СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии и аллергологии, конкретно к иммунологическому анализу крови.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано для оценки эффективности аллергенспецифической иммунотерапии у детей с бронхиальной астмой на раннем этапе лечения и своевременного определения тактики дальнейшей терапии.

Аллергенспецифическая иммунотерапия - эффективный метод лечения атопических болезней у детей, непосредственно действующий на патогенетические механизмы аллергического процесса и позволяющий добиться длительной ремиссии. Принцип проведения аллергенспецифической иммунотерапии состоит во введении больному постепенно возрастающих доз причинно-значимых аллергенных экстрактов с целью предотвращения или уменьшения клинических проявлений болезни при последующих контактах пациента с этими аллергенами.

Аллергенспецифическая иммунотерапия является единственным методом лечения, способным влиять на естественное течение аллергических болезней и предотвращать развитие бронхиальной астмы у больных, страдающих аллергическим ринитом (Хутуева С.Х., Федосеева В.Н. Аллергенспецифическая иммунотерапия бронхиальной астмы. М.: Изд. «Экон», 2000. - 252 с; Bousquet J., Michel F. Specific immunotherapy in allergic rhinitis and asthma. // In: Busse W., Holgate S. Eds. Asthma and rhinitis. - Oxford. - Blackwell Scientific. - 1995. - P.1309-1324).

У детей с аллергическими болезнями выявляются значительные изменения иммунного ответа, характеризующие дисбаланс в соотношение лимфоцитов Т-хелперов 2 типа к Т-хелперам 1 типа (Th1/Th2) с преобладанием функционирования Тh2-хелперного ответа, с последующей активацией цитокинов (Chung K.F., Barnes P.J. Cytokines in asthma // Thorax. - 1999 - Vol.54. - P.825-857).

Известно, что при аллергенспецифической иммунотерапии у многих больных происходит значительное увеличение продукции цитокинов интерлейкина (IL) 2 и интерферона-γ (IFN-γ), что свидетельствует об активации Th1-клеток (Ross R.N., Nelson H.S., Finegold I. Effectiveness of specific immunotherapy in the treatment of asthma: a meta-analysis of prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled studies. // J. Clinical Therapeutics. - 2000. - Vol.22(3). - P.329-341). IFN-γ, являясь основным продуктом Th1-лимфоцитов, оказывает ингибирующее действие на секреторную активность Тh2-лимфоцитов, способствуя снижению продукции IgE (Spiegelberg H.L., Tighe H., Roman M. et al. Downregulation of IgE antibody formation by allergen gene immunization. // J. Allergy Clin. Immunol. - 1998. - Vol.10, №1. - P.52-58). При аллергенспецифической иммунотерапии снижается содержание фактора некроза опухолей-α (TNF-α), синтезирующегося макрофагами, эндотелиальными и тучными клетками, которое приводит к торможению воспалительной реакции (Bousquet J., Michel F. Specific immunotherapy in allergic rhinitis and asthma. // In: Busse W., Holgate S. editors. Asthma and rhinitis. - Oxford. - Blackwell Scientific. - 1995. - P.1309-1324).

Известен способ оценки эффективности специфической иммунотерапии путем, в котором иммуноферментным методом определяют концентрации ряда цитокинов на фоне проведения иммунотерапии, после которой отмечены нормализация уровня цитокина интерлейкина (IL) 4 в сыворотке крови и снижение уровня общего иммуноглобулина Е (IgE), что расценивалось авторами как признак ослабления активации Тh2-лимфоцитарного ответа (Лобкова Ю.С., Калинина Н.М., Лобкова О.С. и др. Цитокиновый профиль как критерий оценки специфической иммунотерапии атопических аллергических заболеваний. // Иммунология. - 1999. - №2. - С.35-38).

Однако в этой работе не определены критерии эффективности проводимой иммунотерапии. Этот способ наиболее близок по сущности и избран нами в качестве прототипа.

Задача - разработка достоверного способа оценки эффективности аллергенспецифической иммунотерапии бронхиальной астмы у детей на начальном этапе лечения для своевременного и адекватного изменения тактики терапии таких больных.

Поставленная задача решается путем определения иммуноферментным методом содержания цитокинов, для чего в сыворотке крови больных определяют концентрации фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α) и интерферона-гамма (IFN-γ) после проведения 4-недельного курса аллергенспецифической иммунотерапии, с последующим расчетом коэффициента соотношения их концентраций после окончания курса лечения, и при значении коэффициента меньшем или равном 3,0 иммунотерапия оценивается как эффективная, а при коэффициенте большем 3,0 делают вывод об отсутствии эффекта иммунотерапии.

Оценка эффективности иммунотерапии у детей с бронхиальной астмой включает определение концентраций провоспалительных цитокинов - TNF-α и IFN-γ в периферической крови in vitro до начала лечения и после 4-недельного курса иммунотерапии иммуноферментным методом энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) с последующим расчетом соотношения концентраций указанных соединений.

