СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПОСЛЕ ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/49 A61B5/145 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и онкологии. Может быть использовано при лечении больных острыми лейкозами.

Острые лейкозы занимают одно из первых мест по частоте встречаемости среди гемобластозов. Заболевание чаще развивается в молодом и трудоспособном возрасте и представляет собой социальную проблему. Возникновение инфекционных осложнений после проведенной химиотерапии у больных острыми лейкозами значительно ухудшает качество их жизни и влияет на исход заболевания.

Известен способ определения снижения устойчивости организма больных лейкозами к инфекции по соотношению основных морфологических типов лимфоцитов: рассчитывается индекс супрессии как отношение Т-тотальных лимфоцитов к сумме Т-супрессоров и Fc⁺-клеток и при величине этого индекса ниже 48% судят о снижении устойчивости организма больных лейкозами к инфекции [1].

Известный способ является недостаточно точным, так как в основе определения снижения устойчивости организма больных лейкозами к инфекции лежит определение фенотипического состава лимфоцитов крови, который не всегда отражает снижение функциональной активности иммунной системы. Недостатками известного способа являются также длительность исследования, трудоемкость выполнения методик, низкая чувствительность метода.

Задачей изобретения является повышение точности прогнозирования, сокращение времени исследования, повышение чувствительности метода. Предлагаемый способ позволяет точно оценить функциональное состояние иммунной системы больных острым лейкозом до начала химиотерапии и, следовательно, положительно повлиять на исход заболевания.

Сущность способа заключается в исследовании активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных острым лейкозом до проведения химиотерапии. Для этого из венозной крови больных выделяют лимфоциты, а затем с помощью биолюминесцентного метода определяют активность двух дегидрогеназ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФМДГ). О возможности возникновения инфекционных осложнений у больных судят по сочетанию величин активности этих дегидрогеназ в лимфоцитах крови. При сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 32,74 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 8,29 до 15,37 мкЕ прогнозируют развитие инфекционных осложнений у больных острыми лейкозами после химиотерапии, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 0,01 до 3,21 мкЕ прогнозируют отсутствие осложнений. Сочетание активности Г6ФДГ в пределах от 4,46 до 10,01 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 3,22 до 8,28 мкЕ характерно только для здоровых людей.

В настоящее время не вызывает сомнений факт, что в основе патогенеза лейкоза лежат нарушения иммунного гомеостаза. Во-первых, в основе патогенеза заболевания лежит малигнизация клеток иммунной системы. Во-вторых, появление бластных клеток отражает функциональную недостаточность иммунной системы, следствием чего и является развитие инфекционных осложнений. В обоих случаях наиболее ранние признаки нарушений, очевидно, следует искать на уровне метаболизма клетки, где начинается формирование ответной реакции на воздействие. Доказано, что в зависимости от уровня активности основных метаболических процессов в клетках иммунной системы наиболее информативными показателями внутриклеточного метаболизма являются дегидрогеназы [2]. Это позволяет использовать их в качестве показателей, характеризующих метаболическое и функциональное состояние клеток у больных острыми лейкозами в прогнозе инфекционных осложнений после химиотерапии.

Г6ФДГ (КФ 1.1.1.49) - осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата с помощью кофактора НАДФ. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла. Пентозофосфатный цикл имеет важное значение для системы внутриклеточного метаболизма. Он поставляет восстановленные НАДФН для реакций биосинтеза жирных кислот, холестерина и др. За счет пентозофосфатного цикла приблизительно на 50% покрывается потребность клеток в НАДФН. Кроме того, продуктами пентозофосфатного цикла являются также различные пентозофосфаты, которые необходимы для реакций синтеза нуклеиновых кислот и ряда коферментов.

НАДФМДГ (КФ 1.1.1.40) - НАДФ-зависимый фермент, осуществляет окисление малата до пирувата. Фермент локализуется в цитоплазматическом компартменте и является конкурентом для Г6ФДГ за кофактор. НАДФМДГ является ключевым ферментом липидного анаболизма. Кроме того, данная дегидрогеназа осуществляет шунтирующую реакцию для цикла трикарбоновых кислот, тем самым стимулируя интенсивность аэробных реакций.

Способ выполняют следующим образом. У больного с диагнозом острого лейкоза, независимо от стадии и типа заболевания, до проведения химиотерапии забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике А.Boyum. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например в камере Горяева. Чистота выхода лимфоцитов должна составлять не менее 97%. 1 млн. выделенных клеток используют для определения активности Г6ФДГ и НАДФМДГ одним из известных способов, например биолюминесцентным [3]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активность дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также pH среды для определяемых ферментов представлены в таблице.

ФерментСубстрат, мМКофактор, мМрН буфераГ6ФДГГлюкозо-6-фосфат - 1,5НАДФ - 0,0259,8НАДФМДГМалат - 7,5НАДФ - 0,3759,8

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДФН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М K⁺, Na⁺-фосфатном буфере с pH 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение ведут в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности, строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. Активность дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

где А - активность дегидрогеназы, Е на 10⁴ лимфоцитов (1Е=1 мкмоль/мин);

Δ[С] - разница концентраций НАДФН в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Данный метод опробован на 70 больных острым миелобластным лейкозом и 65 больных острым лимфобластным лейкозом, проходивших лечение в гематологическом отделении Краевой клинической больницы (ККБ) №1 г.Красноярска.

