ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ БИФИДОБАКТЕРИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в производстве эубиотических препаратов и бифидосодержащих продуктов питания.

Эубиотики предназначены для восстановления нормальной микрофлоры хозяина, поврежденной под влиянием различных неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды. В комплексе мер для коррекции микрофлоры ведущая роль принадлежит введению в организм эубиотиков, в частности биологических бактерийных препаратов на основе бифидобактерий, и бифидосодержащих продуктов питания. Возрастающая потребность в подобных препаратах и продуктах питания обусловливает необходимость разработки новых эффективных и недорогих производственных питательных сред для накопления биомассы бифидобактерий. Производственные питательные среды должны обеспечивать высокую скорость размножения бактерий наряду с минимальной продолжительностью их ростового цикла для получения высокой концентрации жизнеспособных микробных клеток в единице объема питательной среды (не менее 10⁸ КОЕ/мл). Сырье для приготовления таких сред должно быть доступным, недорогим, технологически целесообразным.

В настоящее время для накопления биомассы бифидобактерий используют питательные среды различного состава. Основой их служат гидролизаты и экстракты растительного и животного происхождения: среда Блаурокк на основе печеночного отвара, кукурузно-лактозная среда на основе кукурузного экстракта, среды на основе мясного экстракта.

Наиболее близкой к заявляемой является гидролизатно-молочная среда - ГМ-среда [1] содержащая гидролизат обрата, NaCl, лактозу, L-цистеин солянокислый, пептон, агар-агар и воду. Гидролизатно-молочную питательную среду готовят следующим образом. Приготовление гидролизованного молока.

Обычное или восстановленное обезжиренное молоко (обрат) доводят до кипения и кипятят 2 мин, охлаждают до 14^oC, устанавливают pH 7,9 10 - 20%-ным раствором NaOH.

Добавляют панкреатин из расчета 1 г/дм³, предварительно разведенный в небольшом количестве нагретой до 44^oC воды, размешивают и ставят в термостат на 40^o С под ватной пробкой. В течение первых двух часов перемешивание и коррекцию pH до 7,9 проводят каждые 30 мин, в следующие два часа через каждый час. Через 4 ч от начала гидролиза добавляют 1 2% хлороформа, закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат. Через 4 ч доводят pH до 4,4 30%-ным раствором уксусной кислоты, кипятят, помешивая, не менее 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200 300 мг% аминного азота.

Приготовление ГМ-среды.

Разводят гидролизованное молоко питьевой водой в соотношении 1:1. В небольшом количестве разведенного гидролизата расплавляют агар в количестве 2,5 г на 1 дм³ приготовляемой среды. К остальному количеству гидролизата добавляют 28 г пептона и 3,5 г хлористого натрия, смесь нагревают до температуры 80^oC, после чего соединяют с расплавленным агаром. В смеси устанавливают pH 7,5, кипятят в течение 15 мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее 10,0 г лактозы и 0,15 г солянокислого цистина. Среду заливают в пробирки высоким столбиком 10 см³ и стерилизуют при температуре 112^oC в течение 30 мин с предварительным подогревом автоклава паром в течение 30 мин. pH готовой среды 7,1 7,3.

ГМ-среда широко используется в России и других странах СНГ для наращивания биомассы бифидобактерий как в производстве бифидумбактерина сухого, так и кисломолочного. Эта среда обеспечивает получение бифидобактерий в концентрации 10⁸ 10⁹ КОЕ/мл. Она достаточно проста в изготовлении. Вместе с тем, ГМ-среда имеет ряд недостатков. Основной из них - медленный рост бифидобактерий. Так, при выращивании на этой среде бифидобактерии достигают максимума концентрации к 18 24 ч культивирования.

Цель изобретения сокращение продолжительности роста бифидобактерий.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве питательной основы используют молочную сыворотку, осветленную последовательной обработкой обезжиренного молока кислотой и щелочью, при следующем соотношении компонентов (мас.):
Молочная сыворотка осветленная 7,5 10,0
Лактоза 0,3 0,5
Дрожжевой автолизат сухой 0,2-0,3
или жидкий 2,0 3,0
D,L-цистеин 0,05 0,1
NaH₂PO₄ x 2H₂O 0,7 0,8
NH₄Cl 0,1 0,15
MgSO₄•7H₂O 0,015 0,020
Агар-агар 0,075 0,080
Вода остальное
pH 7,2 7,4
где для получения сбалансированной по составу питательной среды осветленную молочную сыворотку и дрожжевой автолизат используют в качестве питательной основы, лактозу источника углерода, цистеин редуцирующего вещества NaH₂PO₄•2H₂O источника фосфора, NH₄Cl источника азота, MgSO₄• 7H₂O источника магния.

Известно использование молочной сыворотки в качестве комплексного обогатителя питательных сред, однако в составе питательных сред для культивирования бифидобактерий молочную сыворотку и, в частности, осветленную молочную сыворотку не использовали. Осветленная молочная сыворотка позволяет получить прозрачную питательную среду, обеспечивающую отсутствие осадка при выращивании бифидобактерий, получение биомассы бифидобактерий, свободной от компонентов среды. Прозрачность среды позволяет осуществлять визуальный контроль чистоты культуры и может быть использована также для исследовательских целей.

