АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ 2-ГО СЕРОТИПА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/187 C12N7/00 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению аттенуированного штамма КК-262/С вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских и диагностических центрах при проведении вирусологических, молекулярно-генетических исследований и разработке диагностических и вакцинных препаратов при АЧС.

С этой целью используют вирулентные и аттенуированные штаммы вируса АЧС, размножающиеся в первичных культурах клеток костного мозга свиней (KMC) и лейкоцитов свиней (ЛС), а также в перевиваемых культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения (1).

С использованием реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд), предложенной для серологического типирования штаммов, установлено 8 серотипов вируса АЧС, отличающихся между собой в иммунной пробе, что обуславливает необходимость получения аттенуированных штаммов для каждой иммуногруппы (2).

За рубежом получены и охарактеризованы аттенуированные штаммы и варианты вируса АЧС: Хинде-169, Катанга-105, Мадейра-105 1-го серотипа и др., которые выращивают в первичных культурах клеток KMC или ЛС. Указанные штаммы характеризуются высокими реактогенностью и виремией, осложнениями, низкой иммуногенностью, что затрудняет их использование при разработке вакцинных препаратов.

Для устранения указанных недостатков используют перемежающиеся пассажи вируса в первичных и перевиваемых культурах клеток, методы селекции, основанные на иммуносорбции и отборе термочувствительных клонов и др. Полученные штаммы Катанга-350, ЛС-72, Кимаки-155 и др. характеризовались умеренной реактогенностью и виремией и защищали 60-70% иммунизированных животных на 21 сутки после контрольного заражения (КЗ) гомологичным вирулентным вирусом (3).

Наиболее близким аналогом предполагаемого изобретения является селекционированный во ВНИИВВиМ штамм КК-202, используемый для получения вируссодержащего сырья, который типируется в РЗГАд специфической референс-сывороткой 2-го иммуносеротпа, а по результатам генотипирования отнесен ко 2 генотипу.

Получение вируссодержащего сырья в стационарном монослое первичной культуры клеток KMC. С этой целью культуру клеток, выращенную в матрасах вместимостью 1,0 или 1,5 дм³, заражают штаммом КК-202 в дозе 0,01-0,001 ГАЕ₅₀/клетку. В качестве ростовой среды при выращивании вируса применяют среду 0,1% ГЛА или Игла MEM с 8,0-10,0% сыворотки крови свиней. Культивирование вируса проводят в течение 5-7 сут при температуре (37,0±0,5)°С. Титр вируса в вируссодержащем сырье составляет не менее 6,5-7,0 lg ГАЕ₅₀/см³.

Этот штамм обладает высокой реактогенностью, низкой иммуногенностью и наличием осложнений (угнетение, высокая температурная реакция и виремия, кровоизлияния в паренхиматозных органах и др.) у привитых животных, а также невозможностью использования роллерной технологии при получении вируссодержащего сырья, как более технологичной.

В перевиваемых линиях клеток почки и тестикул поросенка (ПП-66б, ППК, РК-15, ПТП) вирус не размножается.

Штамм КК-262/С 2-го серотипа вируса АЧС получен путем адаптации к культуре клеток ППК-66б штамма КК-202 в течение 50 пассажей и последующей селекции вируса методом предельных разведений в этой культуре клеток и культуре клеток KMC.

Штамм КК-262/С 2-го серотипа депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, инв. №1831.

Аттенуированный штамм КК-262/С вируса АЧС обладает следующими свойствами.

Культуральные свойства. Размножается в перевиваемой культуре клеток ППК-66б, выращенной стационарным (матрасы) или роллерным способом (роллерные бутыли) с характерными для вируса АЧС цитоплазматическими изменениями с последующей деструкцией монослоя. При этом он сохраняет способность размножаться в культуре клеток KMC и ЛС, вызывая в них выраженную гемадсорбцию и последующий лизис клеток, что дает возможность использовать эти культуры клеток для определения инфекционной активности вируса. Титр вируса, выращенного в культуре клеток ППК-66б при стационарном и роллерном способах культивирования, достигает 7,0-7,5 lg ГАЕ₅₀/см³.

Антигенные свойства. При внутримышечном введении свиньям штамм вызывает образование комплемент связывающих, преципитирующих и ЗГАд-антител.

Безвредность. Безвреден для свиней при внутримышечном введении в максимальной (10^7,0-10^7,5ГАЕ₅₀) дозе. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) является не патогенным.

Контагиозность и реверсибельность. Вирус не передается при совместном содержании от привитых интактным свиньям.

Не восстанавливает вирулентные свойства после пяти последовательных внутримышечных пассажей на свиньях.

