ПРИМЕНЕНИЕ ДИОКСИДИНА В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО СРЕДСТВА Российский патент 2008 года по МПК A61K31/498 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в лечении злокачественных заболеваний различных органов, в частности опухолей желудочно-кишечного тракта.

Наиболее значимой проблемой в современной медицине является лечение злокачественных заболеваний различных органов и систем, частота появлений которых на протяжении ряда лет, к сожалению, лишь возрастает.

Большинство опухолей лечится хирургическим путем, что приносит гарантированный успех в лечении незапущенных стадий опухолевого процесса. Современные достижения радиотерапии и химиотерапии как самостоятельных методов лечения приводят к излечению лишь ограниченного числа нозологических форм злокачественных заболеваний, преимущественно на ранних стадиях. В большинстве наблюдений эти методы носят лишь вспомогательный характер и направлены на улучшение результатов хирургического лечения опухолей различных локализаций, а при инкурабельных распространенных опухолевых процессах, когда хирургическое лечение невозможно, целью использования радио- и химиотерапии является лишь пролонгация жизни.

Успехи химиотерапии в последние годы значительны в связи с открытием молекулярных и иммуногистохимических маркеров, позволяющих определить чувствительность химиопрепаратов к тому или иному виду опухоли. Идентификация маркеров, отвечающих за процессы ангиогенеза в растущей опухоли, предопределила понятие так называемой «таргетной» терапии злокачественных заболеваний, используемой параллельно с цитостатиками. Тем не менее, существенного улучшения результатов лечения злокачественных заболеваний при использовании химиотерапии добиться не удалось, что связано в первую очередь с недостаточной противоопухолевой активностью современных цитостатиков и высокой токсичностью, обусловленной воздействием на здоровые ткани. Немаловажную роль играет и дороговизна современных химиопрепаратов, что резко ограничивает их применение в широкой практике. В этой связи актуальным является поиск препаратов, обладающих высокой противовопухолевой активностью с толерантностью к здоровым тканям при невысокой себестоимости.

Выявлена противовопухолевая активность известного препарата «диоксидин», использующегося в качестве антибактериального средства в целях профилактики и лечения гнойно-воспалительных осложнений и заболеваний различных органов.

Диоксидин - 2,3 Ди(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксид - представляет собой зеленовато-желтый кристаллический порошок без запаха, малорастворимый в воде и спирте. Является антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Эффективен при инфекциях, вызванных вульгарным протеем, синегнойной палочкой, палочкой дизентерии и палочкой клебсиеллы (Фридлендера), сальмонеллами, стафилококками, стрептококками, патогенными анаэробами (в том числе возбудителями газовой гангрены). Действует на штаммы бактерий, устойчивые к другим химиотерапевтическим препаратам, включая антибиотики (М.Д.Машковский, Москва, 2001, том 2, с.298).

Противовопухолевая активность диоксидина установлена на основании следующих исследований:

Государственным научным центром колопроктологии Росздрава совместно с кафедрой химического факультета МГУ им. Ломоносова, Онкологическим научным центром РАМН и Государственным научно-исследовательским институтом органической химии и технологии проведены экспериментальные исследования с использованием методологии определения степени воздействия диоксидина и цисплатина на опухолевые и нормальные клетки в растворах.

Изучение влияния препаратов диоксидина и цисплатина на физиологическую активность и жизнеспособность клеток аденокарциномы человека линии Colo МТ

В опыте использовалась 5-суточная культура клеток аденокарциномы человека Colo МТ, которая инкубировалась с диоксидином и цисплатином при температуре, близкой к температуре тела человека 37°С, в течение 2-часового интервала времени.

Для оценки полученных результатов был подсчитан показатель доли погибших клеток, выраженный в процентах. Доля для клеточных проб с диоксидином и цисплатином расчитывалась относительно пробы культуры с физиологическим раствором, инкубируемой в тех же условиях.

В Таблице 1 приведены результаты подсчета клеток, сохранивших целостность структуры мембран как сразу после окончания 2-часового воздействия, так и после длительного 3-суточного интервала инкубации при температуре, оптимальной для жизнедеятельности клеточной культуры.

