Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в практической и научно-исследовательской работе для диагностики и изучения условно-патогенных микроорганизмов рода Desulfovibrio, а именно для диагностики Desulfovibrio spp. при нарушениях микробиоценоза желудочно-кишечного тракта.
Бактериальная флора желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) оказывает локальное действие, и в многочисленных исследованиях продемонстрирована патогенетическая связь состояния кишечного микробиоценоза не только с заболеваниями ЖКТ, но и с болезнями сердечно-сосудистой системы (атеросклероз, артериальная гипертензия), мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь, пиелонефрит), патологией гепатобилиарной системы (гепатиты, гепатозы, желчнокаменная болезнь). Нормальная микрофлора, являясь симбионтной, выполняет ряд значимых функций, имеющих важное значение для поддержания гомеостаза и жизнедеятельности макроорганизма [Тарасова Л.В., Трухан Д.И. Болезни кишечника. Клиника, диагностика и лечение. СПб.: СпецЛит; 2013; Ардатская М.Д., Бельмер С.В., Добрица В.П. и др. Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника: современное состояние проблемы, комплексная диагностика и лечебная коррекция. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2015;5:13-50].
В результате различных неблагоприятных воздействий на человека и развития разнообразных патологических состояний часто происходят количественные и качественные изменения нормальной микрофлоры кишечника. Это состояние, при котором нарушается подвижное равновесие кишечной микрофлоры, заселяющей в норме нестерильные полости и кожные покровы, и возникают качественные и количественные изменения кишечного микробиоценоза.
В соответствии с отраслевым стандартом ОСТ 91500.11.0004-2003 клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций, характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормальной микрофлоры, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части больных клиническими проявлениями, рассматривается как дисбактериоз кишечника [«ОСТ 91500.11.0004-2003. Отраслевой стандарт. Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника», утв. Приказом Минздрава России от 09.06.2003 №231)].
В настоящее время методика исследования кала на дисбактериоз не включает в себя посев исследуемого материала на питательную среду для сульфатредуцирующих бактерий. В нее входят посев на следующие питательные среды: агары для изоляции бактерий семейства Enterobacterales, желточно-солевой агар - для бактерий семейства Staphylococcaceae, энтерококковый агар - для культур рода Enterococcus spp., среда МРС с сорбиновой кислотой - для лактобактерий, Бифидум-среда - для бифидобактерий, среда Шедлера для выделения основной группы анаэробных бактерий и 5% кровяной агар - для бактерий рода Streptococcus spp., Clostridium spp., а также для других видов микроорганизмов, нуждающихся для своего роста в крови или гемолизирующих ее [Бочков И.А., Юрко Л.П., Шуралева С.А., Юдицкая Н.М., Лавренова Э.С., Плахтий И.В., Славнов Н.Н., Коновалова Т.А. Особенности микробной экологии толстой кишки у детей до 2 лет - 5, Эпидемиология и инфекционные болезни, стр. 29-33.].
С целью повышения эффективности выделения клостридий используют этаноловый шок [Borriello SP, Honour P. Simplified procedure for the routine isolation of Clostridium difficile from faeces. J Clin Pathol. 1981 Oct; 34(10): 1124-7. doi: 10.1136/jcp.34.10.1124. PMID: 7031097; PMCID: РМС494377]. Анаэробные бактерии культивируются в специальных системах типа ГазПак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США), работающих на принципе химической адсорбции кислорода. Идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляют традиционными методами, при необходимости используют метод матрично-активированной лазерной ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) с применением системы Microflex LT и программного обеспечения MALDI Biotyper Compass v.4.1.80 (Bruker Daltonics, Германия). Интерпретация полученных результатов проводится согласно ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника».
Недостатком данной методики является то, что при ее применении, бактерии рода Desulfovibrio не получают достаточно питательных веществ и не учитываются условия для их роста, они не диагностируются, хотя являются фактором риска для развития таких патологических состояний у человека, как железодефицитная анемия и когнитивные нарушения со стороны нервной системы.