Предлагаемая агаризованная дрожже-молочно-солевая среда (АДМС) обладает высокими ростовыми качествами. Наращивание биомассы бифидобактерий до концентрации 10⁹ КОЕ/мл на этой среде происходит в течение 7 8 ч против 18 24 ч при использовании ГМ-среды. Кроме того, в отличие от ГМ-среды, предлагаемая среда может заготавливаться впрок в виде концентрированных растворов.

Пример 1. Приготовление осветленной сыворотки.

1 л обезжиренного молока закисляют 20%-ной соляной кислотой до pH 4,0 - 4,5, кипятят 5 10 мин и удаляют осадок фильтрованием или центрифугированием (3000 об. мин 10 минут). В полученный фильтрат (центрифугат) вносят 20%-ный раствор гидроксида натрия до pH 9,0 9,5. Кипятят 5 10 мин и удаляют флокулят таким же способом. Молочную сыворотку нейтрализуют 20%-ной соляной кислотой до pH 7,2 7,4. Объем доводят водой до 1 л. При необходимости длительного хранения осветленную сыворотку автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин.

Приготовление концентрированного раствора "А".

В 1 л осветленной молочной сыворотки вносят 5,0 г лактозы и 3 г сухого автолизата дрожжей, растворяют их, доводят pH до 7,2 7,4 с помощью 20%-ного раствора гидроксида натрия. Раствор кипятят 5 10 мин, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Приготовление концентрированного раствора "Б".

В 0,9 л дистиллированной воды растворяют 78 г натрия фосфата однозамещенного двуводного, 10 г аммония хлористого, 2 г магния сульфата 7-водного, 10 г D,L-цистеина. Затем доводят pH раствора до 7,2 7,4 с помощью гранулированного калия гидроксида и вносят 7,5 г агар-агара. Смесь кипятят до расплавления агара, разливают во флаконы и автоклавируют при 0,5 1 атм. 30 мин.

Приготовление агаризованной дрожже-молочно-солевой среды (АДМС).

Смешивают равные объемы растворов "А" и "Б" (по 1 части) с 8 частями воды и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.

Готовая среда имеет светло-желтый цвет с коричневым оттенком (за счет частичной карамелизации лактозы), совершенно прозрачна.

Пример 2.

Использование питательной среды АДМС для наращивания биомассы бифидобактерий B.bifidum 791.

Разливают среду АДМС по 10 мл в два ряда пробирок (диаметр 12 мм, 20 пробирок в ряду) и стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин. Затем в каждую пробирку первого ряда вносят по 0,1 мл суточной культуры бифидобактерий на АДМС. В пробирки второго ряда таким же способом засевают по 1 мл той же культуры. Оба ряда пробирок помещают в водяной ультратермостат при 37^oC и через каждый час вынимают по одной пробирке для измерения оптической плотности культуры на фотоэлектрокалориметре с красным светофильтром. После достижения культурами стационарной фазы роста (максимальной неизменяющейся оптической плотности) строят график зависимости "Оптическая плотность время", а также определяют концентрацию живых бактерий в 1 мл среды путем титрования. В случае разведения посевной дозы на АДМС в 100 раз стационарная фаза роста культуры наступает через 15 ч. Разведение в 10 раз такой же результат дает через 7 8 ч. При этом концентрация клеток составляет 3 4•10⁹ КОЕ/мл. На ГМ-среде при 10-кратном разведении посевной дозы культура достигала стационарной фазы роста только к 20 часу культивирования.

Таким образом, агаризованная дрожже-молочно-солевая среда (АДМС) обладает более высокими ростовыми качествами для бифидобактерий, чем ГМ-среда. Она обеспечивает сокращение времени культивирования бифидобактерий и к тому же не содержит дорогостоящего и дефицитного препарата панкреатина.

Использование: биотехнология, медицинская микробиология и может быть использовано в производстве эубиотических препаратов и бифидосодержащих продуктов питания. Сущность изобретения: питательная среда в качестве основы содержит молочную сыворотку, осветленную последовательной обработкой обезжиренного молока кислотой и щелочью, и дрожжевой автолизат сухой или жидкий и дополнительно натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный, аммоний хлористый и магний сернокислый семиводный, при следующем соотношении компонентов (мас.%): молочная сыворотка осветленная - 7,5 - 10,0, лактоза - 0,3 -0,5, дрожжевой автолизат сухой или жидкий - 0,2 -0,3 и 2,0 - 3,0, D,L-цистеин - 0,05 - 0,1, NaH₂PO₄ • 2H₂O - 0,7 - 0,8, NH₄Cl - 0,1 - 0,15, MgSO₄•7H₂O - 0,015 - 0,020, агар-агар - 0,075 - 0,080, вода - остальное, pH 7,2 - 7,4.

Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий, содержащая питательную основу, источник углерода лактозу, редуцирующее вещество - D,L-цистеин, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит молочную сыворотку, осветленную последовательной обработкой обезжиренного молока кислотой и щелочью, и дрожжевой автолизат сухой или жидкий, и дополнительно натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный, аммоний хлористый и магний сернокислый семиводный, при следующем соотношении компонентов, мас.

Молочная сыворотка осветленная 7,5 10,0
Дрожжевой автолизат сухой 0,2 0,3
или жидкий 2,0 3,0
Лактоза 0,3 0,5
D,L-цистеин 0,05 0,1
Натрий фосфорнокислый однозамещенный двуводный 0,7 0,8
Аммоний хлористый 0,1 0,15
Магний сернокислый семиводный 0,015-0,020
Агар-агар 0,075 0,080
Вода Остальноек