СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ОСПЫ ОВЕЦ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/275 C12N5/00 C12N7/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к способам получения живых культуральных вакцин против оспы овец, и может использоваться на предприятиях биологической промышленности.

Для профилактики оспы овец за рубежом применяются вакцины из аттенуированных штаммов, адаптированных к первичным культурам клеток почки и текстикул ягненка и козленка (патент СРР кл. A 61 K 35/76 N 110713, 1985. Solyom F. et al. // Acta vet. Acad sci. hung. - 1980 (1981)- V. 28 - N4 - P. 389-398. Das S. K.//Indian J. Exp. Biol/ - 1986 - V. 24 - N 6 - P. 367-370. Kitching R.P.// Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. - 1986 - V. 5 - N 2 - P. 503-511).

В Российской Федерации используются вакцина против оспы овец из штамма с 113/86 (Авт. св-во N 1614201), вирусвакцина культуральная сухая против оспы овец и штамма НИСХИ (ТУ 10-09-101-91) и вирусвакцина против оспы овец из штамма ВНИИЗЖ культуральная сухая (ТУ 9384-001-00008064-97).

Недостатки этих препаратов заключаются в том, что вакцина из штамма С 113/86 представляет собой тканевую суспензию, вакцина из штамма НИСХИ, как и зарубежные препараты, изготавливается в первичной культуре клеток, а из штамма ВНИИЗЖ - в перевернутой культуре клеток, выращенной стационарным способом в матрасах. Это осложняет технологию получения препаратов и увеличивает их стоимость.

Наиболее близок к предлагаемому способ получения сухой культуральной вирусвакцины, содержащей вакцинный штамм "НИСХИ", выращенный в первичной культуре клеток почки овцы, и стабилизатор высушивания (% по массе) 6 - пептона, 5 - сахарозы. Штамм НИСХИ вируса оспы овец в производственных целях выращивают в матрасах емкостью 1 или 1,5 дм куб. при заражающей дозе вируса 0,01 - 0,001 ТЦД 50/кл первичной культуры клеток почки овцы. В качестве ростовой среды применяют 0,5%-ный гидролизат лактабульмина (ГЛА) на растворе Хенкса с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) и антибиотиками, а в качестве поддерживающей среды 0,5% ГЛА на растворе Хенкса с 5% прогретой сыворотки КРС и антибиотиками. Культивирование вируса проводят в течение 5 - 10 сут при температуре 37± 1^oC. Титр вакцинного вируса в сухом препарате составляет не менее 100000 ТЦД 50/см куб. (Технические условия ТУ 10-09-101-91 Вирусвакцина сухая культуральная против оспы из штамма "НИСХИ").

Основным недостатком прототипа в современных условиях производства является использование дорогостоящей технологии, предусматривающей получение вирусного сырья в первичной культуре клеток почки ягнят. Получение клеточного субстрата связано с сезонностью, возможностью контаминации его посторонними микроорганизмами и нерентабельным использованием молодых ягнят, что приводит к большим затратам на получение промышленных серий культуры клеток и повышает себестоимость вакцины.

Другим недостатком прототипа является то, что с целью сохранения биологической активности вакцины необходима укупорка лиофилизированной вакцины под вакуумом, что усложняет технологию производства.

Целью данного изобретения является разработка высокопроизводительной технологии производства безвредной, высокоиммуногенной, стабильной при хранении вакцины против оспы овец.

Поставленная цель достигается тем, что для получения вируссодержащего сырья используется высокопроизводительная роллерная технология культивирования вакцинного вируса в перевиваемой культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ, а для стабилизации применяется защитная среда, обеспечивающая длительное хранение препарата и позволяющая исключить стадию укупорки флаконов или отпайки ампул под вакуумом.