Бактерии рода Desulfovibrio - это анаэробные грамотрицательные спиральные или изогнутые подвижные палочки, продуцирующие в процессе своей жизнедеятельности сероводород (H2S) и десульфовиридин, который при УФ-излучении флуоресцирует красным при щелочном рН и зеленым при кислотном рН [Machaca М, Bodean ML, Montaña S, García SD, Stecher D, Vay CA, Almuzara MN. Descripción de un caso de sepsis abdominal por Desulfovibrio desulfuricans [Description of a case of abdominal sepsis due to Desulfovibrio desulfuricans]. Rev Argent Microbiol. 2022 Jun 7:S0325-7541(22)00028-1. Spanish. doi: 10.1016/j.ram.2022.05.002. Epub ahead of print. PMID: 35688718; Hagiya H, Kimura K, Nishi I, Yamamoto N, Yoshida H, Akeda Y, Tomono K. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia: A case report and literature review. Anaerobe. 2018 Feb;49:112-115. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.12.013. Epub 2018 Jan 4. PMID: 29305996; Goldstein EJ, Citron DM, Peraino VA, Cross SA. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia and review of human Desulfovibrio infections. J Clin Microbiol. 2003 Jun;41(6):2752-4. doi: 10.1128/JCM.41.6.2752-2754.2003. PMID: 12791922; PMCID: РМС156571]. Бактерии рода Desulfovibrio spp.являются преобладающими представителями сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), в том числе в кишечном микробиоценозе человека.
Согласно опубликованным данным, сульфатредуцирующие бактерии колонизируют придонные отложения солоноватых озер, а также желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) млекопитающих, в том числе человека [Marquis TJ, Williams VJ, Banach DB. Septic arthritis caused by Desulfovibrio desulfuricans: A case report and review of the literature. Anaerobe. 2021 Aug;70:102407. doi: 10.1016/j.anaerobe.2021.102407. Epub 2021 Jun 18. PMID: 34153468; Hagiya H, Kimura K, Nishi I, Yamamoto N, Yoshida H, Akeda Y, Tomono K. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia: A case report and literature review. Anaerobe. 2018 Feb;49:112-115. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.12.013. Epub 2018 Jan 4. PMID: 29305996; Carli T, Diker KS, Eyigor A. Sulphate-reducing bacteria in bovine faeces. Lett Appl Microbiol. 1995 Oct;21(4):228-9. doi: 10.1111/j.l472-765x.l995.tb01047.x. PMID: 7576512; Nasreddine R, Argudin MA, Herpol M, Miendje Deyi VY, Dauby N. First case of Desulfovibrio desulfuricans bacteraemia successfully identified using MALDI-TOF MS. New Microbes New Infect. 2019 Oct 23;32:100614. doi: 10.1016/j.nmni.2019.100614. PMID: 31763046; PMCID: РМС6859274].
СРБ присутствуют в организме бессимптомно и могут быть условно-патогенными микроорганизмами, приводящими к интраабдоминальным инфекциям, а также вызывать обострение воспалительных болезней желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (болезнь Крона, язвенный колит, сидром разраженного кишечника), психических и когнитивных заболеваний (болезнь Паркинсона, расстройство аутистического спектра (РАС) и т.д.). В большинстве случаев при острой инфекции бактерии Desulfovibrio spp. вызывают абсцессы внутренних органов и бактериемию. Согласно модельному эксперименту на грызунах бактерии рода Desulfovibrio могут выступать одним из этиологических факторов развития железодефицитной анемии (ЖДА).
Патогенетические эффекты бактерий рода Desulfovibrio spp. на данный момент мало изучены и оптимальные алгоритмы лечения инфекций, вызванных Desulfovibrio spp., в настоящее время не определены. Многие лаборатории не проводят рутинное исследование по выявлению бактерий Desulfovibrio spp. в биоматериале из-за медленной скорости их роста (4-7 дней, в некоторых случаях 14 дней) и сложности в идентификации, особенно когда культура является частью полимикробного сообщества.
Согласно известным данным для жизнедеятельности бактерий рода Desulfovibrio необходимы 3 группы компонентов: доноры и акцепторы электронов, факторы роста. В группу доноров электронов относятся крахмал, сукцинат натрия, мальтоза, маннитол и ацетат натрия. В группу акцепторов электронов сульфат марганца, сульфат железа и тиогликонат натрия. Факторами роста считаются кровь (5%), гемин, Tween 80 и витамины В6, В12 и С [Chen YR, Zhou LZ, Fang ST, Long HY, Chen JY, Zhang GX. Isolation of Desulfovibrio spp.from human gut microbiota using a next-generation sequencing directed culture method. Lett Appl Microbiol. 2019 Jun; 68(6):553-561. doi: 10.1111/lam.l3149. Epub 2019 Apr 3. PMID: 30835854; Liu F, Li J, Wu F, Zheng H, Peng Q, Zhou H. Altered composition and function of intestinal microbiota in autism spectrum disorders: a systematic review. Transl Psychiatry. 2019 Jan 29; 9(1):43. doi: 10.1038/s41398-019-0389-6. PMID: 30696816; PMCID: РМС6351640].