Таблица 1Результаты подсчета концентрации клеток после воздействия на клеточную культуру цисплатина и диоксидина при температуре 37°СДействующее веществоКонцентрация физиологически активных клеток в 1 млПроцент погибших клеток относительно контроля с физ. растворомПо истечении 2 часов инкубацииЦис-платин62000029Диоксидин52000040Хлорид натрия870000 Через 3 суток инкубации при 37°СЦисплатин14000080Диоксидин10000086Хлорид натрия700000 

Данные, представленные в Таблице 1, свидетельствуют о том, что инкубация клеток с исследуемыми концентрациями препаратов цис-платина и диоксидина приводит к снижению количества живых клеток. По истечении 2-часового интервала инкубации в исследуемом температурном интервале процент погибших клеток, высчитанный относительно контроля с физиологическим раствором, составляет при коинкубации с цис-платином - 29%, при коинкубации с диоксидином - 40%. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о патогенном воздействии на структуру мембран опухолевых клеток цис-платина и диоксидина. Данные, полученные по истечении 3 суток инкубации при 37°С, демонстрируют увеличение процента погибших клеток в зависимости от времени ко-инкубации с цитостатическими препаратами (для проб с цис-платином - до 80%, для проб с диоксидином - до 86% относительно проб с физиологическим раствором).

В Таблице 2 приведены данные, полученные в результате МТТ-теста, позволяющего оценить ферментативную активность митохондрий клеток. Результаты приведены в виде показателей оптической плотности, снятой при длине волны 560 нм, являющихся прямо пропорциональным показателем ферментативной активности.

Таблица 2Результаты, полученные в МТТ-тесте при воздействии на клеточную культуру цисплатина и диоксидинаДействующее веществоОптическая плотностьПроцент погибших клеток относительно контроля с физ. растворомПо истечении 2 часов инкубацииЦисплатин0.32038Диоксидин0.21758Хлорид натрия0.516 Через 3 суток инкубации при 37°СЦисплатин0.18163Диоксидин0.13273Хлорид натрия0.488 

Данные, приведенные в Таблице 2, свидетельствуют о негативном воздействии на клеточный метаболизм инкубации клеток с диоксидином и цис-платином. Доля погибших клеток, высчитанная относительно проб, инкубированных с физиологическим раствором, повышается при совместной инкубации с цис-платином - до 38%, с диоксидином - до 58%, что подтверждает выраженное цитотоксическое действие, оказываемое на опухолевые клетки растворами цис-платина (конечная концентрация 1.65·10^-4 М) и диоксидина (0.1% раствор). Величина цитотоксического эффекта тем больше, чем длиннее период совместной инкубации клеток с препаратами. Так, после 2 часов воздействия раствора цис-платина концентрация живых клеток по сравнению с контролем снизилась до 62%, а по истечении 3 суток - до 37%. После инкубации с раствором диоксидина аналогичные показатели оказались более впечатляющими - 42% и 27% соответственно.

С целью изучения воздействия гипертермального фактора проведено исследование, направленное на изучение влияния препаратов диоксидина и цис-платина на физиологическую активность и жизнеспособность клеток аденокарциномы человека линии Colo МТ при различных режимах гипертермии.

В опыте использовалась 5-суточная культура клеток аденокарциномы человека Colo МТ, которую подвергали воздействию повышенных температур в течении 2-часового интервала времени. Контрольная проба в течение того же промежутка времени инкубировалась при температуре 37°С.

Для оценки полученных результатов был подсчитан показатель доли погибших клеток, выраженный в процентах. Доля в каждом опыте рассчитывалась в 2 вариантах: для клеточных проб с диоксидином и цис-платином относительно пробы культуры с физиологическим раствором, инкубируемой в тех же условиях, что и образцы с исследуемыми препаратами; и для проб, подвергавшихся гипертермии, доля высчитывалась относительно контрольных проб с вышеуказанными веществами, инкубированных при 37°С. Первый показатель дает возможность сравнить влияние изучаемых веществ при аналогичных условиях на состояние клеток, а второй демонстрирует суммарное влияние на состояние клеточной культуры опухолевых клеток тестируемых препаратов и повышенных температур.

