СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К КАРДИОВАСКУЛЯРНОМУ ЗАБОЛЕВАНИЮ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к новому способу обнаружения предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию у людей.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кардиоваскулярные заболевания, в частности артериальный и венозный тромбоз, занимают одно из первых мест среди причин смертности в развитых странах.

В развитии тромбоза участвуют как генетические, так и внешние факторы. Широкая распространенность тромбоза и известное воздействие среды (например, использование оральных контрацептивов) позволяет предположить, что предрасположенность к данному заболеванию обусловлена участием многих генов.

В самом деле, были обнаружены и описаны некоторые генетические дефекты, приводящие к увеличению риска развития тромбоза (Lane DA, Mannucci PM, Bauer KA, Bertina RM, Bochkov NP, Boulyjenkov V, Chandy M, Dahlback B, Ginter EK, Miletich JP, Rosendaal FR, Seligsohn U. Inherited Thrombophilia: Part 1. Thromb Haemost 1996; 76: 651-662).

Однако в целом имеется очень мало информации, касающейся относительной важности генетических факторов для тромботического риска населения. Кроме того, маловероятно, чтобы эти известные мутации, при их относительно низкой частоте, составляли главную причину риска тромбоза.

Недавно авторы данного изобретения изучали генетический компонент подверженности тромбозу и соответствующие фенотипы (Souto JC, Almasy L, Borrell M, Gari M, Marinez E, Mateo J, Stone WH, Blangero J, Fontcuberta J. Genetic determinants of hemostasis phenotypes in Spanish families, Circulation, 101: 1546-1551. 2000; Souto JC, Almasy L, Borrell M, Blanco-Vaca F, Mateo J, Soria JM, Coll I, Felices R, Stone W, Fontcuberta J, Blangero J. Genetic susceptibility to thrombosis and its relationship to physiological risk factors: The GAIT study. Am J Hum Genet 67: 1452-1459, 2000), при этом было отмечено, что уровни фактора XII показывают одну из самых высоких способностей к наследованию (67%) и существенную положительную генетическую корреляцию (0,351); это означает, что некоторые из генов, влияющих на вариацию этого физиологического фактора риска, также оказывают влияние на риск возникновения тромбоза.

С другой стороны, раннее диагностирование данного типа заболеваний представляет большой интерес особенно у тех людей, которые, несмотря на отсутствие болезни, принадлежат к группе риска из-за наличия у них некоторых генетических изменений, поскольку таким образом можно избежать вторичных осложнений, связанных с такими заболеваниями.

Однако недостаток сведений о генетических причинах, влияющих на развитие тромбоза, влечет за собой различные проблемы, когда необходимо поставить соответствующий диагноз для идентификации лиц с генетическим риском развития кардиоваскулярных заболеваний, в частности тромбоза, поскольку, как указано выше, это заболевание, в котором принимают участие несколько генов.

Задача данного изобретения состоит в решении проблем диагностики кардиоваскулярного заболевания путем создания способа, который дает возможность идентификации, по меньшей мере, одного аллельного варианта в локусе хромосомы 5, ограниченного маркерами D5S400 и D5S408, для идентификации лиц, подверженных генетическому фактору риска развития какого-либо кардиоваскулярного заболевания.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей данного изобретения является обнаружение, по меньшей мере, одного аллельного варианта в гене, который кодирует белок фактора XII, который был бы очень полезен для генетического диагностирования, поскольку гетерозиготные или гомозиготные по мутированной аллели лица имеют повышенную предрасположенность к кардиоваскулярным явлениям. Это существенное продвижение вперед особенно для профилактики упомянутых кардиоваскулярных заболеваний.

Данное изобретение относится к способу обнаружения присутствия, по меньшей мере, одного аллельного варианта у человека, при этом упомянутый способ включает идентификацию в генетическом материале выделенного биологического образца упомянутого человека аллельного варианта, состоящего в замене цитозина тимином в положении 46 относительно транскрипционного источника Фактора XII (46С/Т) в локусе хромосомы 5, ограниченном маркерами D5S400 и D5S408, при этом присутствие упомянутого аллельного варианта является показателем предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию.