Известны среды общего назначения, используемые для выращивания СРБ: Среда Sulphate API Agar w/o Sodium Lactate (API) [https://exodocientifica.com.br/_technical-data/M309.pdf], следующего состава:
дрожжевой экстракт - 1,000 г/л;
магния сульфат - 0,200 г/л;
аскорбиновая кислота - 0,100 г/л;
дикалийфосфат - 0,010 г/л;
железа аммония сульфат - 0,100 г/л;
натрия хлорид - 10,000 г/л;
агар - 14,000 г/л;
конечный рН - 7,4±0,2,
где необходимо растворить 25,41 смеси в 1000 мл дистиллированной воды, добавить 4 мл лактата натрия, далее нагреть до полного растворения ингредиентов, не доводя до кипения, среду разлить в пробирки и простерилизовать.
Известна питательная среда для Desulfovibrio с 1% NaCl [Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук - Обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»; Всероссийская коллекция микроорганизмов - ВКМ; Дополнительная информация; Питательные среды; №54; https://www.vkm.ru/rus/Catalogue.htm; Файл описания Питательных сред], содержащая:
K2HPO4 - 0,01 г;
NaCl - 10,0 г;
MgSO4 - 0,2 г;
лактат Na(40%) - 4,0 мл;
раствор соли Мора - 1,0 мл;
дрожжевой экстракт - 1,0 г;
аскорбиновая кислота - 0,1 г;
агар - 6,0 г;
дистиллированная вода - 1000,0 мл, при этом раствор соли Мора содержит:
Fe(NH4)2(SO4)2 × 6 H2O - 1,0 г
дистиллированная вода - 5,0 мл.
Стерилизуют растворы отдельно автоклавированием при 121°С 15 мин.
Также известна питательная среда для Desulfovibrio с лактатом [Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук - Обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»; Всероссийская коллекция микроорганизмов ВКМ; Дополнительная информация; Питательные среды; №92; https://www.vkm.ru/rus/Catalogue.htm; Файл описания Питательных сред], содержащая:
Раствор 1:
K2HPO4 - 0,5 г;
NH4Cl - 1,0 г;
CaCl2×6Н2О - 0,1 г;
MgSO4×7H2O - 2,0 г;
Na2SO4 - 1,0 г;
лактат Na - 5,0 г;
дрожжевой экстракт - 1,0 г;
резазурин - 0,0 1 г;
цистеин - 0.5 г;
дистиллированная вода 950,0 мл.
Раствор 2:
NaHCO3 - 4,0 г;
дистиллированная вода - 40,0 мл.
Раствор 3:
Na2S×9 H2O - 300,0 мг;
дистиллированная вода 6,0 мл.
Раствор 4:
FeSO4×7Н2О - 0,4 г;
дистиллированная вода - 10,0 мл. рН 6,8
Для приготовления среды все растворы стерилизуют отдельно автоклавированием при 121°С 15 мин. Раствор 1 перед стерилизацией доводят до кипения, продувая газовой смесью из 97% N2 и 3% Н2 и стерилизуют в атмосфере этой газовой смеси. Раствор 3 стерилизуют в атмосфере N2.
Для получения накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий применяют среды Таусона или Постгейта [https://www.bibliotekar.ru/2-7-78-biologiya-pochv/65.htm], имеющие следующий состав:
Среда Таусона (г/л): (NH4)2SO4 - 4,0, K2HPO4 - 0,5, MgS04X Х7Н20 - 1,0, соль Мора - 0,5, лактат кальция - 5,0. Иногда к среде добавляют дрожжевую воду (1 мл/100 мл среды).
Среда Постгейта (г/л): KH2PO4 - 0,5, NH4Cl - 1,0, CaSO4-2H2O - 1,0, MgS04-7H20 - 2,0, лактат натрия - 3,5, дрожжевой экстракт - 1,0, FeSO4-7H2O - 0,5, тиогликолят натрия-1,0, или аскорбиновая кислота - 1,0.
