Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума Российский патент 2023 года по МПК A61K39/10 G01N33/569 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и, в частности, к способу получения латексных диагностикумов для реакции агглютинации латекса.

Полимерные микросферы (латексные частицы) с адсорбированными на них молекулами антител или антигенов вступают в реакцию и агглютинируют с соответствующими антигенами микроорганизмов или антителами. Полимерные микросферы являются удобной и гибкой системой для разработки диагностических препаратов, применяемых в реакции агглютинации латекса (РАЛ). При выборе полимерных микросфер обычно учитывают диаметр и распределение частиц по размерам, состав, химические свойства поверхности (реакционные группы, функциональность, заряд) и другие более специфические свойства, такие как наличие хромофорных наполнителей (красителей), наночастиц металлов и их оксидов. Для латексной агглютинации чаще применяются микросферы (окрашенные, неокрашенные) с размером 0,2-1,0 мкм, активированные (для ковалентной сшивки) и неактивированные (для физической сорбции). Важным параметром является и состав полимерных микросфер. Обычно полимерные микросферы состоят из полиакролеина, полистирола, полиметилметакрилата. Эти материалы обладают различными физическими и оптическими свойствами, которые могут показывать преимущества или же накладывать некоторые ограничения их использования [1].

Для выявления антител против возбудителя бруцеллеза применяются различные серологические методы (реакция непрямой гемагглютинации - РИГА; иммуноферментный анализ - ИФА; реакция агглютинации латекса - РАЛ и т.д.), обладающие своими достоинствами и недостатками.

Известен способ получения R-бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для РИГА [2], заключающийся в приготовлении формалинизированных эритроцитов барана, с последующей их сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы В. abortus 16/4, ее смывом, инактивацией, экстрагированием, отделением сенситина центрифугированием, воздействием на бактериальные клетки додецилсульфатом натрия.

Недостатком данного способа является использование биологического сырья - эритроцитов барана, сложно поддающихся стандартизации, чьи параметры зависят от таких факторов, как пол, возраст животного, время взятия крови. Кроме того, для получения качественных эритроцитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты для стабилизации необходимо выдерживать в течение года.

Известен способ получения иммуноферментных тест-систем на основе моноклональных антител против S-ЛПС (S-липополисахарид) и R-ЛПС (R-липополисахарид), меченных пероксидазой хрена, для дифференциальной диагностики бруцеллеза [3].

Недостатком данного способа является сравнительная сложность получения тест-системы и постановки анализа, возможность ложноположительных результатов, необходимость использования химически чистой посуды. Помимо этого, обязательным условием является наличие в лаборатории фотометра для учета результатов.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения иммунодиагностикума на основе полистирольного латекса [4]. Для получения иммунодиагностикума в соответствии с предлагаемым изобретением к 2% суспензии сферических частиц полистирольного карбоксилированного латекса с иммобилизованным на их поверхности специфическим к данному заболеванию белком в 0,1 М глициновом буфере рН 8,2 (буфер) прибавляют равный объем раствора α-казеина (10 мг/мл) в буфере, приготовленного следующим образом: α-казеин растворяют в рассчитанном количестве буфера, прогревают 30 мин при 37°С, раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин. Оптимальная концентрация раствора α-казеина для насыщения свободных центров связывания - 0,4 мг/мл. Смесь латексной суспензии с раствором α-казеина тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего помещают в холодильник (4°С) на 24 ч. Описанный общий подход позволяет получать широкий спектр диагностикумов, отличающихся только специфическим белком, иммобилизованным на поверхности полимера, однако наличие казеина в составе препарата значительно сокращает срок его годности из-за возможности бактериального пророста. Недостатком данного способа является и то, что диагностикумы, полученные описанным методом, не являются достаточно чувствительными: максимальное разведение сыворотки, которое позволяет обнаружить данный препарат, составляет 1:320.

Цель изобретения - разработка способа получения активного и специфичного бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума для выявления антител в реакции агглютинации латекса.