Таким образом, данное изобретение относится к идентификации лиц, которые при отсутствии признаков заболевания, тем не менее, входят в группу риска из-за наличия у них, по меньшей мере, одного аллельного варианта в упомянутом локусе хромосомы, что делает их подверженными развитию кардиоваскулярного заболевания.

В одном из вариантов осуществления изобретения биологический образец, получаемый от человека, предпочтительно представляет собой кровь.

В данном изобретении выражение "генетический материал" относится к последовательности ДНК, выделяемой из биологического образца. Выделение ДНК из физиологического образца может быть проведено на основе любого из протоколов, известных в науке (например, описанного в документе Miller SA, Dykes DD, Polesky HF (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells (Простая методика высаливания для выделения ДНК из человеческих ядерных клеток). Nucleic Acid Res 16: 1215).

В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению обеспечивает возможность идентификации, по меньшей мере, одного аллельного варианта в гене, который кодирует белок фактора XII.

В данном изобретении выражение "аллельный вариант" относится к генетической вариации в последовательности ДНК, которая кодирует белок фактора XII, при этом упомянутая генетическая вариация включает патологию, потерю или приобретение некоторой функции. В частности, упомянутая генетическая вариация влияет на подверженность кардиоваскулярной патологии.

Последовательность гена, который кодирует белок фактора XII у людей, описана во многих банках данных, например в банке данных OMIM, в котором последовательность гена, который кодирует белок фактора XII, имеет номер доступа 234000.004.

Генетические маркеры D5S400 и D5S408 также описаны в нескольких банках данных, например, в Genome DataBank или в Data Bank of Human Genome. Упомянутые маркеры сосредоточены в положениях 168.576.667 bp (D5S400) и 180.015.997 bp (D5S408) хромосомы 5 (отсчет пар оснований (bp) от начала хромосомы 5).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения идентификация, по меньшей мере, одного аллельного варианта в генетическом материале биологического образца включает проведение перед идентификацией полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения специфического геномного фрагмента.

Обнаружение присутствия, по меньшей мере, одного аллельного варианта в амплифицированном фрагменте проводят с использованием любого из протоколов, известных в науке, например, путем ферментативного расщепления фрагмента ДНК, полученного путем ПЦР, любыми рестрикционными ферментами, что обеспечивает получение различных картин электрофоретических полос у нормальных индивидуумов, носителей гетерозиготы и носителей гомозиготы.

Данное изобретение также относится к использованию биологического образца, подозреваемого на наличие аллельного варианта (46С/Т) в локусе хромосомы 5, ограниченном маркерами D5S400 и D5S408, для выявления предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию, выражающемуся в тромботических явлениях.

Существует множество разновидностей кардиоваскулярных заболеваний, выражающихся в тромботических явлениях, например, острый инфаркт миокарда, ишемический инсульт, глубокий венозный тромбоз, эмболия легочной артерии и т.д.

Одно из преимуществ данного изобретения состоит в том, что оно не требует специального или сложного оборудования; в самом деле, используемое оборудование хорошо известно специалистам. Ключевой аспект данного изобретения состоит в обнаружении, по меньшей мере, одного аллельного варианта в локусе хромосомы 5, ограниченном маркерами D5S400 и D5S408, для определения того, существует ли предрасположенность к кардиоваскулярному заболеванию у лиц, у которых пока отсутствуют признаки такого заболевания.

Кроме того, при помощи способа по изобретению можно идентифицировать генетические факторы, обеспечивающие понимание молекулярных основ кардиоваскулярных заболеваний, в частности, включающих тромботические явления, которые являются ключевым аспектом разработки более эффективных способов профилактики и терапии.