Приготовление питательных сред ВКМ и среды Постгейта подразумевает отдельное приготовление нескольких растворов среды и последующее их смешивание. Также вышеупомянутые среды отличает общий недостаток, который выражается в медленной скорости роста целевой бактерии, что усложняет их применение в рутинной работе.
В виду того, что существующие методы определения бактерий рода Desulfovibrio в биологических материалах для диагностических целей малоэффективны и трудозатратны, в основу изобретения положена задача создания способа первичной диагностики Desulfovibrio spp. у больных с нарушениями микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, позволяющего повысить качество микробиологических исследований, сократить их время проведения при снижении затрат, что, в свою очередь, приведет к снижению процента неадекватной антибактериальной терапии и повысит качество оказываемой медицинской помощи больным с нарушениями микробиоценоза ЖКТ.
Поставленная задача достигается за счет оптимизации порядка проведения микробиологического исследования образцов биологического материала, предпочтительно кала, на наличие бактерий рода Desulfovibrio spp., в том числе за счет применения в способе питательной среды, обеспечивающей достаточный рост бактерий и их накопление для проведения исследования.
Для реализации заявляемого способа отбирают образцы биологического материала, предпочтительно кал, готовят питательную среду для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., готовят суспензию биологического материала 1 г, который эмульгируется в 0,9% растворе хлорида натрия. Затем готовят ряд последовательных десятикратных разведений суспензии 101, 102,103,104, производят высев в упомянутую питательную среду по 100 мкл из разведений суспензии. После чего культуру инкубируют: создают анаэробные условия при помощи анаэростата и СО2 инкубатора (CO2 6%), при температуре 37°С в течение 120-170 часов. Рост культуры оценивают по почернению питательной среды черному осадку в жидкой питательной среде или росту колоний в толще агара на вторые или третьи сутки (48-72 часа). Идентификацию бактерий проводят следующими способами:
- просвечивют образцы при УФ, доводя рН среды до щелочной или кислотной;
- готовят мазки и окрашивают по Граму с последующим использованием метода световой микроскопии.
При этом, упомянутую питательную среду получают следующим способом: смешивают лактат натрия - 3,00 мл/л; гидролизат казеина - 0,01 г/л; кукурузный крахмал - 0,01 г/л; дегидратированный говяжий бульон - 0,15 г/л; витамин В1 - 0,10 г/л; витамин В2 - 0,15 г/л; витамин В6 - 0,30 г/л; витамин В3 - 0,75 г/л; витамин В9 - 0,05 г/л; витамин В5 - 0,35 г/л; витамин В7 - 0,19 г/л; витамин В12 - 0,10 г/л; сульфат магния - 1,00 г/л; глюкозу - 1,00 г/л; натрия хлорид - 0,10 г/л; гидрофосфат калия - 0,50 г/л; аммоний хлористый - 1,00 г/л; пиросульфит натрия - 0,50 г/л. Для получения питательной среды в твердой фазе (агаровой питательной среды) к указанным компонентам дополнительно добавляют агар - 9,0 г/л. Затем доводят общий объем полученной смеси до 1000 мл путем добавления дистиллированной воды, устанавливают рН 7,3±0,2 посредством добавления 0,1 н. раствора соляной кислоты либо 0,1 н. раствора гидроксида натрия, растворяют компоненты смеси посредством доведения ее до кипения. Затем полученную смесь остужают, смешивают с аскорбиновой кислотой - 0,10 г/л и железом сернокислым закисным - 0,50 г/л, стерилизуют в стеклянных стерилизованных бутылках автоклавированием под давлением 1,0 атм. при температуре 120,6°С в течение 15-30 мин.
Применение в заявленном способе упомянутой питательной среды обеспечивает достаточный рост бактерий рода Desulfovibrio spp., необходимый для микробиологического исследования образцов биологического материала и принятия диагностических решений при нарушениях микробиоценоза желудочно-кишечного тракта.
Заявляемое решение получено в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в рамках выполнения темы НИР «Клинико-патогенетическое обоснование и совершенствование терапевтических программ сохранения и восстановления микробиома человека при широко распространенных инфекционных заболеваний».
Сущность заявляемого решения поясняется следующими примерами: Пример №1. Получение питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp. в жидкой фазе.
Для приготовления используемой в заявляемом способе питательной среды на аналитических весах произвели навеску сухих компонентов в количестве, указанном в Таблице 1.