Предлагаемый способ изготовления вирусовакцины против оспы овец сухой культуральной включает в себя получение посевных серий перевиваемых клеток почки овцы сублинии ПО-ВНИИВВиМ в роллерных сосудах емкостью 3 дм куб. при температуре 37,5 - 38,5^oC в течение 24 ч при скорости вращения сосудов 10 - 12 об/ч, объеме их заполнения 0,3 дм куб. и посевной концентрации 100 - 120 тыс. клеток в см. куб., с последующим серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:5; инфицирование сформированного монослоя посевным вирусом в дозе 0,001 - 0,01 ТЦД 50/клетку; инкубирование инфицированной культуры в указанных условиях в течение 5-6 сут, со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 суток культивирования; замораживание пораженной на 75 - 80% культуры при минус 40^oC и оттаивание при комнатной температуре; смешивание полученного вируссодержащего сырья с защитной средой определенного состава в объемном соотношении 1:1 и лиофильное высушивание до содержания массовой доли влаги в пределах 1-4%.

Новый способ отличается от известного тем, что для выращивания вируса используется перевиваемая культура клеток почки овцы, сублинии ПО-ВНИИВВиМ (депонирована во ВНИИВВиМ в 1978 г., кат. N 22). Клетки эпителиоидного типа полигональной формы со стабильным кариотипом. Модальный класс представляют клетки с 70 хромосомами, что составляет 10%. Выращивают клетки в пристеночных культурах в среде Игла (МЭМ) с 5 - 10% нативной сыворотки КРС. Использование этой клеточной культуры позволяет исключить из технологического процесса дорогостоящую нестандартную, малотехнологичную первичную культуру клеток почки ягненка.

Другим отличием предлагаемого способа от прототипа является использование более производительной роллерной технологии культивирования вируса, что позволяет получить за один цикл культивирования 30,0 дм куб. вирусного сырья с активностью 5,5 - 6,1 lg ТЦД 50/см куб., из которого можно приготовить 1,5 млн. доз вакцины.

В качестве защитной среды предлагается стабилизатор, содержащий (% по массе) ферментативного пептона - 20, лактозы - 4, деминерализованной воды - остальное.

Для приготовления серий вакцины используют вируссодержащее сырье с биологической активностью 5,5 - 6,0 lg ТЦД 50/см куб. и стабилизатор в объемном соотношении 1:1, что обеспечивает следующее содержание защитных веществ (% по массе): пептона - 9,8 - 10; лактозы - 1,8 - 2,0. Предлагаемый комплекс обеспечивает минимальные потери титра вируса при лиофилизации (не более 0,5 lg) и стабильность физических и иммунобиологических свойств вакцины при ее укупорке без вакуума.

Для подтверждения преимущества настоящего изобретения приведены примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Получение вируссодержащего материала
Для получения вакцины использовали перевиваемую культуру клеток сублинии ПО-ВНИИВВиМ, выращенную в роллерных сосудах.

Перед заражением среду из 100 роллерных сосудов слили и в каждый внесли по 5 см куб. матровой расплодки вируса с биологической активностью 5,0 lg ТЦД 50/см куб. и по 300 см куб. поддерживающей питательной среды ИГЛА МЭМ с 5% инактивированной сыворотки КРС.

Выращивание вируса проводили при температуре (38±1)^oC. Скорость вращения роллерных сосудов составляла 10-12 об./ч. Смену среды проводили через каждые 2 сут. Через 120 часов (5-е сутки культивирования) около 80% монослоя было поражено. Содержимое роллерных сосудов заморозили при минус 40^oC.

В опыте было получено 30 дм куб. вируссодержащей жидкости с биологической активность 5,75 lg ТЦД 50/см куб., которую использовали для изготовления вакцины.

Пример 2. Изготовление серии вакцины
К 15,0 дм куб. вируссодержащего материала добавляли при помешивании 15,0 дм куб. защитной среды, содержащей (% по массе) пептона - 19,5; лактозы - 4,0 и деминерализованной воды - 76,5. К полученной смеси добавили комплекс антибиотиков и расфасовали по 4 см куб. во флаконы емкостью 10 см куб. и лиофилизировали.