Технический результат изобретения заключается в том, что полимерную суспензию центрифугируют, доводят 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 2% по сухому остатку полимера и смешивают в равных объемах с разрушенным на ультразвуковом дезинтеграторе антигеном бруцеллезного микроба из штамма Brucella (В.) abortus 19 ВА в концентрации 2×10⁹ м.к./мл на 12% растворе натрия хлорида, окрашенным бриллиантовым зеленым (0,004%) и генцианвиолетом (0,002%); инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч и 12-16 ч в холодильнике при температуре 4°С; дважды отмывают от несвязавшегося антигена 0,1 М фосфатно-солевым буфером, рН 7,2-7,4 путем центрифугирования при 5000 об/мин, в течение 10 мин; осадок ресуспендируют в 0,1% растворе желатина до 0,2% концентрации и стабилизируют формалином до 0,1%.

Для получения бруцеллезного латексного диагностикума для выявления антител в РАЛ использовали латекс для агглютинации (ООО «Диаэм», Москва) с размером частиц 0,8 мкм, содержанием полистирола по сухому остатку - 10% и додецилсульфата натрия - 0,01%. В качестве лиганда применяли взвесь бруцеллезного микроба В. abortus 19 ВА, выращенного на агаре Альбими при температуре (37±1)°С в течение (48±1) ч. Смыв бакмассы проводили 12% раствором натрия хлорида. Далее бакмассу прогревали при 100°С в течение 60 мин. После контроля общей и специфической стерильности бакмассы, разводили взвесь до концентрации 2×10⁹ м.к./мл 12% раствором натрия хлорида с 0,5% фенола. Добавляли анилиновые красители трифенилметанового ряда: бриллиантовый зеленый до 0,004% концентрации и генцианвиолет до 0,002% концентрации. Антиген разрушали на гомогенизаторе ультразвуковом (Sonicator Q125, Qsonica LLC) в течение 2 мин (частота 20 Гц).

Контроль чувствительности и специфичности разработанных экспериментальных серий препарата проводили с гомологичными и гетерологичными сыворотками. РАЛ ставили в U-образных (круглодонных) микропланшетах.

Для контроля чувствительности РАЛ использованы бруцеллезные сыворотки: иммунная кроличья сыворотка, полученная в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (экспериментальная серия) и сыворотка диагностическая поливалентная бруцеллезная сухая для реакции агглютинации (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).

Для контроля специфичности использованы следующие сыворотки: диагностическую холерную O1 адсорбированную сухую для РА (ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»); диагностическую сальмонеллезную адсорбированную О-поливалентную для РА (ЗАО «Эколаб»); диагностическую туляремийную сухую для РА (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора).

Постановку РАЛ (микрометод) осуществляли следующим образом: во все лунки (8 рядов) планшета вносили по 25 мкл разводящей жидкости твин-80 в разведении 1:25 тыс. Далее, в первые лунки рядов по 25 мкл гомологичных и гетерологичных сывороток в разведении 1:100, титровали с шагом 2, получая разведения в лунках от 1:200 до 1:12800, восьмые ряды - отрицательные контроли (в них сыворотки не вносили). Затем во все лунки капали по 25 мкл разработанного диагностикума бруцеллезного латексного. Чувствительность РАЛ составила 1:800-1:1600, что соответствует чувствительности бруцеллезного эритроцитарного диагностикума. При контроле специфичности установлено, что с сальмонеллезной, холерной сыворотками отсутствовала перекрестная реакция, а с туляремийной - наблюдалась перекрестная реакция до ¼ титра диагностикума, что соответствует требованиям нормативных документов, предъявляемых к данным видам диагностикумов. Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Разработка способа получения бруцеллезного латексного диагностикума для реакции агглютинации с бруцеллезным антигеном В. abortus 19 ВА в соотношении 1:2.