После чего смешали лактат натрия, гидролизат казеина, кукурузный крахмал, дегидратированный говяжий бульон, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В3, витамин В9, витамин В5, витамин В7, витамин В12, сульфат магния, глюкозу, натрия хлорид, гидрофосфат калия, аммоний хлористый, пиросульфит натрия. Затем добавили дистиллированную воду 1000 мл, установили рН 7,3 посредством добавления 0,1н раствора соляной кислоты.
Компоненты полученной смеси растворили, доведя ее до кипения, после чего в остывшую смесь добавили аскорбиновую кислоту, железо сернокислое закисное и перемешали.
Затем получившийся раствор разлили в стерильные стеклянные бутылки для стерилизации и провели автоклавирование под давлением 1,0 атм. при температуре 120,6°С в течение 15 мин. Полученная указанным способом питательная среда прозрачная, имела желтоватый цвет. Готовая питательная среда хранилась в холодильнике при температуре + 4-8°С 30 дней и использовалась по мере необходимости.
Пример 2. Получение питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp. в твердой фазе (агаровой питательной среды).
Для приготовления заявляемой питательной среды на аналитических весах произвели навеску сухих компонентов в количестве, указанном в Таблице 1.
После чего смешали лактат натрия, гидролизат казеина, кукурузный крахмал, дегидратированный говяжий бульон, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В3, витамин В9, витамин В5, витамин В7, витамин В12, сульфат магния, глюкозу, натрия хлорид, гидрофосфат калия, аммоний хлористый, пиросульфит натрия. К полученной смеси добавили агар - 9,0 г/л. Затем добавили дистиллированную воду 1000 мл, установили рН 7,4 посредством добавления 0,1 н. раствора гидроксида натрия.
Компоненты полученной смеси растворили, доведя ее до кипения, после чего в остывшую среду добавили аскорбиновую кислоту и железо сернокислое закисное и перемешали.
Затем получившийся раствор разлили в стерильные стеклянные бутылки для стерилизации и провели автоклавирование под давлением 1,0 атм. при температуре 120,6°С в течение 30 мин. Полученная указанным способом питательная среда имеет желтоватый цвет, слегка опалесцировала, Готовая питательная среда хранилась в холодильнике при температуре + 4-8°С в течение 30 дней и использовалась по мере необходимости.
Пример 3. Оценка роста целевой бактерии в питательной среде для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp.
Ростовые свойства питательной среды для культивирования сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio spp, приготовленной согласно заявляемому способу, выявляли на коллекционном штамме, в качестве которого был использован типовой штамм рода Desulfovibrio sp.из Всероссийской коллекции микроорганизмов (Пущино): Desulfovibrio desulfuricans sp.desulfuricans VKM В-1799 т.
Питательную среду, полученную способами, описанными в примерах 1 и 2 засевали коллекционным штаммом Desulfovibrio desulfuricans VKM В-1799 т, создавали анаэробные условия при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США) и ставили в термостат при 37°С (СО2 6%). Рост бактерий рода Desulfovibrio sp., находящихся в исследуемом материале, получили уже на вторые и третьи сутки (через 48-72 часа роста).
Рост культуры оценивали по почернению среды черному осадку в жидкой питательной среде или росту колоний в толще агара. Идентификацию бактерий проводили следующими способами:
- просвечивали образцы при УФ, доводя рН среды до щелочной или кислотной;
- готовили мазки и окрашивали по Граму с последующим использованием метода световой микроскопии.
Полученные результаты позволили идентифицировать культуру как Desulfovibrio spp.
Пример 4. Определение Desulfovibrio spp.в образце биологического материала.
С целью диагностики Desulfovibrio spp.в образце биологического материала -фекалии, отобранного у больного с подтвержденным нарушением микробиоценоза ЖКТ, приготовили суспензию биологического материала 1 г, эмульгировали в 0,9% растворе хлорида натрия. Из приготовленной суспензии готовили ряд последовательных десятикратных разведений - 101, 102, 103, 104. Данными разведениями, по 100 мкл, засевали на чашки Петри с питательными средами:
a) питательная среда, полученная способом, описанным в примере 1 - для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp.;
b) агар Эндо и Плоскирева - для изоляции бактерий семейства Enterobacterales;
c) желточно-солевой агар - для бактерий семейства Staphylococcaceae;
d) энтерококковый агар - для культур рода Enterococcus spp.;
e) среда МРС с сорбиновой кислотой - для лактобактерий;
f) Бифидум-среда - для бифидобактерий;
g) среда Шедлера для выделения основной группы анаэробных бактерий;
h) 5% кровяной агар - для бактерий рода Streptococcus spp., Clostridium spp., а также для других видов микроорганизмов, нуждающихся для своего роста в крови или гемолизирующих ее.
