СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПОЛИМЕРНОГО ХЕЛИКОБАКТЕРНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/544 G01N33/531 

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано в медицине, в частности гастроэнтерологии, для быстрого неинвазивного выявления уровня суммарных антител в сыворотке крови при заболеваниях, ассоциированных с Helicobacter pylori (H. pylori).

В настоящее время поиски новых неинвазивных тестов в диагностике H. Pylori остаются открытыми. Самыми доступными и распространенными являются серологические методы диагностики, заключающиеся в определении хеликобактерных антител к иммуноглобулинам классов А, М, G.

Известен способ диагностики H. pylori в ИФА (см. статью А.А. Кишкун. «Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной H. pylori», журнал «Клиническая лабораторная диагностика», издательство Медицина, №8, 2002 г., стр.43), заключающийся в том, что в качестве антигена используют препарат, обработанный термической инактивацией или ультразвуковой дезинтеграцией с последующим определением уровней JgG и JgA - антител к H. pylori.

Однако известный способ может быть использован для эпидемиологических исследований и скрининга, а в клинической практике метод ИФА для диагностики инфекции малоэффективен, так как пациенту, предъявляющему гастроэнтерологические жалобы, как правило, необходимо проводить эндоскопию, брать биоптаты для указанного теста и проводить гистологические исследования.

Известен способ диагностики посредством рекомбинантной иммуноферментной тест-системы «Хелико Бест-антитела» (см. статью О.В.Решетниковой, С.А.Кругловича с соавт. «Цитотоксические штаммы Helicobacter pylori: диагностика, распространенность, клинические проявления», журнал «Новости «Вектор-Бест», №3, сентябрь 2003 г., стр.10-13; инструкцию по применению тест-системы D-3752, ЗАО «Вектор-Бест» г.Новосибирск), заключающийся в определении в сыворотке или плазме крови человека специфических иммуноглобулинов классов М, А, G к антигену CagA Helicobacter pylori за счет взаимодействия с рекомбинантным антигеном, иммобилизованном на поверхности лунок разборного планшета и входящим в состав конъюгата.

Недостатком известного диагностического теста является, во-первых, то, что он позволяет обнаружить антитела к цитотоксинассоциированному белку в сыворотке крови больных, хотя у серопозитивных лиц антитела к CagA-белку присутствуют только в 45-70% случаев. У инфицированных пациентов значительно чаще в сыворотках крови обнаруживают антитела к 12 и более антигенам Н. pylori.

При этом постановка реакции в одной лунке по оптической плотности дает только качественный показатель на присутствие инфекции Н. pylori в форме «да - нет», что делает тест-систему неэффективной при постановке диагноза и для контроля на ранних этапах эрадикационной терапии.

Кроме того, для проведения ИФА требуются дорогостоящие реагенты, аппаратурное оснащение и обучение персонала.

За прототип выбран способ определения в крови человека антител к Н. pylori (см. патент US 20030 1660027 AI (Sach, G, et al.) 04.09.2003 г.), заключающийся в том, что в качестве сенситина используют низкомолекулярные антигены (32, 30, 23 и 15 кДа), которые получают из бактериальной массы механическим способом в френч-прессе в три цикла, причем полученный лизат подвергают гель-сепарации, которую осуществляют в 7,5-16% SDS-трицин-градиентном геле, затем разделенные белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану.