Сухую вакцину герметично укупоривали.

Аналогичным способом были получены еще 3 серии вакцины.

Пример 3. Контроль биологических показателей вакцины
Комиссионно (с участием ОБТК института) 3 серии вакцины изучены по следующим показателям: биологическая активность, безвредность и иммуногенная активность.

Требования на вакцину изложены в технических условиях ТУ 9384-068-00008064-97 "Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная", утвержденных в декабре 1997 г. Департаментом ветеринарии МСХ и ПРФ.

Биологическая активность
При титровании биопрепаратов в монослойной пробирочной культуре клеток ПО активность по сериям составила: серия N 4 - 5,25 lg, серия N 5 - 5,25 lg, серия N 7 - 5,75 lg ТЦД 50/см куб.

Безвредность
При введении препаратов овцам по 5 см куб. (6 голов - по 2 головы на серию) все животные оставались клинически здоровыми в течение 10 суток наблюдения.

Иммуногенная активность
Проверяли иммуногенную активность 4 и 7 серий. Овцы (6 гол), привитые в дозе 1000 ТЦД 50, через 12 суток после вакцинации не реагировали на введение 1000 ИД 50 вирулентного штамма вируса оспы овец. При этом контрольные животные (2 гол) заболевали оспой с характерными клиническими признаками
Пример 4. Изучение стабильности биологической активности вакцины при хранении
Изучена сохраняемость сухой вирусвакцины в течение 2-х лет хранения при температуре 4±4^oC. В опыте использовали вирусвакцину, лиофилизированную с пептоно-лактозным стабилизатором и укупоренную без вакуума. Результаты исследований приведены в таблице.

Как видно из таблицы, вакцина при температуре 4±4^oC сохраняет исходную активность в течение 1 года, через 2 года хранения в некоторых сериях вакцины происходит незначительное снижение титра вирус (на 0,25 lg ТЦД 50/мл). Использование пептоно-лактозного стабилизатора позволяет максимально сохранить биологические свойства вируса в процессе высушивания и хранения, а также исключить стадию укупорки флаконов (ампул) под вакуумом.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение по стандартной и производительной технологии вирусвакцины против оспы овец сухой культуральной. Он прост в исполнении, доступен и может быть реализован в промышленном масштабе.

Научно-техническая документация на препарат (Технические условия и Наставление по применению) утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 4 декабря 1997 г.

Изобретение предназначено для получения живых культуральных вакцин против оспы овец. Получают посевные серии перевиваемых клеток почки овцы сублинии ПО-ВНИИВВиМ в роллерных сосудах. Сформированный монослой инфицируют посевным вирусом в оптимальной дозе. Инкубируют инфицированную культуру в роллерных условиях в течение 5-6 сут со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 сут культивирования. Замораживают пораженные на 75-80% культуры при минус 40^oC и оттаивают при комнатной температуре. Смешивают полученное вируссодержащее сырье с защитной средой определенного состава в объемном соотношении 1: 1. Лиофильно высушивают до содержания массовой доли влаги не более 4%. Изобретение обеспечивает получение стандартной, безвредной, высокоиммуногенной, стабильной при хранении вакцины против оспы овец по высокопроизводительной технологии. 1 табл.

Способ получения вакцины против оспы овец, включающий получение вируссодержащего материала в культуре клеток и его лиофилизацию, отличающийся тем, что для выращивания вируса используют перевиваемую культуру клеток почки овцы сублинии ПО-ВНИИВВиМ, роллерную технологию культивирования вируса, а для стабилизации вируса при высушивании применяют защитную среду при следующем содержании компонентов вакцины, мас.%:
Вируссодержащий материал - 48 - 52
Пептон - 9,8 - 10
Лактоза - 1,8 - 2,0
Деминерализованная вода - Остальное