Питательные среды b-h применяли согласно инструкции производителя, с целью повышения эффективности выделения клостридий использовали этаноловый шок. Идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляют традиционными методами, при необходимости используют метод матрично-активированной лазерной ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) с применением системы Microflex LT и программного обеспечения MALDI Biotyper Compass v. 4.1.80 (Bruker Daltonics, Германия). Интерпретация полученных результатов проводится согласно ОСТ 91500.11.0004-2003.
Для роста культур бактерий рода Desulfovibrio spp.пробирки, содержащие питательную среду, полученную способом, описанным в примере 1, с разведениями суспензии поместили в анаэробные условия. Культуру инкубировали в течение 120 часов при 37°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США). Рост культуры бактерий рода Desulfovibrio spp.оценивали на вторые сутки (48 часов), результат регистрировали по почернению питательной среды. Идентификацию бактерий проводили следующими способами:
- просвечивали образцы при УФ, доводя рН среды до щелочной или кислотной;
- готовили мазки и окрашивают по Граму с последующим использованием метода световой микроскопии.
После определения вида микроорганизма производили пересчет количества его колоний на 1 г фекалий (КОЕ/г). Учет результатов проводили согласно ОСТ 91500.11.0004-2003.
При оценке результатов посева кала на дисбактериоз у данного пациента выявлено: отсутствие - бифидобактерий, лактобактерий, энтерококков, наличие кишечной палочки в титре 107, наличие бактерий рода Desulfovibrio spp.в титре 103. Наличие бактерий рода Desulfovibrio spp. в образце биологического материала пациента подтверждено ПЦР исследованием.
Пример 5. Определение Desulfovibrio spp. в образце биологического материала.
С целью диагностики Desulfovibrio spp.в образце биологического материала -фекалии, отобранного у больного с подтвержденным нарушением микробиоценоза ЖКТ, приготовили суспензию биологического материала 1 г, эмульгировали в 0,9% растворе хлорида натрия. Из приготовленной суспензии готовили ряд последовательных десятикратных разведений - 101, 102, 103, 104. Данными разведениями по 100 мкл засевали на чашки Петри с питательными средами:
a) питательная среда, полученная способом, описанным в примере 2 - для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp.;
b) агар Эндо и Плоскирева - для изоляции бактерий семейства Enterobacterales;
c) желточно-солевой агар - для бактерий семейства Staphylococcaceae;
d) энтерококковый агар - для культур рода Enterococcus spp.;
e) среда МРС с сорбиновой кислотой - для лактобактерий;
f) Бифидум-среда - для бифидобактерий;
g) среда Шедлера для выделения основной группы анаэробных бактерий;
h) 5% кровяной агар - для бактерий рода Streptococcus spp., Clostridium spp., а также для других видов микроорганизмов, нуждающихся для своего роста в крови или гемолизирующих ее.
Питательные среды b-h применяли согласно инструкции производителя, с целью повышения эффективности выделения клостридий использовали этаноловый шок. Идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляют традиционными методами, при необходимости используют метод матрично-активированной лазерной ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) с применением системы Microflex LT и программного обеспечения MALDI Biotyper Compass v. 4.1.80 (Bruker Daltonics, Германия). Интерпретация полученных результатов проводится согласно ОСТ 91500.11.0004-2003.
Для роста культур бактерий рода Desulfovibrio spp.чашки Петри, содержащие питательную среду, полученную способом, описанным в примере 2, с разведениями суспензии поместили в анаэробные условия. Культуру инкубировали в течение 170 часов при 37°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США). Рост культуры бактерий рода Desulfovibrio spp. оценивали на третьи сутки (72 часа), результат регистрировали по почернению питательной среды. Идентификацию бактерий проводили следующими способами:
- просвечивали образцы при УФ, доводя рН среды до щелочной или кислотной;
- готовили мазки и окрашивают по Граму с последующим использованием метода световой микроскопии.