Клинический пример 1. Больная Я., 63 года. Поступила на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: Острый миелобластный лейкоз, 1 атака с первичной резистентностью к химиотерапии, некупируемая 1 атака. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит сильная слабость.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФМДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=27,89 мкЕ

НАДФМДГ=10,1 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФМДГ больной угрожает развитие инфекционных осложнений после химиотерапии. Больной назначена химиотерапия по программе "7+3". Через 10 дней у больной развилась панцитопения с агранулоцитозом. Состояние больной после проведенной терапии крайне тяжелое, гипертермия до 40°, ангина, вялотекущий сепсис. Назначена симптоматическая антибактериальная терапия.

Клинический пример 2. Больная Ш., 41 года. Поступила на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: Острый миелобластный лейкоз, некупируемая 1 атака, курс индукции ремиссии 2. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит выраженная слабость, повышенная утомляемость.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФМДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=0,01 мкЕ

НАДФМДГ=1,08 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФМДГ больной не угрожает развитие инфекционных осложнений после химиотерапии. Больной назначен курс химиотерапии по программе "7+3". Через 7 дней у больной развилась панцитопения с агранулоцитозом. Лечение перенесла хорошо, клиническое состояние стабильно на протяжении всей терапии.

Клинический пример 3. Больной Д., 33 года. Поступил на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: Острый лимфобластный лейкоз, опухолевая форма, 1 атака. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоят увеличенные лимфатические узлы в подмышечной, паховой областях, одышка.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФМДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=2,7 мкЕ

НАДФМДГ=0,07 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФМДГ больному не угрожает развитие инфекционных осложнений после химиотерапии. Больному назначен курс химиотерапии по программе Hi-Dexa. На 8 сутки у больного развился агранулоцитоз. Лечение больной перенес хорошо, осложнений во время терапии и после не было.

Клинический пример 4. Больной Б., 40 лет. Поступил на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: Острый лимфобластный лейкоз, опухолевая форма, 1 атака. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоит одышка и увеличенные подмышечные, подключичные, надключичные, шейные лимфатические узлы.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФМДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=26,5 мкЕ

НАДФМДГ=11,2 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФМДГ больному угрожает развитие инфекционных осложнений после химиотерапии. Больному назначен курс химиотерапии по программе Hi-Dexa. На 7 сутки у больного развился агранулоцитоз. Состояние больного после перенесенного лечения тяжелое, развилось инфекционное осложнение в виде правосторонней нижнедолевой пневмонии. Больному назначена симптоматическая антибактериальная терапия.

Таким образом, предложенный высокочувствительный способ позволяет повысить точность прогнозирования инфекционных осложнений после химиотерапии у больных острыми лейкозами и уменьшает длительность исследования. Это дает возможность своевременно, до проведения химиотерапии, откорректировать план и тактику лечения данной категории больных и улучшить результаты их реабилитации.

Источники информации.

1. Гусева С.А. "Способ определения снижения устойчивости организма больных лейкозами к инфекции" RU 2063041 С1 27.06.1996.

2. Грязева Н.И., Шурлыгина А.В., Вербицкая Л.В. и др. Изменение активности лактат- и сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови у самцов мышей с агрессивным и субмиссивным типами поведения // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2000. - Т.129, №1. - С.53-55.

3. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и онкологии, и может быть использовано при лечении больных острыми лейкозами. Для исследования из венозной крови больных до проведения химиотерапии выделяют лимфоциты, а затем с помощью биолюминесцентного метода определяют активность двух дегидрогеназ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФМДГ), и при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 32,74 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 8,29 до 15,37 мкЕ прогнозируют развитие инфекционных осложнений, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 0,01 до 3,21 мкЕ прогнозируют отсутствие осложнений. Сочетание активности Г6ФДГ в пределах от 4,46 до 10,01 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 3,22 до 8,28 мкЕ характерно только для здоровых людей. Использование данного высокочувствительного метода позволяет точно спрогнозировать развитие инфекционных осложнений после химиотерапии у больных острыми лейкозами и дает возможность до проведения химиотерапии откорректировать план и тактику лечения данной категории больных и положительно повлиять на исход заболевания. 1 табл.

Способ прогнозирования инфекционных осложнений после химиотерапии у больных острыми лейкозами путем исследования лимфоцитов крови до проведения химиотерапии, отличающийся тем, что определяют активность двух дегидрогеназ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (НАДФМДГ), а о возможности возникновения инфекционных осложнений у больных судят по сочетанию величин активности этих дегидрогеназ в лимфоцитах крови: при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 32,74 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 8,29 до 15,37 мкЕ прогнозируют развитие инфекционных осложнений, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 0,01 до 3,21 мкЕ прогнозируют отсутствие осложнений: сочетание активности Г6ФДГ в пределах от 4,46 до 10,01 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 3,22 до 8,28 мкЕ характерно только для здоровых людей.