СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ IN VITRO Российский патент 2008 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение предназначено для использования в области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для получения оздоровленного посадочного материала (микроразмножения при оздоровлении растений), выведении новых сортов и получения биомассы (каллуса) растительного сырья для фармацевтической и косметической промышленности.

В настоящее время актуальным является получение биомассы (каллуса) растительного сырья для выведения новых сортов растений, придание им устойчивости к различным видам бактерий, грибов и вирусов, сорнякам, насекомым-вредителям и другим неблагоприятным факторам окружающей среды, а также для получения экстрактов биологически активных веществ из растительного сырья и сохранения видов исчезающих растений, занесенных в Красную книгу.

Наиболее широко распространенными способами получения биомассы (каллуса) для указанных целей являются биотехнологические способы роста культур клеток и тканей in vitro [1, 2, 3, 4]. Все известные способы получения биомассы in vitro предполагают изоляцию зон роста в виде различных эксплантов из исходного растения, стерилизацию их и помещение в стерильных условиях на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с заданным составом ростовых веществ. Для накопления биомассы (каллуса) обычно используются первичные экспланты в виде проростков семян, частей листьев и стеблей, пазушных и апикальных меристем и почек клубней или корнеплодов растений.

Общим недостатком всех известных способов является их низкая производительность (эффективность), обусловленная:

- низкой эффективностью стерилизации (менее 50%) исходного материала (эксплантов);

- малой долей эксплантов, образующих каллус (эффективность каллусообразования не более 30...40% от общего количества неинфицированных эксплантов);

- недостаточным приростом биомассы образовавшегося каллуса (не более 60% от исходной массы).

Перечисленные недостатки ограничивают возможность применения известных способов для промышленного производства.

В связи с этим возникает необходимость повышения эффективности способов получения биомассы in vitro на всех этапах осуществления процесса: стерилизация, каллусообразование и рост биомассы. Как правило, это осуществляют при помощи дополнительных воздействий на различных этапах реализации процесса (применение различных стерилизующих растворов, добавлением ростовых факторов каллусообразования, температурным воздействием и воздействием различных излучений).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения биомассы in vitro по патенту РФ 2222933 [5], принятый за прототип. Способ получения биомассы in vitro, по [5], включает заготовку эксплантов из проростков, тканей или клеток, их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых факторов каллусообразования, термостатирование при температуре 26±1 градус Цельсия и относительной влажности 70%.

На этапе роста биомассы в известном способе осуществляется воздействие посредством индуктора последовательностью однонаправленных импульсов магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл, периодом 5, 12 с, скважностью от 100 до 4500, причем апикальную часть экспланта ориентируют противоположно направлению вектора магнитной индукции, а число импульсов устанавливают от 10 до 100.

Способ позволяет увеличить количество образующейся биомассы in vitro. В этом случае рост биомассы происходит только на неинфицированных эксплантах, образовавших каллус.

При этом основные потери исходного материала из-за инфицирования и отсутствия каллусообразования не были устранены.

Таким образом, прототип не позволяет повысить производительность процесса и довести эффективность способа получения биомассы in vitro до промышленного применения.

В предлагаемом способе получения биомассы in vitro решается задача увеличения производительности процесса получения биомассы за счет повышения эффективности всех основных стадий этого процесса:

- стерилизации исходного материала (эксплантов) без применения химических дезинфицирующих растворов;

- увеличения способности неинфицированных эксплантов образовывать каллус;

- увеличения получаемой биомассы не только за счет увеличения прироста на каждом образовавшем каллус неинфицированном экспланте, но и за счет увеличения числа неинфицированных и образующих каллус первичных эксплантов.

Предлагаемый способ получения биомассы in vitro включает заготовку эксплантов из различных частей растений (проростков, тканей или клеток), их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых стимуляторов каллусообразования, термостатирование при температуре 26±1 градус Цельсия и относительной влажности 70%. Стерилизацию эксплантов осуществляют в дистиллированной воде воздействием на экспланты ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью 1...2 Вт/кв.см на рабочей частоте 22...44 кГц в течение 3...6 минут. После помещения эксплантов на питательную среду, на этапах каллусообразования и роста биомассы пробирки с эксплантами погружают в водную среду и осуществляют через нее воздействие ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью не менее 10...15 Вт/кв.см на частоте 22...44 кГц со стороны дна пробирок с периодичностью не реже 1 раза в сутки в течение не менее 6 минут на каждом этапе.