Реактогенность. Слабореактогенен для свиней при внутримышечном введении. У отдельных свиней, привитых в дозе 10^6,0-10^7,5 ГАЕ₅₀, может вызывать в течение 3-5 суток повышение температуры тела до 40,6-40,9°С.

Иммуногенные свойства. После внутримышечного введения в дозе 10^6,0-10^7,5 ГАЕ₅₀ вызывает защиту свиней против гомологичного вирулентного референс-штамма К-49 на 21 сутки после прививки в течение не менее 4-х месяцев.

Основные биологические свойства штаммов КК-262/С и КК-202 вируса АЧС приведены в табл.1

Таблица 1 Сравнительные характеристики штаммов КК-262/С и КК-202 вируса АЧС Штамм вируса АЧС Накопление в культурах клеток (lg ГАЕ₅₀/см³) Уровень виремии (lg ГАЕ₅₀//см³⁾ Реактогенность Реакция на прививку Защита от КЗ на 21 сутки (%) KMC ППК-66б Т°С Длительность (сут) КК-262/С 7,25±0,11 7,5±0,11 4,0-4,5 Слабореактогенен 40.6-40,9 3-5 80-85 КК-202 7,00±0,18 Не размножается 5,0-5,75 Реактогенен 40,9-41.7 6-11 65-70

Как видно из таблицы, аттенуированный штамм КК-262/С вируса АЧС превосходит по основным биологическим показателям штамм КК-202 этого серотипа.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Вирус не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и другими микроорганизмами.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 20 пассажей культивирования в культуре клеток ППК-66б и KMC (срок наблюдения).

Способ, срок хранения, периодичность пассажей. Штамм КК-262/С хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°С и «освежают» пассированием в культурах клеток ППК-66б или KMC один раз в 10 лет.

Для подтверждения преимущества настоящего изобретения приведены примеры конкретного его исполнения.

Пример 1. Адаптация вируса АЧС к перевиваемой культуре клеток ППК-66б

Адаптацию вируса к культуре клеток проводили путем инокуляции ее аттенуированным штаммом КК-202, выращенным в первичной культуре клеток KMC (первый пассаж), а в последующих пассажах материалом предыдущего. Инфицированную культуру клеток, выращенную в матрасах, инкубировали при (37,0±0,5)°С в течение 6-9 суток. О размножении вируса в клетках судили по проявлению цитопатического действия. На уровне 6-8-х пассажей специфическую дегенерацию у инфицированных клеток (30,0-40,0) % отмечали на 4-5 сутки, титр вируса на 8-9 сутки выращивания составлял 5,5-6,0 lg ТЦД₅₀/см³. Репродукция вируса в последующих пассажах характеризовалась специфическими дегенеративными изменениями, появление которых отмечали на 3-4 сутки, и накопление вируса на 6-7 сутки составило 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Пример 2. Культивирование штамма КК-262/С вируса АЧС в перевиваемой культуре клеток ППК-66б роллерным способом

В результате выполненных исследований были отработаны оптимальные параметры роллерного способа культивирования штамма, которыми являлись:

- множественность заражения 0,1-0,01 ГАЕ_50/кл;

- содержание сыворотки крови свиней в среде 0,1 ГЛА или Игла-МЕМ 8-10,0%;

- скорость вращения роллерных бутылей 12-16 об/ч;

- рН среды 7,2-7,4;

- длительность культивирования 6-7 суток;

- температурный режим (37,0±0,5)°С;

- объем заполнения роллерных трехлитровых бутылей 0,3-0,5 дм³.

Данные режимы культивирования позволяли получать вируссодержащий материал с активностью 7,0-7,5 lg ГАЕ₅₀/см³. Результаты наработки вирусного сырья 3 опытных серий на основе штамма КК-262/С вируса АЧС представлены в табл.2.

Таблица 2 Характеристика вируссодержащего сырья, полученного в культуре клеток ППК-66б. Номер серии Культура клеток Кол-во бутылей Заражающая доза, ГАЕ ₅₀/кл Длительность культивирования (сут) Объем серии (л) Титр вируса (lg ГАЕ ₅₀/см³) 1   10 0,1 5 3,0 7,5 2 ППК-66б 10 0,01 6 3,0 7,25 3   10 0,001 8 3,0 7,0

Как видно из табл.2, активность 3-х серий вируссодержащего сырья, полученного роллерным способом в культуре клеток ППК-66б, составляла 7,0-7,5 lg ГАЕ₅₀/см³.