Недостатком прототипа является невозможность с его помощью осуществлять диагностику и оценивать уровень противохеликобактерных антител у всех возрастных групп обследуемого населения ввиду того, что наиболее значимые для диагностики и мониторинга Н. pylori инфекционные антигены: cagA, vacA и iceA - не определяются антителами к антигенам с низкой молекулярной массой, поэтому нет картины количественного определения антител в крови больного к Н. pylori, что не позволяет эффективно использовать известную технологию для контроля эрадикационной терапии. Кроме того, низкомолекулярные антигены могут характеризовать наличие микробов Н. pylori, но не фиксировать патологические процессы, а недостаточная информативность не удовлетворяет клиницистов.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке экспресс-диагностикума, позволяющего количественно определять антитела к Н. pylori и эффективно применять для контроля эрадикационной терапии.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения хеликобактерного полимерного диагностикума, включающем получение клеточного лизата, используемого как сенситин с последующей иммобилизацией на различные носители, в качестве сенситина используют полный комплекс хеликобактерных антигенов в составе клеточного лизата, полученного путем двойного разрушения бактериальных клеток, во-первых, обработкой 1% раствором натрия дезоксихолата из расчета 0,5 мл раствора на 2,0 мл суспензии с концентрацией (5-7)·10¹⁰ мк/мл, с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в термостате при температуре 40°С в течение 2-х часов, во-вторых, проведением пяти циклов по 45 сек ультразвуковой дезинтеграции, затем полученную взвесь осаживают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 минут, при этом полученный клеточный лизат используют в качестве сенситина, который иммобилизируют на полимерный носитель с последующей его лиофилизацией.

Кроме того, в сенситине получают концентрацию белка в пределах 1,5-2 мг/мл с широким спектром иммуноглобулинов.

Способ осуществляется следующим образом.

Для проведения способа необходимы исходные материалы:

- референтный штамм Н. pylori NCTC 11637;

- среда элективная хеликобактерная СЭХ (разработана в Ростовском НИПЧИ, экспериментально-производственная серия находится на утверждении в ГИСК им. Л.П. Тарасевича);

- полимерный носитель - РП №979-00 от 20.06.2000 г.

Первоначально получают бактериальную массу. Для этого исходную культуру Н. pylori NCTC 11637 высевают на элективную питательную среду СЭХ (рН 7,6-7,8) и помещают в микроаэрофильные условия (5% кислорода, 5-10% углекислого газа, 85% азота) при температуре 37°С на 3-5 суток. Через 72 часа типичные по морфологии колонии диаметром от 0,5 до 2,5 мм идентифицируют по культуральным и биохимическим признакам. Выращенную бактериальную массу используют для приготовления клеточного лизата в качестве сенситина.

Во-вторых, из бактериальной массы готовят хеликобактерный антиген. К суспензии бактериальной массы добавляют 1% раствор натрия дезоксихолата из расчета 0,5 мл раствора к 2,0 мл суспензии с концентрацией (5-7)·10¹⁰ мк/мл, затем суспензию перемешивают на магнитной мешалке в термостате при температуре (40±1)°С в течение 2-х часов. Затем проводят пять циклов ультразвуковой дезинтеграции продолжительностью по 45 сек, на рабочей частоте 22±1,65 кГц с амплитудой колебаний на конце концентратора 12 мкм. Взвесь клеток осаждают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 мин, получая супернатант, который используют в качестве растворимого хеликобактерного антигена.

После этого в растворимом антигене по методу Лоури определяют концентрацию белка, который получили в пределах 1,5-2,0 мг/мл.

При этом исследование белкового спектра растворимого хеликобактерного антигена проводят в системе диск - электрофореза по методу Laemmly, последний подтвердил, что двойное разрушение клетки приводит к получению пула белков. Причем молекулярные массы белков, присутствующих в растворимом антигене, в целом соответствуют молекулярным массам белков, наиболее часто рассматриваемых в качестве основных антигенов Helicobacter pylori - CagA (125-130 кДа) VacA (87 кДа), флагеллины (FlaA - 56 кДа, FlaB - 57 кДа). HspB (54 кДа), HspA (13 кДа), уреаза (30 кДа). Оценку иммуногенных свойств осуществляют по методу Westen Blot.

Следующий этап в получении диагностикума заключается в иммобилизации растворимого антигена на носитель, последний представляет собой сферические полимерные частицы диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп.

100 мг упомянутого носителя, что соответствует 1,2 мл суспензии микросфер, помещают в центрифужный стакан и дважды отмывают карбонатным буферным раствором концентрацией 0,1 моль/л по 15 мл, pH 9,2 при центрифугировании 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 20°С. После этого отмытый носитель с 5 мл карбонатного буферного раствора концентрацией 0,1 моль/л переносят в колбу, соединяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке с бактериальным лизатом из расчета 300 мг/мл и перемешивают, оставляя для контакта в течение 120 мин при температуре 20°С, а затем 18-20 часов при 6±2°С. Для блокирования свободных альдегидных групп к суспензии носителя с растворимым антигеном добавляют 2,0 мл 0,5% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном перемешивании на мешалке в течение 120 мин при температуре 20°С.