Сущность предлагаемого способа заключается:

- в рациональном (оптимальном по интенсивности и времени) воздействии на помещенные в стерильную воду экспланты ультразвуковыми колебаниями, обеспечивающими стерилизующий эффект за счет формирования и захлопывания в водной среде на поверхности эксплантов кавитационных пузырьков [6]. При этом происходит разрушение патогенных форм без применения каких-либо химических стерилизующих веществ;

- в рациональном (оптимальном по интенсивности и времени) воздействии ультразвуковыми колебаниями на экспланты, находящиеся в стерильных пробирках на питательной среде. УЗ колебания, распространяясь в водной среде, проникают через стенки пробирок и питательную среду к поверхности эксплантов. При воздействии ультразвуковых колебаний на экспланты, находящиеся в питательной среде, интенсифицируются процессы массообмена и проникновения питательной среды внутри эксплантов и растущей биомассы. Ускорение процессов массообмена [6] обеспечивает интенсификацию подвода питательной среды к поверхности экспланта и растущей биомассы, а звукокапиллярный эффект [6] обеспечивает эффективное проникновение питательной среды по капиллярам эксплантов и через поры к растущей биомассе.

Способ осуществляют следующим образом. Берется по 40 пробирок с питательной средой и эксплантами. Эксплантами являлись зародышевые листки проростков семян и пазушные почки растений гречихи, картофеля и сои.

Эффективность стерилизации (Э₁) определяют по количеству неинфицированных эксплантов после стерилизации (с) в процентах от исходного количества стерилизуемых эксплантов (х):

Эффективность каллусообразования (Э₂) определяют по количеству стерильных эксплантов, образовавших каллус в пробирках с питательной средой (k) в процентах, от исходного количества вводимых в культуру эксплантов (х):

Прирост биомассы определяют в граммах и процентах.

Прирост биомассы в граммах - это разница между конечным и начальным весом биомассы, образовавшейся за определенный промежуток времени.

Прирост биомассы в процентах - это разница между конечным и начальным весом биомассы за определенный промежуток времени, отнесенный к начальному весу каллуса в культивационной пробирке.

Результаты стерилизации эксплантов по способу, принятому за прототип (без ультразвука), и по предложенному способу представлены в таблице 1.

Таблица 1Результаты стерилизации эксплантовВариантИсходное количество эксплантов, шт.Количество неинфицированных эксплантов, шт.Эффективность стерилизации, %ГречихаПрототип301963,30Предложенный способ302790,00КартофельПрототип301963,30Предложенный способ302686,70СояПрототип402562,50Предложенный способ403177,50

Эффективность каллусообразования по предложенному способу представлена результатами эксперимента, приведенными в таблице 2.

Таблица 2
Результаты каллусообразования из эксплантовВариантИсходное количество эксплантов, %Количество пробирок с каллусом, %Эффективность каллусообразования, %ГречихаПрототип30516,70Предложенный способ301240,00КартофельПрототип501224,00Предложенный способ502142,00СояПрототип25832,00Предложенный способ311548,40

Результаты прироста биомассы представлены в таблицах 3, 4 и 5.

Таблица 3Прирост биомассы картофеляВариантНачальная масса каллуса, гКонечная масса каллуса, гПрирост биомассыАбсолютный, гСредний, гАбсолютный, %Средний, %1234567Прототип0,0350,0710,0360,036102,8657,690,0420,0800,03890,480,0530,0930,04075,470,0610,0900,02947,540,0670,0990,03247,760,0740,1080,03445,950,0830,1190,03643,370,0890,1260,03741,570,0940,1330,03941,490,0990,1390,04040,40Предложенный способ0,0430,1060,0630,061146,5198,540,0490,1140,065132,650,0510,1230,072141,180,0560,1090,05394,640,0620,1210,05995,160,0640,1300,066103,130,0770,1270,05064,940,0830,1450,06274,700,0910,1600,06975,820,0970,1520,05556,70

Таблица 4Прирост биомассы гречихиВариантНачальная масса каллуса, гКонечная масса каллуса, гПрирост биомассыАбсолютный, гСредний, гАбсолютный, %Средний, %1234567Прототип0,0550,1200,0650,077118,18136,290,0460,1090,063136,960,0380,1080,070184,210,0560,1540,098175,000,0520,0950,04382,690,0720,1790,107148,610,0780,1930,115147,440,0740,1790,105141,890,0440,0940,050113,640,0490,1050,056114,28Предложенный способ0,0770,2120,1350,103175,32176,530,0460,1320,086186,960,0630,1570,094149,200,0680,1960,128188,230,0560,1600,104185,710,0600,1700,110183,330,0520,1380,086165,380,0620,1700,108174,190,0470,1300,083176,590,0510,1430,092180,39

