибольшую активность при гидролизе целлюлозосодержащих материалов проявляет ферментный препарат, предлагаемый для реализации способа.

Моделирование предлагаемого способа гидролиза лигноцеллюлозного материала с различными ферментными материалами проводят в термостатируемых при 45÷55°С ячейках, помещенных на качалку. В ячейки вносят навеску субстрата (предварительно обработанную паровым взрывом или органозольвом древесину лиственных или хвойных пород, предварительно обработанную паровым взрывом солому злаковых растений, свекловичный жом, отход целлюлозно-бумажного производства - коротковолокнистую целлюлозу, обрезки пергамента), 6,8 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0, и 1 мл раствора предварительно разбавленного ферментного препарата. Реакционную смесь перемешивают на качалке при частоте 250 колебаний/мин. Концентрация субстрата в реакционной смеси составляет 50 г/л (в пересчете на сухое вещество), а разбавление ферментного препарата подбирают таким образом, чтобы АФБ была 10 ед. на 1 г сухого субстрата. Через 12 ч гидролиза из реакционной смеси отбирают пробы (1 мл), центрифугируют 1 мин при 10000 об/мин и измеряют в супернатанте концентрацию ВС и глюкозы. За критерий гидролитической способности препаратов принимают выход глюкозы за 12 ч гидролиза нерастворимого субстрата при 50°С.

Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидазно-пероксидазным методом [Березин И.В., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, т.42, №9, с.1631-1636].

Согласно полученным экспериментальным данным при любом исходном сырье (древесина хвойных или лиственных пород, солома злаковых растений, свекловичный жом, целлюлозные отходы) наибольшее количество сбраживаемой в спирт глюкозы за 12 ч образовал ферментный препарат Penicillium funiculosum S-2006, предлагаемый для реализации способа. Он обеспечивал выход глюкозы на 15-50% глюкозы больше, чем коммерческие или лабораторные ферментные препараты Penicillium и коммерческие или лабораторные ферментные препараты Trichoderma.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности области биотехнологической переработки лигноцеллюлозных материалов. Способ включает обработку сырья ферментным препаратом. В качестве ферментного препарата используют препарат, полученный культивированием штамма Penicillium funiculosum S-2006 на среде, содержащей в г/л: целлюлозу - 50-60, глюкозу - 10-30, КН₂РО₄ - 8÷12, (NH₄)₂SO₄ - 3÷7, MgSO₄×7H₂O - 0,2÷0,4, CaCl₂×2H₂O - 0,2÷0,4 при 26-30°С при поддержании рН в диапазоне 4,5-5,5. Обработку проводят при интенсивном перемешивании и при температуре 45-55°С в слабокислой среде, а количество ферментного препарата подбирают таким образом, чтобы активность по фильтровальной бумаге была 9-11 ед. на 1 г сухого субстрата. Способ обеспечивает высокий выход сбраживаемых сахаров. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ биотехнологического получения сбраживаемых сахаров из лигноцеллюлозных материалов, включающий обработку сырья ферментным препаратом, отличающийся тем, что в качестве ферментного препарата используют препарат, полученный культивированием штамма Penicillium funiculosum S-2006 на среде, содержащей, г/л: целлюлозу - 50-60, глюкозу - 10-30, КН₂РО₄ - 8÷12, (NH₄)₂SO₄ - 3÷7, MgSO₄·7H₂O - 0,2÷0,4, CaCl₂·2Н₂О - 0,2÷0,4 при 26-30°С при поддержании рН в диапазоне 4,5-5,5, причем обработку проводят при интенсивном перемешивании и при температуре 45-55°С в слабокислой среде, а количество ферментного препарата подбирают таким образом, чтобы активность по фильтровальной бумаге была 9-11 ед. на 1 г сухого субстрата.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН реакционной среды составляет 5.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество ферментного препарата выбирают таким образом, чтобы оно обеспечивало активность по фильтровальной бумаге 10 ед. на 1 г сухого субстрата.