Таблица 3Результаты подсчета концентрации клеток после воздействия на клеточную культуру 42 и 43°С (кл/мл)Температура инкубации, °СДействующее веществоКонцентрация физиологически активных клеток в 1 млПроцент погибших клетокотносительно контроля с физ. растворомотносительно пробы, инкубируемой при 37°СПо истечении 2 часов инкубации при повышенной температуре37Цисплатин62000029 Диоксидин52000040 Хлорид натрия870000  42Цисплатин630000220Диоксидин490000716Хлорид натрия810000 943Цисплатин65000026-5Диоксидин500000354Хлорид натрия770000 11Через 3 суток инкубации при 37°С37Цисплатин14000080 Диоксидин10000086 Хлорид натрия700000  42Цисплатин1200008114Диоксидин600009040Хлорид натрия620000 1143Цисплатин1000008329Диоксидин600009040Хлорид натрия580000 17

Данные, представленные в Таблице 3, свидетельствуют о том, что инкубация клеток с исследуемыми концентрациями препаратов цисплатина и диоксидина в условиях повышенных температур приводит к значительному снижению количества живых клеток. Повышение гипертермального воздействия до 42°С приводит к абсолютному повышению показателя доли погибших клеток относительно контроля с физиологическим раствором (для цис-платина - 22%, для диоксидина - 71% соответственно). Данные, полученные по истечении 3 суток инкубации при 37°С, демонстрируют увеличение процента погибших клеток в зависимости от времени коинкубации с цитостатическими препаратами (для проб с цис-платином - до 83%, для проб с диоксидином - до 90% относительно проб с физиологическим раствором), а также нарастание доли погибших клеток в зависимости от температурного воздействия.

Таблица 4Результаты, полученные в МТТ-тесте при воздействии на клеточную культуру 42 и 43°СТемпература инкубации, °СДействующее веществоОптическая плотностьПроцент погибших клетокотносительно контроля с физ. растворомотносительно пробы, инкубируемой при 37°СПо истечении 2 часов инкубации при повышенной температуре37Цисплатин0.32038 Диоксидин0.21758 Хлорид натрия0.516  42Цисплатин0.264363Диоксидин0.1905411Хлорид натрия0.413 2043Цисплатин0.2383652Диоксидин0.1456132Хлорид натрия0.372 28Через 3 суток термостатирования при 37°С37Цисплатин0.18163 Диоксидин0.13273 Хлорид натрия0.488  42Цисплатин0.19353-7Диоксидин0.1117315Хлорид натрия0.410 1643Цисплатин0.165598Диоксидин0.1057420Хлорид натрия0.402 18

Данные, приведенные в Таблице 4, свидетельствуют о негативном воздействии на клеточный метаболизм инкубации клеток с диоксидином и цисплатином, а также о прогрессирующем снижении активности ферментов при повышении температуры инкубации клеток.

Необходимо отметить, что цитотоксический эффект такого антибактериального препарата, как диоксидин, практически соответствует цитотоксическому эффекту такого распространенного препарата, как цисплатин.

Изучено влияние химиотерапии на жизнеспособность мононуклеарных клеток здорового донора с использованием МТТ-теста, позволяющего оценить сохраненную ферментативную активность митохондрий клеток. Результаты приведены в виде показателей оптической плотности, снятой при длине волны 540 нм, являющихся прямо пропорциональным показателем ферментативной активности.

Таблица 5Ферментативная активность МНК, полученные в МТТ-тестеДействующее веществоОптическая плотностьПроцент погибших клетокотносительно контроля с физиологическим растворомПо истечении 2 часов инкубации при температуре 37°СЦисплатин0.11661Диоксидин0.14452Хлорид натрия0.298 

Данные, приведенные в Таблице 5, свидетельствуют о негативном влиянии химиотерапевтического воздействия на мононуклеарные клетки, и особенно о преимущественном токсическом воздействии цисплатина по сравнению с диоксидином (при 37°С процент ферментативно неактивных клеток относительно контроля с физиологическим раствором составлял соответственно 61% и 52%).

