СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ R-БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) Российский патент 2013 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам изготовления диагностических препаратов, применяемых при серологических исследованиях в ветеринарии и может быть использовано в медицине.

Известен способ приготовления антигена для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза у животных, включающий получение бактериальной массы штамма В.abortus R-1096 и инактивацию ее путем гамма-облучения [SU 946039 А, 05.02.79 г.]. Однако антиген, полученный таким способом, используется только для постановки реакции агглютинации и реакции связывания комплемента.

Известен также способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана, их обработку додецилсульфатом натрия в 1% концентрации при 50-60°С в течение 30 минут, с последующей сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл штамма В.abortus 19, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацией, экстрагированием и отделением сенситина центрифугированием [RU 2283498 С1, 22.02.2005 г.].

Данный способ получения бруцеллезного антигена для РНГА при бруцеллезе не позволяет получить антиген для выявления в сыворотке крови R-гемагглютининов, т.к. для его изготовления используют штамм бруцелл в S-форме.

Техническим результатом изобретения является получение активного и специфичного R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для выявления в сыворотке крови R-бруцеллезных антител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Технический результат способа изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации достигается приготовлением формалинизированных эритроцитов барана, с последующей их сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы В.abortus 16/4, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование, отделение сенситина центрифугированием, воздействием на бактериальные клетки 0,5% концентрацией додецилсульфата натрия при температуре 68-70°С в течение 60 минут.

Способ осуществления. Трехсуточную агаровую культуру бруцелл вакцинного штамма В.abortus 16/4 смывают 12% раствором хлорида натрия, фильтруют и подвергают автоклавированию при 1 атм. (120°С) в течение 20-30 минут, доводят концентрацию бруцелл до 40-50 млрд м.к. в 1 мл 12% раствором NaCl. К бактериальной взвеси добавляют 0,5% додецилсульфата натрия, после чего ее нагревают в водяной бане при температуре 68-70°С в течение 60 минут, при периодическом перемешивании. Взвесь декантируют путем центрифугирования при 8-10 тыс об/мин в течение 60 минут, полученный экстракт используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Формалинизацию эритроцитов барана проводят по методу R.Weinbach (1958), при этом концентрация формальдегида в процессе обработки эритроцитов составляет 1,5%, соотношение фиксатора и эритроцитов 0,375:1. Полученную взвесь эритроцитов с формальдегидом переносят в термостат и формалинизируют при температуре 37-38°С в течение 18-20 часов. После окончания формалинизации эритроциты отмывают от избытка формалина 3 раза 10-кратным объемом физиологического раствора на центрифуге при 1000-1500 об/мин в течение 10-15 минут (Каральник Б.Н. Эритроцитарные диагностикумы. - М., Медицина. - 1976. - 164 с.).

В таблице 1 представлены результаты воздействия на бактериальную массу с целью извлечения сенситина разных концентраций додецилсульфата натрия.

Таблица 1 Влияние концентрации додецилсульфата натрия на активность и пецифичность R-бруцеллезного эритроцитарного антигена Концентрация додецилсульф ата натрия Количество антигена на 1 мл 5,0% взвеси эритроцитов Титр РИГА с R-бруцеллезной сывороткой Негативная сыворотка крупного рогатого скота с 1:50 Контроль с физиологическим раствором 0,1% 0,25 - - - 0,5 - - - 1 - - - 2 - - - 3 - - - 0,25% 0,25 - - - 0,5 - - - 1 1:100++++ - - 2 1:400++++ - - 3 1:800++++ - - 0,5% 0,25 1:1600++++ - - 0,5 1:3200++++ - - 1 1:6400++++ - - 2 1:12800++++ 1:100++++ - 3 1:25600++++ 1:200++++ ++++ 1,0% 0,25 1:25600++++ 1:400++++ ++++ 0,5 1:25600++++ 1:400++++ ++++ 1 1:25600++++ 1:400++++ ++++ 2 1:25600++++ 1:400++++ ++++ 3 1:25600++++ 1:400++++ ++++

Анализ данных таблицы 1 показывает, что оптимальной концентрацией детергента при изготовлении R-антигена является 0,5% додецилсульфата натрия, при этом специфичный эритроцитарный антиген с заданной активностью не ниже 1:3200 при титрации с R-бруцеллезной сывороткой можно получить при соотношении формалинизированных эритроцитов и сенситина 1:0,5. При применении 0,25% концентрации додецилсульфата в процессе извлечения сенситина диагностикум не обладает достаточной активностью. При использовании додецилсульфата натрия в концентрации 1,0% эритроцитарный диагностикум становится неспецифичным, получены положительные результаты с негативной сывороткой крупного рогатого скота в разведении 1:50 и выше и с физиологическим раствором.

Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят оптимальной дозой сенситина, которую определяют путем титрации его с использованием R-бруцеллезной агглютинирующей сыворотки. При титрации сенситина для сенсибилизации эритроцитов к 1 мл 5,0% взвеси эритроцитов добавляют его в количествах 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2; 3,0 мл. Результаты испытания специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результат испытания специфичности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена Сыворотки крови, подвергнутые исследованию Количество исследуемых проб Разведение сыворотки крови Результат исследования невакцинированный против бруцеллеза крупный рогатый скот из благополучных по бруцеллезу хозяйств 505 1:50 отрицательно здоровые кролики 20 1:10 отрицательно здоровые морские свинки 26 1:10 отрицательно кролики, гипериммунизированные вакцинным штаммом B.abortus 104 M(S-форма) 10 1:10 отрицательно крупный рогатый скот больной бруцеллезом из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств 79 1:50 отрицательно

Из представленных в таблице 2 данных следует, что предложенный способ позволяет получить специфичный R-бруцеллезный эритроцитарный антиген, т.к. позволяет получить отрицательные результаты РИГА у здоровых и сенсибилизированным бруцеллезным S-антигеном животных. Результаты испытания активности R-бруцеллезного антигена отражены в таблице 3.

Таблица 3 Результаты испытания активности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена № п/п Объект исследования Результаты исследования РНГА РА с единым антигеном (титр ME) РСК с единым антигеном (разведение сыворотки крови) 1 сыворотки крови кроликов, зараженных В.abortus 54-70 (R-форма) 1:2560 - - 2 1:2560 - - 3 1:2560 - - 4 1:3200 - - 5 1:200 - - 6 1:1600 - - 7 1:1600 - - 8 1:3200 - - 9 1:800 - - 10 1:100 - - 1 сыворотки крови крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82 (R S -форма) 1:200 - - 2 1:400 - - 3 1:1600 50МЕ+++ - 4 1:800 - - 5 1:400 - - 6 1:3200 - 1:10++ 7 1:800 - - 8 1:400 - - 9 1:200 - - 10 1:3200 100МЕ++ -

Из таблицы 3 следует, что R-бруцеллезный эритроцитарный антиген обладает активностью, так гемагглютинины в сыворотке крови кроликов, зараженных R-формой бруцелл, содержались в титре от 1:100 до 1:3200, в сыворотке крови крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82 от 1:200 до 1:3200.

Определение чувствительности R-бруцеллезного эритроцитарного антигена проводили при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В.abortus 82, в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах (таб. 4, 5).

Таблица 4 Результаты серологических исследований сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В.abortus 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах Срок исследования (сутки) № хозяйства Исследовано проб Реагировало в РНГА с R-антигеном РА+РСК с единым антигеном абс. % абс. % 30 1 49 34 69,4 3 6,1 2 198 171 86,4 43 21,7 60 1 196 106 54,1 6 3,1 90 1 189 130 68,8 11 5,8 120 1 199 60 30,1 3 1,5 180 1 198 30 15,2 6 3 210 1 191 22 11,5 6 3,1 ИТОГО:   1220 553 45,3 78 6,4

Обследование благополучного по бруцеллезу крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма В.abortus 82, показало, что с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена на протяжении 210 суток удалось обнаружить от 11,5 до 86,4% реагирующих животных.

Таблица 5 Результаты серологических исследований сыворотки крови крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82, в неблагополучных по бруцеллезу стадах Срок исследования после вакцинации (сутки) Количество голов Количество животных, реагирующих в: РА+РСК+РНГА+РИД с S-антигенами в высоких титрах РНГА с R-антигеном абс. % абс. % 60 539 31 5,8 25 80,6 90 504 16 3,2 15 93,7 120 471 7 1,5 7 100,0 Итого: 1514 54 3,6 47 87,0

Данные таблицы 5 показывают, что R-бруцеллезные антитела в сыворотке крови больных бруцеллезом животных, привитых вакциной из штамма В.abortus 82 (SR-форма), можно диагностировать с помощью R-бруцеллезного эритроцитарного антигена, изготовленного данным способом, в разные сроки после иммунизации животных.

Предлагаемый R-бруцеллезный эритроцитарный антиген обладает специфичностью и чувствительностью, его используют в лаборатории ГНУ ВНИИБТЖ при проведении контроля иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами, а также при оздоровлении неблагополучных по бруцеллезу хозяйств с целью сохранения от необоснованного убоя животных с поствакцинальными реакциями.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам получения R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Способ изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) включает изготовление формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизацию их сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием. При этом антиген извлекают из штамма В.abortus 16/4 воздействуя на бактериальные клетки 0,5% концентрацией додецилсульфата натрия при температуре 68-70°С в течение 60 минут. Изобретение позволяет получить диагностический препарат высокой эффективности для диагностики бруцеллеза животных. 5 табл., 1 пр.

Способ изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизацию их сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием, отличающийся тем, что антиген извлекают из R-штамма В.abortus 16/4, воздействуя на бактериальные клетки 0,5% концентрацией додецилсульфата натрия при температуре 68-70°С в течение 60 мин.