После этого проводят отмывание диагностикума, для чего трижды по 10 мин отмывают 0,9% раствором хлорида натрия по 15 мл при температуре 20°С и центрифугируют при 3000 об/мин. Осадок препарата суспендируют в центрифужном стакане в 8 мл 0,1% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия, после чего определяют активность и специфичность антигенного диагностического препарата жидкого.

Заключительным этапом в получении диагностикума является лиофилизация, при которой осадок препарата доводят до 20 мл 3%-ной желатозно-сахарозной средой высушивания и разливают шприцем в ампулы по 1 мл. Лиофилизацию проводят в течение 23 часов при конечной температуре (22±2)°С.

Активность и специфичность диагностикума определяют в реакции агломерации объемной (РАО). Для ее проведения используют контрольную хеликобактерную кроличью сыворотку и гипериммунные сыворотки против возбудителей, ассоциированных с группой кишечных инфекций: лептоспирозная, поливалентная эшерихиозная, сальмонеллезная, шигеллезная, псевдотуберкулезная, кампилобакетриозная, холерная эльтор, кишечно-иерсиниозная, листериозная.

Постановка реакции агломерации объемной. В U-образные лунки планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл 1%-ного раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС). Для определения специфической активности в первую лунку пипеткой-дозатором (на 50-200 мкл А 200 mkl) вносят по 50 мкл контрольной хеликобактерной сыворотки в разведении 1:40 и делают последовательные двукратные разведения, получая конечные разведения: 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560. Из последней лунки 50 мкл удаляют.

Для определения специфичности в лунки каждого ряда вносят 50 мкл НКС. По 50 мкл гетерологичных сывороток в разведении 1:10 вносят в первую лунку каждого ряда и делают последовательные двукратные разведения до 1:2560. Из последней лунки 50 мкл удаляют.

Затем во все лунки добавляют пипеткой-капельницей по 1 капле (25 мкл) диагностикума в рабочем разведении. Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агломерации в две лунки вносят НКС (50 мкл) и диагностикум в рабочем разведении (25 мкл). После добавления диагностикума содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 мин и оставляют при температуре (20±2)°С на 1,5-2,0 часа.

За положительный результат принимают цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунок равномерным слоем, или агломерат с четко очерченными краями. В отрицательных случаях и в контроле образуется компактное колечко или «точка» в центре лунки.

Для определения чувствительности диагностикума использовали серии кроличьей иммунной сыворотки (контрольной) в объемной реакции агломерации (РАО), получая титры 1:640-1:1280. При этом для иммунизации кроликов применяют модифицированную схему с предварительным введением иммуномодулятора Т-активина. Показано, что контрольная хеликобактерная кроличья сыворотка в РАО дает положительную реакцию в разведении не менее чем 1:640.

После лиофильного высушивания активность диагностикума не менялась.

Пример 1.

Исследование сывороток крови больных с гастродуоденальной патологией в реакции агломерации объемной (РАО) с применением хеликобактерного антигенного полимерного диагностикума. Диагностический титр препарата 1:320 и выше.

Для постановки РАО проводят подготовку исследуемых сывороток. Исследуемую сыворотку человека перед определением уровня антител к Н. pylori разводят 0,9%-ным свежеприготовленным раствором хлорида натрия в 20 раз следующим образом: берут 0,1 мл исследуемой сыворотки и добавляют 1,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Разведенную сыворотку прогревают в течение (30±1) мин на водяной бане или инактиваторе при температуре (56±1)°С. После этого сыворотку оставляют при (20°2)°С на 10 мин и затем исследуют в РАО.