Пример 3. Проверка реверсибельности штамма КК-262/С вируса АЧС

С этой целью проводили 5 пассажей штамма КК-262/С вируса АЧС на восприимчивых животных. При проведении первого пассажа культуральный вирус вводили подсвинку 3-месячного возраста в дозе 7,25 lg ГАЕ₅₀ внутримышечно в средней трети шеи. На 6-е сутки подсвинка убивали, у него отбирали бронхиальные и предлопаточные лимфоузлы, из которых готовили 10,0% суспензию на физиологическом растворе. Полученный материал дважды промораживали при минус 40,0°C и после осветления (1500 об/мин в течение 15 минут) вводили внутримышечно следующему животному в объеме 1,0 см³ (второй пассаж). Аналогично проводили последующие пассажи.

У опытных животных отсутствовала клиническая реакция на прививку, а также реакция на месте введения вируса. Подсвинок 5-го пассажа не заболел АЧС в течение 21 суток после введения материала (срок наблюдения). Это указывало на то, что штамм КК-262/С вируса АЧС не реверсибелен.

Пример 4. Проверка иммунобиологических свойств штамма

Безвредность штамма изучали на 3-х подсвинках 3-4 месячного возраста. Штамм вводили внутримышечно в области средней трети шеи. Двух подсвинков прививали вирусом в дозе 7,5 lg ГАЕ₅₀, а одного - в дозе 7,0 lg ГАЕ₅₀. В течение 15 суток иммунизированные подсвинки оставались клинически здоровыми. У привитых животных на 7-9 сутки отмечали повышение температуры тела до 40,6-40,7°C в течение 2-3 суток.

Иммуногенность штамма определяли по результатам контрольного заражения привитых животных гомологичным вирулентным штаммом К-49 в дозе 1000 ГАЕ(LD)₅₀/см³.

С этой целью по 2 подсвинка 3-4-х месячного возраста прививали вирусом в дозе 7,0 и 6,0 ГАЕ₅₀ соответственно. У привитых животных отмечали повышение температуры до 40.7°C в течение 3 суток.

Через 21 сутки после введения вируса всех привитых животных и одного контрольного заражали гомологичным вирулентным вирусом. Одновременно с этими животными заражали свиней, используемых в опыте по определению безвредности (табл.3).

Таблица 3 Иммунобиологические свойства штамма КК-262/С вируса АЧС Штамм вируса АЧС Прививная доза (lg ГАЕ ₅₀/см³) Кол-во ж-х Реакция на прививку Результаты КЗ Длит. темп. реакции, (сут) Максм. тем-pa (°C) Длит. темп. реакции (сут) Макс, температура (°C) КК-262/С 7,5 2 3 40,7 3 40.9 7,0 1 2 40.6 5 40,8 7,0 2 3 40.7 4 40,9 6,0 2 2 40,6 3 41,0 Контроль 1 - - 9 41.8

Контрольный подсвинок погиб на 9-е сутки после заражения с признаками АЧС (температура тела до 41.8°C, синюшность кожных покровов, угнетение, анорексия, диарея, гиперплазия лимфоузлов, увеличение и полнокровие селезенки и др.), тогда как привитые животные оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения.

Полученные данные показывают, что адаптированный к перевиваемой культуре клеток ППК-66б штамм КК-262/С создает через 21 сутки у животных, привитых в дозе 6,0-7,0 lg ГАЕ₅₀, защиту против вирулентного вируса АЧС. Штамм слабореактогенен, не реверсибелен и безвреден для свиней.

Источники информации

1. В.А.Сергеев. Вирусные вакцины. 1993 г.

2. В.М.Балышев. Иммунобологические и молекулярно-генетические свойства изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных в Российской Федерации. / В.М.Балышев, Ю.Ф.Калантаенко, А.Н.Жуков, С.Ж.Цыбанов, И.М. Калабеков / Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России: материалы Всероссийской научной конференции. - М., 2010. - С.94-98.

3. Черятников Л.Л. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса АЧС и их сравнительная оценка. / Л.Л.Черятников, Ю.И.Петров, Н.И.Митин / Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии 1992. - Ч.1. - С.56.

Изобретение относится к области вирусологии и касается аттенуированного штамма вируса африканской чумы свиней (АЧС) 2-го серотипа. Штамм получен путем адаптации к культуре клеток ПИК-66б в течение 50 пассажей и последующей селекции вируса методом предельных разведений в этой культуре и клетках КМС и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под номером 183. Представленный штамм может быть использован в научно-исследовательских и диагностических центрах при проведении эпизоотологического мониторинга, вирусологических, молекулярно-генетических исследованиях и разработке диагностических и вакцинных препаратов при АЧС. 3 табл., 3 пр.

Аттенуированный штамм вируса африканской чумы свиней 2-го серотипа, семейство Asfarviridae, род Asfivirus, депонированный в Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, №1831 для разработки диагностических и вакцинных препаратов.