Для получения бруцеллезного антигенного латексного диагностикума использован полистирольный латекс для агглютинации с размером частиц 0,8 мкм. В качестве лиганда для иммобилизации применяли взвесь В. abortus 19 ВА в концентрации 2×10⁹ м.к./мл на 12% растворе натрия хлорида, инактивированную прогреванием при 100°С в течение 60 мин с добавлением 0,5% фенола и разрушенную на гомогенизаторе ультразвуковом в течение 2 мин. В качестве антисептиков и красителей использованы бриллиантовый зеленый - до 0,004%, генцианвиолет - до 0,002% концентрации. Латекс (2%) и антиген смешивали в объемном соотношении 1:2. Смесь инкубировали при перемешивании и температуре 37°С в течение 2 час и 12-16 час в холодильнике, при температуре 4°С. Далее центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин, дважды отмывали от несвязавшегося антигена 0,1 М ФСБ, рН 7,2-7,4 и последний осадок ресуспендировали в 0,1% растворе желатина до 0,2% концентрации. Для стабилизации и возможности хранения длительное время вносили формалин до 0,1% концентрации. При постановке РАЛ в микропланшете чувствительность составила 1:1600, при отсутствии перекрестных реакций с холерной и сальмонеллезной сыворотками и до ¼ титра диагностикума с туляремийной, что соответствует нормативной документации на данные препараты и может быть использовано в работе.

Пример 2. Разработка способа получения бруцеллезного латексного диагностикума для реакции агглютинации с бруцеллезным антигеном В. abortus 19 ВА в соотношении 1:1.

Получали диагностикум аналогично примеру 1, только с одним отличием -латекс иммобилизовали с бруцеллезным антигеном в соотношении 1:1. При этом чувствительность составила 1:1600.

Таким образом, целесообразней использовать приготовление диагностикума по примеру 2, исключая излишний перерасход антигена.

Используемая литература

1. G&T Polymer Technologies [Электронный ресурс]: URL http://gtpt.ru (дата обращения: 24.05.2021).

2. Способ изготовления R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА): пат. 2491553 Рос. Федерация. №2011140108/15 / Карлова М.Ю., Дегтяренко Л.В.; заявл. 03.10.2011; опубл. 27.08.2013, Бюл. №24. 7 с.

3. Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза: пат. 2490647 Рос. Федерация. №2009144376/10 / Юдин В.И., Козлов В.Е., Безгин В.М., Скляров О.Д.; заявл. 30.11.2009; опубл. 20.08.2013, Бюл. №23. 9 с.

4. Иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса: пат. 2231366 Рос. Федерация. №2002113997/14 / Леонова В.Б., Розенфельд М.А.; заявл. 29.05.2002; опубл. 27.06.2004, Бюл. №18. 8 с.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума, включающий смешивание в равных объемах 2% раствора полистирольного латекса и разрушенного на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 2 мин антигена бруцеллезного микроба из штамма Brucella (В.) abortus 19 ВА в концентрации 2×10⁹ м.к./мл на 12% растворе натрия хлорида, окрашенного бриллиантовым зеленым - 0,004%, генцианвиолетом - 0,002%; инкубирование 2 ч при 37°С и 12-16 ч в холодильнике при 4°С; затем дважды отмывают от несвязавшегося антигена 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин; осадок ресуспендируют в 0,1% растворе желатина до 0,2% концентрации с формалином до 0,1%. Изобретение обеспечивает расширения арсенала способов получения специфичного бруцеллезного латексного диагностикума для выявления антител в реакции агглютинации латекса. 2 пр.

Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума, отличающийся тем, что смешивают в равных объемах 2% раствор полистирольного латекса и разрушенный на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 2 мин антиген бруцеллезного микроба из штамма Brucella (В.) abortus 19 ВА в концентрации 2×10⁹ м.к./мл на 12% растворе натрия хлорида, окрашенный бриллиантовым зеленым - 0,004%, генцианвиолетом - 0,002%; инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч и 12-16 ч в холодильнике при температуре 4°С; дважды отмывают от несвязавшегося антигена 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин; осадок ресуспендируют в 0,1% растворе желатина до 0,2% концентрации с формалином до 0,1%.