Способ осуществляется следующим образом.

Образцы крови забирают из локтевой вены больного утром, натощак в стерильную полипропиленовую пробирку до начала иммунотерапии и через 4 недели ее проведения.

Полученные пробы крови центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 минут, сыворотку отбирают и проводят иммуноферментный анализ концентраций указанных цитокинов (или хранят при температуре -40°С до проведения процедуры анализа).

Количественное определение содержания TNF-α и IFN-γ в сыворотке крови проводят посредством иммуноферментного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (enzym-linked immunosorbent assay - ELISA) с помощью коммерческих наборов «Human TNF-α CYTELISE» (CYTIMMUNE, USA) и «Human IFN-γ» (BioSource International, USA).

Принцип энзим-связанного иммуносорбентного определения содержания цитокинов заключается в том, что моноклональные антитела, специфичные к исследуемому антигену (например, к TNF-α), фиксированы на поверхности лунок 96-луночной планшетки. При добавлении к ним проб сыворотки крови или стандартов исследуемый антиген связывается иммобилизованными антителами. После удаления отмыванием несвязавшихся протеинов в лунки добавляются поликлональные антитела, связанные с энзимом, которые наслаиваются на иммобилизованный в ходе первой инкубации антиген по принципу «сэндвича». После этого их излишек отмывается и в лунки добавляется раствор хромогенного субстрата, который прореагировав с энзимом, дает характерное окрашивание. По интенсивности последнего оценивается содержание в пробе исследуемого антигена (Voller A., Bidwell D. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). A review of recent developments with abstracts of microplate applications // MicroSystems Ltd., Guernsey, Channel Islands. - 1980. - P.1-126).

В заявляемом способе можно использовать наборы для иммуноферментного анализа разных фирм, что не влияет на конечный результат количественного определения цитокинов.

Для оценки эффективности аллергенспецифической иммунотерапии проводится расчет коэффициента соотношения концентраций провоспалительных цитокинов - TNF-α и IFN-γ в сыворотке крови до и после проведения 4-недельного курса иммунотерапии и при коэффициенте меньшем или равном 3,0 - иммунотерапия оценивается как эффективная, а при коэффициенте большем 3,0 - прогнозируется отсутствие терапевтического эффекта, что определяет необходимость изменения тактики лечения.

Под нашим наблюдением находилось 62 пациента в возрасте от 5 до 17 лет с атопической бронхиальной астмой, обусловленной выраженной сенсибилизацией к причиннозначимым аллергенам.

Аллергенспецифическая иммунотерапия проводилась всем детям парентеральным методом в условиях стационара различными видами неинфекционных аллергенов (аллергенами клещей рода Dermatophagoides, домашней пыли, эпидермальными и пыльцевыми аллергенами). Аллергенные экстракты в разведениях от 1:1000000 до 1:1000 вводились три раза в день с интервалом в 2 часа при условии хорошей переносимости лечения; разведения 1:100-1:10 вводились один раз в день.

Содержание цитокинов в крови больных определяли в зависимости от достижения клинического эффекта при проведении аллергенспецифической иммунотерапии.

Клинические примеры

Пример 1. Больная К., 12 лет (история болезни 452/06). Диагноз: Бронхиальная астма атопическая форма, средне-тяжелое течение. Девочка больна в течение 5 лет. Заболевание проявляется типичной картиной болезни в период обострения с приступами удушья. В клинике проведены исследования функции внешнего дыхания, выявившие наличие нарушений бронхиальной проходимости на уровне периферических бронхов. При аллергологическом обследовании выявлены поливалентная сенсибилизация, повышение общего IgE и специфических IgE. Учитывая IgE-зависимый характер заболевания, больной показано проведение аллергенспецифической иммунотерапии. После 4-недельного курса аллергенспецифической иммунотерапии уровень фактора некроза опухолей-α в сыворотке крови составил 35,6 пг/мл, содержание интерферона-γ 6,24 пг/мл.

Соотношение их концентраций равняется 5,7.

Врачебное наблюдение за больной в стационаре аллергологического отделения не выявило существенного улучшения состояния после проведенного курса иммунотерапии, что подтверждает расчетную оценку и указывает на значимость определения соотношения указанных цитокинов для изменения тактики лечения.

Пример 2. Больная Р., 10 лет (история болезни 213/06), находилась в аллергологическом отделении с диагнозом: Бронхиальная астма, атопическая форма, средне-тяжелое течение. Девочка больна в течение 6 лет. Заболевание проявляется типичной картиной болезни в период обострения с приступами удушья. При аллергологическом обследовании выявлены поливалентная сенсибилизация, повышение общего IgE и специфических IgE. Учитывая доказанный IgE-зависимый характер заболевания, больной показано проведение аллергенспецифической иммунотерапии. После 4-недельного курса аллергенспецифической иммунотерапии уровень фактора некроза опухолей-α в сыворотке крови составил 21,5 пг/мл, содержание интерферона-γ - 8,24 пг/мл. Соотношение их концентраций равняется 2,6. Значительное клиническое улучшение при проведении аллергенспецифической иммунотерапии сопровождалось позитивной динамикой содержания цитокинов уже после 4-недельного курса лечения.