Изучение влияния диоксидина, цисплатина, гипертермии на перевиваемость опухолевых клеток опухоли Эрлиха.

Культуру клеток опухоли Эрлиха получали из асцитической жидкости у мышей на 7 сутки после внутрибришинного введения клеток опухоли в дозе 500 тыс.клеток/мышь. Асцитическую жидкость центрифугировали при 1.5 тыс.об/мин и полученный осадок опухолевых клеток ресуспендировали в среде RPMI-1640. Производили подсчет концентрации клеток в 1 мл и исследовали жизнеспособность клеток при помощи метиленового синего. Клетки разливали в стерильные пластиковые флаконы («Costar»). Одна серия флаконов инкубировалась в течение 1 ч в термостате с повышенной температурой -37, 42, 43, 44, 45, 46, 47°С. Во 2-й и 3-й сериях опытов инкубации при отмеченных температурных режимах проводилась в присутствии диоксидина (10 мг/мл) и цисплатина (1.65·10³)M. По истечении указанного периода времени клетки вводили мышам подкожно. Каждая группа состояла из 6 мышей.

Оценку действия препарата на рост опухоли проводили по регистрации различий в скорости роста опухоли. Скорость роста опухоли оценивали по ее объему.

Расчет объема опухоли осуществляли по формуле:

V=ав² _{(усл.ед)}

Объем опухоли измеряли на 30 сутки после перевивки. Результаты исследований представлены в Таблице 6.

У мышей линии СВА при введении 500 тыс. клеток карциномы Эрлиха на 30 сутки после имплантации было отмечено, что диоксидин и цисплатин при инкубации в течение 1 часа с клетками опухоли Эрлиха предупреждали развитие опухолевых узлов при температуре, близкой к жизнедеятельности организма - 37°С, в то время как лишь гипертермальный фактор вызывал достоверное торможение опухолевого роста только после инкубации в течение 1 ч при температуре не менее 45°С.

Таблица 6Размер опухолевых узлов (усл. ед.) на 30 сутки после имплантации опухоли ЭрлихаРазмер опухоли Контрольная проба44454647Гипертермия3200±513078±39000Гипертермия + Диоксидин00000Гипертермия + Цисплатин00000

Следовательно, термическая обработка оказывает значимое цитостатическое действие на опухолевые клетки только при температуре не менее 45°С. Обработка в течение 1 ч опухолевых клеток цисплатином и диоксидином даже при 31°С полностью предупреждает развитие опухолевых узлов.

Исследование клеточного состава на поверхности операционного поля больных раком прямой кишки

Взятие проб мазков-отпечатков проводилось на последнем этапе оперативного вмешательства, после удаления опухолевых масс и промывки операционной полости 1% раствором диоксидина, перед накладыванием шва. Обезжиренное, стерильное предметное стекло однократно прижимали к поверхности париетального и висцерального листков брюшины, серозной оболочке кишечника, находящихся в границах операционной полости. Полученный таким образом мазок-отпечаток высушивали, фиксировали и окрашивали по Романовскому и по Фельгену. Окрашенный препарат изучался при увеличении ×1000 методом световой микроскопии. Результаты позволяли судить не только о качественном клеточном составе, но и о концентрации подозрительных клеток на поверхности операционного поля после удаления опухолевых масс и всех последующих обработок. Оставшиеся злокачественные клетки, являясь следствием диссиминации опухоли, могут приводить к рецидиву и распространению опухолевого процесса в организме. Согласно вышеприведенной схеме были исследованы мазки-отпечатки, полученные во время операций у 2 больных.

Больной Перебейнос, 65 л., рак прямой кишки T3N×MO : на поверхности мазка обнаружены эритроциты, детрит, а также малодифференцируемые крупные клетки, имеющие признаки опухолевого перерождения - многоядерность, вакуолизацию кариоплазмы и цитоплазмы, выраженную базофилию ядер и цитоплазмы, увеличенный ядерно-цитоплазматический коэффициент, преобладание РНК над ДНК. Таких подозрительных клеток на стекле было обнаружено 16. Исходя из того, что площадь мазка составляла 30×15 мм, можно высчитать примерную частоту встречаемости тестируемых клеток на поверхности операционного поля. Для данного, случая она составляла 3.6 клетки на 1 мм² поверхности.