Кроме того, идентификация одного или более аллельных вариантов в последовательности гена, кодирующего белок фактора XII, имеет определенные преимущества в отношении медицинского обслуживания, поскольку в случае, если индивидуум идентифицирован как имеющий аллельный вариант в гене, кодирующем белок фактора XII, и этот индивидуум пока не имеет патологии, может быть разработана превентивная и терапевтическая стратегия.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает возможность идентификации локусов гена, которые влияют на подверженность тромбозу, и их промежуточные фенотипы. Дополнительное преимущество заключается в том, что благодаря возможности диагноза в начальной стадии заболевания может быть снижена заболеваемость и смертность, связанная с тромбозом.

В настоящее время исследователи в области молекулярной генетики испытывают необходимость в выработке перечня всех генетических факторов, участвующих в развитии кардиоваскулярных явлений.

В идеале такой перечень позволит расширить понимание механизмов образования тромбов при различных внешних условиях и разработать стратегии профилактики и лечения, конкретизированные по отношению к генетическому профилю индивидуума (Holtzman NA, Marteau ТМ. Will genetics revolutionize medicine? N Engl J Med 2000 Julio13; 343(2): 141-4). Данное изобретение представляет собой важный шаг вперед в диагностике и профилактике кардиоваскулярных заболеваний.

Далее приведено описание примерного варианта осуществления настоящего изобретения. Данные примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объем данного изобретения.

ПРИМЕР

Ниже описан пример определения аллельного варианта в гене, кодирующем белок фактора XII.

Идентификация аллельного варианта в гене, кодирующем белок фактора XII

Сначала отбирают образцы крови у контрольных субъектов (250 здоровых индивидуумов) и у пациентов (250 индивидуумов, для которых необходимо провести диагностику). После отбора образцов крови выделяют ДНК с использованием любого известного стандартного протокола (Miller SA, Dykes DD, Polesky HF (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 16: 1215). При помощи ПЦР-технологии в стандартных условиях получают специфический геномный фрагмент для анализа.

Затем идентифицируют, по меньшей мере, один аллельный вариант в полученном фрагменте. Для этой цели может быть использован любой из протоколов, известных в науке, например прямое секвенирование амплифицированного фрагмента, расщепление рестрикционным ферментом (как описано выше) или специфическими гибридизационными зондами, меченными флуоресцентной меткой.

В частности, и в качестве иллюстрации, в гене, кодирующем белок фактора XII, определяют аллельный вариант, известный как 46 С/Т из-за его положения относительно стартовой точки транскрипции.

Диагноз основывают на анализе молекулы ДНК путем ПЦР-амплификации фрагмента генома из 369 пар оснований, который содержит нуклеотид 46 С/Т, и расщепления рестрикционным ферментом SfaNI, который узнает мутированную последовательность. Амплифицированный фрагмент мутированной аллели расщепляют SfaNI на фрагменты, длиной 247 и 122 (bp) (Kanaji Т, Okamura Т, Osaki К, Kuroiwa M, Shimoda К, Hamasaki N, Niho Y (1998)). Общий генетический полиморфизм (замещение С на Т в положении 46) в 5'-нетранслируемой области гена фактора коагуляции XII связан с низкой эффективностью трансляции и снижением уровня фактора XII в плазме (Blood 91: 2010-2014).

Амплификация путем ПЦР: фрагмент из 369 (bp)

Специфические олигонуклеотиды:

Олигонуклеотид 1: SEQ. ID NO: 1

Олигонуклеотид 2: SEQ. ID NO: 2

ПЦР-смесь (основная смесь Promega №М7502)

Основная смесь12,5 мклОлигонуклеотид12,5 мклОлигонуклеотид22,5 мклДНК4 мклВода3,5 мклКонечный объем:25 мкл

ПЦР-программа: Applied Biosystem PCR 9700

5 мин95°С1 мин95°С1 мин55°С×30 циклов1 мин72°С10 мин72°С

Обнаружение: расщепление ферментом SfaNI

Сначала размораживают реагенты, необходимые для расщепления рестрикционным ферментом SfaNI. Затем в пробирку добавляют следующие компоненты:

5 мкл продукта ПЦР (без масла)^*

0,1 мкл SfaNI^**

5 мкл буфера NEBuffer

0,5 мкл BSA (альбумина бычьей сыворотки)

Н₂О до конечного объема 50 мкл

^* от пациентов и контрольных индивидуумов, гетерозиготных и гомозиготных по нормальной аллели.