Сыворотку контрольную коммерческую «позитивную» к H. pylori разводят в 20 раз. Для этого к 9,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия добавляют 0,1 мл сыворотки. Разведенную контрольную сыворотку исследуют в РАО. Сыворотку контрольную «негативную» разводят в 20 раз.

Методика проведения РАО. В U-образные лунки планшета для иммунологических реакций разливают по 50 мкл 1%-ного раствора НКС пипеткой-капельницей из микротитратора типа Такачи. Исследуемые сыворотки в количестве 50 мкл вносят в две первые лунки рядов А, В, С, Д (таблица 1) пипеткой-дозатором (на 50-200 мкл А 200 ml) и, начиная со второй, готовят двукратные последовательные разведения. Затем в каждую лунку добавляют пипеткой-капельницей по 1 мл (25 мкл) суспензии диагностикума в рабочем разведении. После добавления диагностикума содержимое лунок перемешивают покачиванием планшета в течение 1 мин и оставляют при температуре (20±2)°С на 1,5-2,0 часа.

Для диагностикума на спонтанную агломерацию в 2-3 лунки вносят только НКС и диагностикум.

Для контроля качества диагностического препарата вместо исследуемой сыворотки используется сыворотка контрольная коммерческая - «позитивная» и сыворотка крови «негативная», не содержащая антител к Н. pylori (ряд Е, F) (таблица 1).

Учет результатов

За положительный результат (+) принимают цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунок равномерно, или агломерат, выстилающий дно лунок с четко очерченными краями.

В отрицательных случаях и в контроле образуется компактное колечко или «точка» в центре лунки.

Таким образом, из таблицы 1 видно:

- Ряд А - исследование сыворотки крови больного (1) с диагнозом: Язвенная болезнь 12-перстной кишки, подтвержденным гастродуоденоскопией. Положительная реакция (+), наблюдаемая в 1-8 лунках (цветной ярко-розовый агломерат), указывает на содержание антител к Н. pylori в титре 1:5120. Клинический диагноз подтверждается серологической диагностикой.

- Ряд В - сыворотка крови больного (2) с диагнозом: Язвенная болезнь желудка. Положительная реакция (+) в 1-6 лунках свидетельствует о высоком уровне антител - 1:1280, что согласуется с клиническим диагнозом.

- Ряд С - сыворотка крови больного (3) с диагнозом: Язвенная болезнь 12-перстной кишки. Положительная (+) РАО наблюдается по 8-ю лунку, что соответствует высокому уровню антител к Н. pylori 1:5120, совпадение клинического и серологического диагноза.

- Ряд Д - исследование сыворотки крови больного (4) с клиническим диагнозом: Хронический гастрит в стадии обострения. Положительная реакция (+) в 1-5 лунках, содержание антител в сыворотке крови 1:640 превышает диагностический титр 1:320.

- Ряд Е - контроль препарата с позитивной сывороткой 1:2560.

- Ряд F - контроль препарата с коммерческой «негативной» сывороткой.

- Ряды Е и F свидетельствуют о высокой активности и специфичности препарата.

Следовательно, разработанный диагностический препарат в РАО позволяет определять количественно уровень специфических антител у больных с гастродуоденальной патологией, обусловленной Н. pylori. Полученные результаты РАО совпадают с результатами, полученными с помощью эндоскопии и цитологических исследований, и открывают перспективу использования диагностикума в арсенале серологических неинвазивных методов исследования.

Пример 2.

В РАО с использованием антигенного полимерного хеликобактерного диагностикума исследовали сыворотки больных с клиническими диагнозами: Язвенная болезнь 12-перстной кишки (больной I) и хронический гастрит в стадии обострения (больной II) (таблица 2).

Сывороточные образцы этих же больных исследовали через 4-6 месяцев после проведенного курса антихеликобактерного лечения на наличие антител к Н. pylori в крови больного I - ряд В и больного П - ряд Д.

Сравнение уровня антител после лечения (ряды В и Д) с их исходным уровнем (ряды А и С) позволяют сделать выводы: до лечения у больного I титр антител составлял 1:2560 (ряд А), после проведенной терапии отмечается снижение титра антител до 1:320 (ряд В), во 2-м случае до лечения титр антител составлял 1:640 и после проведения специфической терапии наблюдается падение титра антител до 1:80 (ряд Д).