Таблица 5Прирост биомассы соиВариантНачальная масса каллуса, гКонечная масса каллуса, гПрирост биомассыАбсолютный, гСредний, гАбсолютный, %Средний, %1234567Прототип0,1930,2220,0290,03515,1334,520,150,1780,02718,340,1900,2300,04021,560,1170,1510,03429,420,1110,1520,04137,780,0930,1350,04245,170,0740,1110,03750,290,0520,0820,03058,45Предложенный способ0,1140,1710,0570,09450,5787,400,1310,2130,08262,970,1170,2000,08371,550,1350,2360,10175,470,1000,1790,07979,930,0960,1750,07983,520,1270,2360,10986,610,1390,2700,13194,70

Таким образом, в результате реализации предлагаемого способа получения биомассы in vitro была решена проблема увеличения производительности процесса получения биомассы за счет повышения эффективности всех основных стадий этого процесса:

- увеличения эффективности стерилизации с 60% до 90% без применения химических стерилизаторов;

- увеличения в два раза способности неинфицированных эксплантов образовывать каллус;

- увеличения, практически в два раза, получаемой биомассы за счет увеличения прироста на каждом образовавшем каллус неинфицированном экспланте;

- многократное (не менее 10 раз) увеличение эффективности способа, то есть производительности получения конечного продукта - биомассы из заготовленного полевого исходного сырья (нестерилизованных эксплантов).

Технический результат предлагаемого решения выражается в том, что полученные результаты позволяют использовать предложенный способ для промышленного применения, например, при получении биомассы лекарственных растений для последующего экстрагирования или сельскохозяйственных растений для дальнейшего получения оздоровленных растений - регенерантов.

В настоящее время Бийским технологическим институтом Алтайского государственного технического университета ведется подготовка к серийному производству биомассы лекарственных и сельскохозяйственных растений на основе предложенного способа.

Список литературы

1. Патент РФ №2286053.

2. Патент РФ №2279212.

3. Патент РФ №2180165.

4. Патент РФ №2282352.

5. Патент РФ №2222933 (прототип).

6. Хмелев В.Н. Многофункциональные ультразвуковые аппараты и их применение в условиях малых производств, сельском хозяйстве и домашнем хозяйстве / В.Н.Хмелев, О.В.Попова. - Барнаул: изд. АлтГТУ, 1997, - 160 с.

Способ включает заготовку эксплантов, их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых стимуляторов, термостатирование при 26±1°С. Стерилизацию эксплантов осуществляют в дистиллированной воде воздействием ультразвуковых колебаний с интенсивностью 1...2 Вт/кв.см на рабочей частоте 22...44 кГц в течение 3...6 мин. На этапах каллусообразования и роста биомассы пробирки с эксплантами погружают в водную среду и осуществляют через нее воздействие ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью не менее 10...15 Вт/кв.см на частоте 22...44 кГц. Воздействие проводят со стороны дна пробирок с периодичностью не реже 1 раза в сутки в течение не менее 6 мин на каждом этапе. Прирост биомассы составляет 87,40-176,53%. Способ позволяет получить оздоровленный посадочный материал, увеличить эффективность стерилизации, увеличить способность неинфицированных эксплантов образовывать каллус. 5 табл.

Способ получения биомассы in vitro, включающий заготовку эксплантов из проростков, тканей или клеток, их стерилизацию, помещение эксплантов для каллусообразования и роста биомассы в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением ростовых стимуляторов каллусообразования, термостатирование при температуре 26±1°С и относительной влажности 70%, отличающийся тем, что стерилизацию эксплантов осуществляют в дистиллированной воде воздействием на экспланты ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью 1...2 Вт/см² на рабочей частоте 22...44 кГц в течение 3...6 мин, после помещения эксплантов на питательную среду на этапах каллусообразования и роста биомассы пробирки с эксплантами погружают в водную среду и осуществляют через нее воздействие ультразвуковыми колебаниями с интенсивностью не менее 10...15 Вт/см² на частоте 22...44 кГц со стороны дна пробирок с периодичностью не реже 1 раза в сутки в течение не менее 6 мин на каждом этапе.