Больной Быкович, 48 л, рак прямой кишки : на мазке, имеющем площадь ˜20×20 мм, при исследовании было обнаружено лишь незначительное количество эритроцитов.

Исследование клеточного состава 1% раствора диоксидина после промывания им операционной полости

Было проведено исследование клеточного состава жидкости, полученной после заключительного промывания брюшной полости 1% раствором диоксидина больных Перебейноса и Быковича. Жидкость центрифугировали в пластиковой пробирке объемом 50 мл при 20°С 600 g в течение 15 мин. После отбора супернатанта осадок ресуспензировали пипеткой, окрасили в соотношении 1:1 1% раствором трипанового синего и поместили для подсчета в камеру Горяева. В изучаемых пробах не было найдено ни одной целостной клетки. Исследование патологического материала проводилось через 2-3 ч после его получения. Вероятно, именно это обстоятельство привело к тому, что в обоих случаях за период времени, прошедший с момента отбора проб до ее исследования, раствор диоксидина лизировал все тканевые и бактериальные клетки и истинный клеточный состав жидкости остался нам неизвестен.

Таким образом, проведенными экспериментами показано, что антибактериальный препарат диоксидин, применяемый в клинической практике для обработки раневых и операционных поверхностей, проявляет такое же цитотоксическое действие на клетки аденокарциномы, как цисплатин, взятые в концентрациях: цисплатин 50 мг/кг, диоксидин 0.1% раствор. Время контакта - 90 мин; интервал температур 37-45°С.

О жизнеспособности клеток судили по содержанию активных клеток в исследуемой суспензии, подсчет которых производили в камере Горяева. Результаты свидетельствуют, что при концентрациях диоксидина 0.6-0.8% число активных клеток аденокарциномы снижается практически до нуля уже при 37°С и времени контакта 90 минут. При концентрации диоксидина выше 0.8% наблюдается уже полное разрушение клеток в течение короткого промежутка времени (5-10 мин).

С повышением температуры в присутствии диоксидина гибель активных клеток наступает раньше: при 44°С она наступает уже в присутствии 0.4% диоксидина

Параллельно в этих же пробах методом ЭПР-зондов смотрели изменение структурного состояния мембран клеток аденокарциномы. Выявлено, что с ростом концентрации диоксидина жесткость мембраны «S» растет и при концентрациях 0.15-0.20% график зависимости выходит на плато. Это говорит о том, что в мембране наступает необратимое нарушение жизнедеятельности отдельных элементов клетки.

С повышением температуры в присутствии диоксидина деструктивные превращения в клетке наступают раньше При концентрации диоксидина 0.8% кривая выходит на плато при 42°С, в то время как в его отсутствии - при 44°С.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что бактерицидный препарат диоксидин обладает достаточно выраженными противовопухолевыми свойствами, не уступающими, а даже несколько превосходящими аналогичные свойства цисплатина, в то же время с меньшими токсическими эффектами на здоровые клетки. Все вышеуказанное, равно как и низкая себестоимость препарата, во много раз меньшая в сравнении с современными цитостатиками, открывают препарат «Диоксидин» в качестве перспективного противоопухолевого средства.

Изобретение относится к медицине, онкологии и касается применения диоксидина - 2,3 Ди(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксида в качестве противоопухолевого средства. Впервые установлено, что антибактериальный препарат диоксидин обладает цитотоксическим действием на раковые клетки, без проявления токсических эффектов на здоровые клетки. Изобретение также обеспечивает усиление противоопухолевого эффекта гипертермии при ее сочетании с использованием диоксидина. 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Применение диоксидина - 2,3 ди(гидроксиметил)хиноксалин-1,4-диоксид в качестве противоопухолевого средства.2. Применение по п.1 в сочетании с гипертермией.