Полученные результаты РАО свидетельствуют о правильно выбранной схеме лечения больных I и II, эффективности проведенной терапии и позволяют предложить данную серологическую реакцию (РАО) и диагностический препарат для контроля за лечением хеликобактерной инфекции и оценки эрадикации, определяя в динамике уровень антител после окончания лечения по отношению к исходному.

Использование диагностикума, получаемого предложенным способом, дает возможность за счет двойного разрушения бактериальной клетки с последующей иммобилизацией на полимерные частицы, получать экспрессный инструмент для определения иммунного ответа организма к возбудителю хеликобактериоза.

Кроме того, антигенная характеристика сенситина соответствует основным известным антигенам Helicobacter pylori, что позволяет утверждать, что полученный диагностикум позволяет количественно определять уровень антител в динамике до и после лечения, что дает возможность осуществлять в клинике контроль на различных этапах эрадикационной терапии.

Таблица 1РядыРазведение сыворотки в лунках планшета1234567891:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120 А++++++++ В++++++-- С++++++++ Д+++++--- Е+++++++-(контроль)F--------(контроль)

Таблица 2РядыРазведение1:401:801:1601:3201:6401:1281:25601:5120А+++++++-В++++- --С+++++   Д++------

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии. Сущность способа заключается в том, что клеточный лизат получают путем двойного разрушения бактериальных клеток, во-первых, обработкой 1% раствором натрия дезоксихолата из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 мл суспензии с концентрацией (5-7)×10¹⁰ мк/мл, с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в термостате при температуре 40°С в течение 2-х часов, во-вторых, проведением пяти циклов по 45 сек ультразвуковой дезинтеграции, после чего полученную взвесь осаживают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 мин, при этом полученный клеточный лизат используют в качестве сенситина, который иммобилизируют на полимерный носитель с последующей его лиофилизацией. При этом в сенситине получают концентрацию белка в пределах 1,5-2 мг/м с широким спектром иммуноглобулинов. В качестве носителя сенситина могут быть использованы сферические полимерные частицы диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп, при этом иммобилизацию микросфер лизатом осуществляют при использовании 0,1 М карбонатного буферного раствора с рН 9,2. Блокирование свободных альдегидных групп проводят путем добавления к суспензии носителя с растворимым антигеном 2,0 мл 0,5% раствора желатозы на 0,9% растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном помешивании на мешалке в течение 120 мин при температуре 20°С. Использование способа позволяет количественно определить антитела к Н. pylori и эффективно применить для контроля эррадикационной терапии. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения хеликобактерного антигенного полимерного диагностикума, включающий получение клеточного лизата, выделение хеликобактерных антигенов с последующей иммобилизацией на носитель, отличающийся тем, что клеточный лизат получают путем двойного разрушения бактериальных клеток, во-первых, обработкой 1%-ным раствором натрия дезоксихолата из расчета 0,5 мл раствора на 0,2 мл суспензии с концентрацией (5-7)·10¹⁰ мк/мл, с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в термостате при температуре 40°С в течение 2 ч, во-вторых, проведением пяти циклов по 45 с ультразвуковой дезинтеграции, после чего полученную взвесь осаживают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 мин, при этом полученный клеточный лизат используют в качестве сенситина, который иммобилизируют на полимерный носитель с последующей его лиофилизацией.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в сенситине получают концентрацию белка в пределах 1,5-2 мг/мл с широким спектром иммуноглобулинов.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве носителя сенситина используют сферические полимерные частицы диаметром 1,5 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп, при этом иммобилизацию микросфер лизатом осуществляют при использовании 0,1 М карбонатного буферного раствора с рН 9,2.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что блокирование свободных альдегидных групп проводят путем добавления к суспензии носителя с растворимым антигеном 2,0 мл 0,5%-ного раствора желатозы на 0,9%-ном растворе хлорида натрия и оставляют при постоянном помешивании на мешалке в течение 120 мин при температуре 20°С.