После определения вида микроорганизма производили пересчет количества его колоний на 1 г фекалий (КОЕ/г). Учет результатов проводили согласно ОСТ 91500.11.0004-2003.
При оценке результатов посева кала на дисбактериоз у данного пациента выявлено наличие бифидобактерий в титре 109, лактобактерий титре 107, энтерококков в титре 105, кишечной палочки в титре 108, наличие бактерий рода Desulfovibrio spp.в титре 104. Наличие бактерий рода Desulfovibrio spp.в образце биологического материала пациента подтверждено ПЦР исследованием.
Пример 6. Определение Desulfovibrio spp.в образце биологического материала.
С целью диагностики Desulfovibrio spp.в образце биологического материала -фекалии, отобранного у больного с подтвержденным нарушением микробиоценоза ЖКТ, приготовили суспензию биологического материала 1 г, эмульгировали в 0,9% растворе хлорида натрия. Из приготовленной суспензии готовили ряд последовательных десятикратных разведений - 101, 102, 103, 104. Данными разведениями по 100 мкл засевали на чашки Петри с питательными средами:
a) питательная среда, полученная способом, описанным в примере 1 - для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp.;
b) агар Эндо и Плоскирева - для изоляции бактерий семейства Enterobacterales;
c) желточно-солевой агар - для бактерий семейства Staphylococcaceae;
d) энтерококковый агар - для культур рода Enterococcus spp.;
e) среда МРС с сорбиновой кислотой - для лактобактерий;
f) Бифидум-среда - для бифидобактерий;
g) среда Шедлера для выделения основной группы анаэробных бактерий;
h) 5% кровяной агар - для бактерий рода Streptococcus spp., Clostridium spp., а также для других видов микроорганизмов, нуждающихся для своего роста в крови или гемолизирующих ее.
Питательные среды b-h применяли согласно инструкции производителя, с целью повышения эффективности выделения клостридий использовали этаноловый шок. Идентификацию выделенных штаммов бактерий осуществляют традиционными методами, при необходимости используют метод матрично-активированной лазерной ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) с применением системы Microflex LT и программного обеспечения MALDI Biotyper Compass v. 4.1.80 (Bruker Daltonics, Германия). Интерпретация полученных результатов проводится согласно ОСТ 91500.11.0004-2003.
Для роста культур бактерий рода Desulfovibrio spp.пробирки, содержащие питательную среду, полученную способом, описанным в примере 1, с разведениями суспензии поместили в анаэробные условия. Культуру инкубировали в течение 170 часов при 37°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США). Рост культуры бактерий рода Desulfovibrio spp.оценивали на вторые и третьи сутки (48 часов и 72 часа), результат регистрировали по почернению питательной среды. Идентификацию бактерий проводили следующими способами:
- просвечивали образцы при УФ, доводя рН среды до щелочной или кислотной;
- готовили мазки и окрашивают по Граму с последующим использованием метода световой микроскопии.
После определения вида микроорганизма производили пересчет количества его колоний на 1 г фекалий (КОЕ/г). Учет результатов проводили согласно ОСТ 91500.11.0004-2003.
При оценке результатов посева кала на дисбактериоз у данного пациента выявлено наличие бифидобактерий в титре 109, лактобактерий титре 108, энтерококков в титре 105, кишечной палочки в титре 107. Бактерии рода Desulfovibrio spp. в данном образце биологического материала отсутствовали. Их отсутствие подтверждено ПЦР исследованием.
Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить качество диагностики Desulfovibrio spp. у больных с нарушениями микробиоценоза желудочно-кишечного тракта при снижении временных и трудовых затрат, в том числе в условиях полимикробного сообщества.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ определения показателя антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp. | 2023 |
|
RU2821994C1 |
| Питательная среда для культивирования сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio spp. и способ ее получения | 2023 |
|
RU2820701C1 |
| Жидкий симбиотик и способ его получения | 2022 |
|
RU2805957C1 |
| Способ приготовления аутопробиотика на основе анаэробного консорциума бактерий | 2018 |
|
RU2734896C2 |
| СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ АУТОШТАММОВ LACTOBACILLUS SPP. ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА | 2018 |
|
RU2675315C1 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ CAMPYLOBACTER JEJUNI ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ | 2022 |
|
RU2796348C1 |
| СПОСОБ КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА | 2009 |
|
RU2410031C1 |
| СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ БАКТЕРИЙ В СМЕШАННЫХ КУЛЬТУРАХ | 2004 |
|
RU2263148C1 |
| Дифференциально-селективная питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл сухая (Гектоеновый энтеро-агар) | 2023 |
|
RU2812423C1 |
| СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА ОТДЕЛЯЕМОГО ИЗ ПАРОДОНТАЛЬНЫХ КАРМАНОВ | 2022 |
|
RU2794355C1 |
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ диагностики Desulfovibrio spр. при нарушениях микробиоценоза желудочно-кишечного тракта. Способ включает отбор образца биологического материала, приготовление питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., приготовление суспензии биологического материала 1 г, приготовление десятикратных разведений суспензии биологического материала, высев по 100 мкл разведений суспензии в питательную среду для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., инкубирование полученной смеси в анаэробных условиях в течение 120-170 часов при 37°С. Визуальную оценку роста культуры бактерий рода Desulfovibrio spp. производят по наличию или отсутствию почернения питательной среды, где наличие почернения свидетельствует о присутствии в образце биологического материала бактерий рода Desulfovibrio spр., а при отсутствии почернения питательной среды регистрируют результат как не содержащий бактерий рода Desulfovibrio spр. Изобретение обеспечивает повышение качества диагностики у больных с нарушениями микробиоценоза желудочно-кишечного тракта при снижении временных и трудовых затрат, в том числе в условиях полимикробного сообщества. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.
1. Способ диагностики Desulfovibrio spp. при нарушениях микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, включающий отбор образца биологического материала, приготовление питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., приготовление суспензии биологического материала 1 г, приготовление десятикратных разведений суспензии биологического материала, высев по 100 мкл разведений суспензии в питательную среду для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., инкубирование полученной смеси в анаэробных условиях в течение 120-170 часов при 37°С, визуальную оценку роста культуры бактерий рода Desulfovibrio spp. через 48-72 часов по наличию или отсутствию почернения питательной среды, где наличие почернения свидетельствует о присутствии в образце биологического материала бактерий рода Desulfovibrio spp., а при отсутствии почернения питательной среды регистрируют результат как не содержащий бактерий рода Desulfovibrio spp., при этом упомянутую питательную среду получают посредством последовательного проведения следующих этапов:
(i) смешивание лактата натрия - 3,00 мл/л; гидролизата казеина - 0,01 г/л; кукурузного крахмала - 0,01 г/л; дегидратированного говяжьего бульона - 0,15 г/л; витамина В1 - 0,10 г/л; витамина В2 - 0,15 г/л; витамина В6 - 0,30 г/л; витамина В3 - 0,75 г/л; витамина В9 - 0,05 г/л; витамина В5 - 0,35 г/л; витамина В7 - 0,19 г/л; витамина В12 - 0,10 г/л; сульфата магния - 1,00 г/л; глюкозы - 1,00 г/л; натрия хлорида - 0,10 г/л; гидрофосфата калия - 0,50 г/л; аммония хлористого - 1,00 г/л; пиросульфита натрия - 0,50 г/л;
(ii) доведение общего объема полученной на этапе (i) смеси до 1000 мл путем добавления дистиллированной воды;
(iii) установление рН 7,3±0,2 посредством добавления в смесь, полученную на стадии (ii), 0,1 н. раствора соляной кислоты либо 0,1 н. раствора гидроксида натрия;
(iv) растворение компонентов полученной на этапе (iii) смеси посредством доведения ее до кипения;
(v) смешивание остывшей смеси, полученной на этапе (iv), с аскорбиновой кислотой - 0,10 г/л и железом сернокислым закисным - 0,50 г/л в;
(vi) стерилизация полученной на этапе (v) смеси в стеклянных стерилизованных бутылках путем автоклавирования под давлением 1.0 атм. при температуре 120,6°С в течение 15-30 мин.
2. Способ по п. 1, при котором для получения питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp. в твердой фазе на этапе приготовления (i) дополнительно добавляют агар - 9,0 г/л.
3. Способ но п. 1, где для приготовления суспензии биологического материала образец такого биологического материала эмульгируют в 0,9% растворе хлорида натрия.
4. Способ по п. 1, при котором десятикратные разведения суспензии биологического материала готовят в концентрациях 101, 102, 103, 104.
| Куликова Н.Г | |||
| Выбрасывающий ячеистый аппарат для рядовых сеялок | 1922 |
|
SU21A1 |