При положительном клиническом эффекте иммунотерапии было установлено повышение концентрации IFN-γ и уменьшение содержания TNF-α. Коэффициент соотношения концентраций TNF-α и IFN-γ при значимом положительном клиническом эффекте первого курса иммунотерапии был 2,7±0,25 (см. таблицу).

При отсутствии клинического эффекта аллергенспецифической иммунотерапии у детей с бронхиальной астмой были выявлены низкие уровни IFN-γ и высокие концентрации TNF-α, которые существенно отличались от данных у детей с положительным результатом иммунотерапии. Коэффициент соотношения концентраций TNF-α и IFN-γ при этом был равен 5,3±0,34, что в 1,9 раза (Р<0,05) превышало аналогичный коэффициент соотношения концентраций этих цитокинов и свидетельствовало о его значимом увеличении при отсутствии эффекта иммунотерапии у детей с бронхиальной астмой (см. таблицу).

Изменения соотношения концентраций TNF-α и IFN-γ в сыворотке крови больных бронхиальной астмой до и после проведения аллергенспецифической иммунотерапии (М±m)Группы больныхДо начала иммунотерапии (пг/мл)Через 4 недели иммунотерапии (пг/мл)TNF-αIFN-γСоотношение TNF-α/ IFN-γTNF-αIFN-γСоотношение TNF-α/ IFN-γС положительным эффектом иммунотерапии, (n=39)24,41±2,035,74±0,184,3±0,1918,15±2,18*6,65±0,172,7±0,25*С отсутствием эффекта от иммунотерапии, (n=23)23,14±1,524,37±0,635,3±0,2525,13±1,94**4,89±1,125,3±0,34**Примечание. Здесь звездочкой * - р<0,05 - обозначены уровни значимости различий по сравнению с данными до начала лечения и ** - р<0,05 - при сравнении двух групп больных

Установленные значимые различия значений коэффициентов соотношения концентраций указанных цитокинов у больных с положительным эффектом иммунотерапии и при его отсутствии позволяют оценивать эффективность аллергенспецифической иммунотерапии бронхиальной астмы и производить точный отбор больных для проведения последующих курсов аллергенспецифической иммунотерапии.

Очевидно, что определение коэффициентов соотношения концентраций цитокинов TNF-α/IFN-γ до и после проведения первого 4-недельного курса аллергенспецифической иммунотерапии позволяет на начальном этапе лечения достоверно оценивать эффективность иммунотерапии бронхиальной астмы у детей и использовать этот критерий в клинической практике. Данный способ оценки эффективности иммунотерапии бронхиальной астмы у детей пригоден для использования в медицинских и научных учреждениях.

Использование способа позволяет достоверно оценивать эффективность проводимой иммунотерапии бронхиальной астмы уже на начальном этапе, что позволяет применять его в клинической практике для формирования групп больных, у которых продолжение курсовой иммунотерапии нецелесообразно вследствие ее клинической неэффективности и больных, у которых проводимая иммунотерапии сопровождается высоким терапевтическим эффектом.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии и аллергологии. Способ оценки эффективности аллергенспецифической иммунотерапии у детей с бронхиальной астмой заключается в иммуноферментном определении содержания цитокинов - TNF-α и IFN-γ в сыворотке крови больных после проведения 4-недельного курса аллергенспецифической иммунотерапии с последующим расчетом коэффициента соотношения их концентраций. При значении коэффициента, меньшем или равном 3,0, иммунотерапию оценивают как эффективную, а при коэффициенте, большем 3,0, делают вывод об отсутствии эффекта иммунотерапии. Использование способа позволяет достоверно оценить эффективность аллергенспецифической иммунотерапии бронхиальной астмы у детей на начальном этапе лечения для своевременного и адекватного изменения тактики терапии таких больных. 1 табл.

Способ оценки эффективности аллергенспецифической иммунотерапии у детей с бронхиальной астмой, включающий иммуноферментное определение содержания цитокинов, отличающийся тем, что в сыворотке крови больных определяют концентрации фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α) и интерферона-гамма (IFN-γ) после проведения 4-недельного курса аллергенспецифической иммунотерапии, с последующим расчетом коэффициента соотношения их концентраций, и при значении коэффициента, меньшем или равном 3,0, иммунотерапию оценивают как эффективную, а при коэффициенте, большем 3,0, делают вывод об отсутствии эффекта иммунотерапии.