^** фермент должен постоянно находиться в ледяной бане.

Смесь перемешивают встряхиванием, центрифугируют при 14000 об/мин в течение 5 секунд и оставляют в печи при 37°С на ночь.

Затем реакцию останавливают при температуре 4°С и центрифугируют смесь при 14000 об/мин в течение 5 секунд.

РЕЗУЛЬТАТЫ

- Представление результатов:

Должен быть получен амплифицированный фрагмент из 369 bp.

Идентификацию полос расщепления ферментом SfaNI нормальных аллелей и несущих аллельный вариант 46 С/Т (мутированная аллель) проводят путем сравнения с картиной полос Phi-маркера:

 Величины полосНормальная аллельС369 (1 полоса)Мутированная аллельТ247/122 (2 полосы)

- Интерпретация результатов аллельного варианта 46С/Т:

Индивидуумы, у которых наблюдается лишь одна полоса из 369 пар оснований, являются гомозиготными по нормальной аллели, то есть они являются носителями двух С-аллелей (по одной на каждую из двух хромосом 5, в которой расположен ген, кодирующий белок фактора XII).

Индивидуумы, у которых наблюдается одна полоса из 369 пар оснований и еще две из 247/122 пар оснований, соответственно, являются гетерозиготными на нормальную и мутированную аллель, то есть они являются носителями С-аллели (нормальной) в одной из хромосом 5 и носителями Т-аллели (мутированной) в другой хромосоме 5.

Индивидуумы, у которых наблюдаются только две полосы, одна из 247 и вторая из 122 пар оснований (полоса из 369 пар оснований отсутствует), являются гомозиготными по мутированной аллели, то есть они являются носителями двух Т-аллелей (мутированных) по одной на каждую из двух хромосом 5, в которой расположен ген, кодирующий белок фактора XII.

Изобретение относится к медицине и касается способа обнаружения предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию. Сущность изобретения включает способ идентификации в генетическом материале выделенного биологического образца человека аллельного варианта, состоящего в замене цитозина тимином в положении 46 относительно транскрипционного источника Фактора XII (46С/Т) в локусе хромосомы 5, ограниченном маркерами D5S400 и D5S408, при этом присутствие упомянутого аллельного варианта является показателем предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию. Преимущество изобретения заключается в выявлении у человека предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию, что дает возможность разработать соответствующую профилактическую или терапевтическую стратегию. 2 н. и 2 з.п. ф-лы.

1. Способ обнаружения присутствия, по меньшей мере, одного аллельного варианта у человека, указывающего на предрасположенность к кардиоваскулярному заболеванию, включающий идентификацию в генетическом материале выделенного биологического образца упомянутого человека аллельного варианта, состоящего в замене цитозина тимином в положении 46 относительно стартовой точки транскрипции фактора коагуляции XII (46С/Т) в локусе хромосомы 5, ограниченном маркерами D5S400 и D5S408, присутствие которого является показателем предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой кровь.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед идентификацией проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для получения специфического геномного фрагмента.4. Применение ДНК, выделенной из биологического образца, подозреваемого на наличие аллельного варианта фактора коагуляции XII 46С/Т в локусе хромосомы 5, ограниченном маркерами D5S400 и D5S408, для выявления предрасположенности к кардиоваскулярному заболеванию, выражающемуся в тромботических явлениях, при помощи способа по любому из пп.1-3.