СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕКАРБОКСИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к области биохимии и касается способов определения декарбоксилазной активности молочнокислых бактерий.

Известен метод определения декарбоксилазной активности высокоэффективной жидкостной хроматографией, включающий дериватизацию исследуемых образцов, содержащих биогенные амины, о-фтальдегидом в присутствии 2-меркаптоэтанола, нанесение полученного раствора на колонку и анализирование на флуориметре при длине волны возбуждения - 340 нм и длине волны эмиссии - 445 нм.

Этот метод дорогостоящий, требует сложной пробоподготовки, дополнительного оборудования и высокой квалификации.

Известны методы, основанные на использовании питательных сред, содержащих рН-индикаторы, такие как бромкрезоловый пурпурный или крезоловый красный, и соответствующие аминокислоты. Обычно такие среды включают в себя пептон, дрожжевой и мясной экстракты и глюкозу. Результаты учитываются по изменению окраски питательной среды от желтой до пурпурной, что связано с образованием биогенных аминов и изменением рН среды.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения декарбоксилазной активности молочнокислых микроорганизмов на среде, содержащей аминокислоты (тирозин, гистидин, орнитин, лизин) в количестве 1%, 0,006% рН-индикатора бромкрезолового пурпурного. Результаты устанавливают по изменению цвета среды. Наличие фиолетовой или красно-фиолетовой окраски свидетельствует о наличии декарбоксилазной активности микроорганизма [1].

Способ осуществляют следующим образом.

1. Микроорганизмы пересевают 5-10 раз в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% соответствующей аминокислоты (тирозин, гистидин моногидрохлорид, орнитин, лизин), 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента декарбоксилазы.

2. После последнего пересева исследуемые штаммы сеют штрихом на чашки с плотной декарбоксилазной средой, простерилизованной автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) должно быть 5,3.

3. После инкубирования при 37°С в течение 4 суток производят учет результатов.

Однако данный способ недостаточно точен и информативен, поскольку в нем не учитывается влияние молочной кислоты, образующейся при росте микроорганизмов на питательной среде МРС. Молочная кислота, катаболизированная в процессе роста молочнокислых микроорганизмов, приводит к снижению рН среды, в результате чего не происходит изменения окраски индикатора. Это создает определенные трудности при определении ферментативной активности.

В лаборатории МГУПБ были проведены исследования на выявление декарбоксилазной активности у штаммов молочнокислых микроорганизмов из собственной коллекции МГУПБ.

Задачей предлагаемого способа является повышение чувствительности метода исследований по определению декарбоксилазной активности молочнокислых бактерий за счет предлагаемого способа.

Поставленную задачу решают предлагаемым способом определения декарбоксилазной активности молочнокислых бактерий, включающем пересев микроорганизмов в течение 7 дней на жидкую питательную среду MFC, содержащую соответствующую аминокислоту - тирозин, гистидин моногидрохлорид, орнитин, лизин, пиридоксаль-5-фосфат как ко-фактор для активизации фермента декарбоксилазы, внесение биомассы в декарбоксилазный бульон Мюллера, инкубирование и учет результатов, при котором, согласно изобретению, перед внесением биомассы в бульон ее отделяют от питательной среды центрифугированием и ресуспендируют в физиологическом растворе, а инкубирование проводят в течение 48 часов.

Отличительные признаки изобретения заключаются в том, что перед внесением биомассы в среду Мюллера ее следует освободить от образовавшейся молочной кислоты. Для этого биомассу после последнего пересева центрифугируют в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин, затем тщательно перемешивают в физиологическом растворе, взятом в количестве 1 мл. Далее определение активности фермента осуществляют по известной ранее методике, а инкубирование проводят в течение 48 часов. Сокращение времени инкубирования объясняется равномерным распределением компонентов в жидкой среде по сравнению с плотной и более высоким значением рН вносимой биомассы.

Увеличение рН за счет образования биогенных аминов, влекущее за собой изменение цвета среды - суть метода. Но в процессе жизнедеятельности молочнокислые микроорганизмы наряду с биогенными аминами продуцируют молочную кислоту, которая снижает рН среды. Поэтому в результате возникновения эффекта экранирования от молочной кислоты ожидаемое изменение цвета среды не наблюдается.

Главную роль в ферментации пищевых продуктов играют молочнокислые бактерии, вызывая изменения во вкусовых характеристиках и оказывая консервирующий эффект на ферментированные продукты. Эти бактерии широко используются в молочных продуктах, алкогольных напитках, ферментированных овощных, мясных и рыбных изделиях. Метаболическая активность микроорганизмов, вовлеченных в технологические процессы производства пищевых продуктов, может, помимо положительного эффекта, нести риск образования нежелательных веществ, таких как биогенные амины (БА). В пищевых продуктах биогенные амины образуются путем α-декарбоксилирования аминокислот за счет активности микроорганизмов, связанной с наличием у них специфических ферментов декарбоксилаз. Как показывают результаты проведенных исследований, активность аминокислотной декарбоксилазы является штаммоспецифичным признаком, т.е. зависит, в большинстве случаев, от штамма, а не от вида микроорганизма. Для предотвращения накопления БА в ферментированных продуктах следует отбирать промышленные микроорганизмы, не способные образовывать БА и подавляющие рост амино-положительной микрофлоры, которая, в противном случае, может нивелировать эффект от стартовых культур.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Микроорганизмы ежедневно пересевают в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% соответствующей аминокислоты - тирозин, гистидин моногидрохлорид, орнитин, лизин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента декарбоксилазы.

2. После последнего пересева полученную биомассу центрифугируют в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин и 4°С, добавляют физиологический раствор в количестве 1 мл и тщательно перемешивают.

3. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносят в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) должно быть 6,0.

4. В течение следующих 48 часов отмечают изменение окраски среды от желтой до красно-фиолетовой за счет подщелачивания биогенными аминами.

Пример 1.

1. Штамм Lactobacillw plantarum 32 (номер ВКПМ В-1618) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты тирозин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента тирозин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева исследуемый штамм сеяли штрихом на чашки с плотной декарбоксилазной средой, простерилизованной автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 5,3.

3. После инкубирования при 37°С в течение 4 суток цвет среды не изменился.

Пример 2.

1. Штамм Lactobacillus plantarum 32 (номер ВКПМ В-1618) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты тирозин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента тирозин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева измерили значение рН МРС среды с Lactobacillus plantarum 32, которое составило 5,6. Затем полученную биомассу центрифугировали в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин и 4°С, добавляли физиологический раствор в количестве 1 мл и тщательно перемешивали, повторное измерение рН показало значение 6,1.

3. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносили в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 6,0.

4. По истечении 48 часов инкубирования при 37°С изменение окраски среды не произошло.

Пример 3.

1. Штамм Lactobacillus sakei 105 (номер ВКПМ В-8905) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты тирозин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента тирозин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева исследуемый штамм сеяли штрихом на чашки с плотной декарбоксилазной средой, простерилизованной автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 5,3.

3. После инкубирования при 37°С цвет среды приобрел красно-фиолетовый оттенок только на 4 сутки.

Пример 4.

1. Штамм Lactobacillus sakei 105 (номер ВКПМ В-8905) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты тирозин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента тирозин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева измерили значение рН МРС среды с Lactobacilltis sakei 105, которое составило 5,5. Затем полученную биомассу центрифугировали в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин и 4°С, добавляли физиологический раствор в количестве 1 мл и тщательно перемешивали, повторное измерение рН показало значение 5,9.

3. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносили в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 6,0.

4. Изменение желтой окраски среды до красно-фиолетового цвета наступило уже на 2 сутки.

Пример 5.

1. Штамм Pediococcus acidilactici 27 (номер ВКПМ В-8893) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты гистидин моногидрохлорид, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента гистидин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева исследуемый штамм сеяли штрихом на чашки с плотной декарбоксилазной средой, простерилизованной автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 5,3.

3. После инкубирования при 37°С в течение 4 суток цвет среды не изменился.

Пример 6.

1. Штамм Pediococcus acidilactici 27 (номер ВКПМ В-8893) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты гистидин моногидрохлорид, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента гистидин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева измерили значение рН МРС среды с Pediococcus acidilactici 27, которое составило 5,6. Затем полученную биомассу центрифугировали в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин и 4°С, добавляли физиологический раствор в количестве 1 мл и тщательно перемешивали, повторное измерение рН показало значение 6,0.

3. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносили в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 6,0.

4. По истечении 48 часов инкубирования при 37°С изменение окраски среды не произошло.

Пример 7.

1. Штамм Lactobacillus sakei 104 (номер ВКПМ В-8936) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты орнитин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента орнитин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева исследуемый штамм сеяли штрихом на чашки с плотной декарбоксилазной средой, простерилизованной автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 5,3.

3. После инкубирования при 37°С цвет среды приобрел слабый красно-фиолетовый оттенок только на 4 сутки.

Пример 8.

1. Штамм Lactobacillus sakei 104 (номер ВКПМ В-8936) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты орнитин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента орнитин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева измерили значение рН МРС среды с Lactobacillus sakei 104, которое составило 5,6. Затем полученную биомассу центрифугировали в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин и 4°С, добавляли физиологический раствор в количестве 1 мл и тщательно перемешивали, повторное измерение рН показало значение 5,9.

3. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносили в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 6,0.

4. Изменение желтой окраски среды до красно-фиолетового цвета наступило на 2 сутки.

Пример 9.

1. Штамм Lactobacillus casei 10 (номер ВКПМ В-8890) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты лизин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента лизин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева исследуемый штамм сеяли штрихом на чашки с плотной декарбоксилазной средой, простерилизованной автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 5,3.

3. После инкубирования при 37°С в течение 4 суток цвет среды не изменился.

Пример 10.

1. Штамм Lactobacillus casei 10 (номер ВКПМ В-8890) ежедневно пересевали в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% аминокислоты лизин, 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента лизин декарбоксилазы.

2. После последнего пересева измерили значение рН МРС среды с Lactobacillus casei 10, которое составило 5,7. Затем полученную биомассу центрифугировали в пробирках типа эппендорф в течение 5 минут при 12000 об/мин и 4°С, добавляли физиологический раствор в количестве 1 мл и тщательно перемешивали, повторное измерение рН показало значение 6,1.

3. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносили в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды (при 25°С) довели до 6,0.

4. Изменение желтой окраски среды до красно-фиолетового цвета наступило уже на 2 сутки.

Значения рН биомассы и времени инкубирования представлены в таблице.

Преимуществом предлагаемого способа является:

1. Достоверность полученных результатов.

2. Простота метода.

3. Сокращение времени проведения непосредственно анализа (с 4 суток до 48 часов).

Таким образом, предложенный способ позволяет увеличить точность определения декарбоксилазной активности молочнокислых бактерий, исключает возможность ошибки, обусловленной неправильной постановкой метода.

Метод апробирован на большом количестве экспериментального материала.

Список литературы

1. Sara Bover-Cid, Wilhelm Heinrich Holzapfel. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 53 (1999), 33-41.

2. Sara Bover-Cid, Marta Hugas, Maria Izquierdo-Pulido, M. Carmen Vidal-Carou. Amino acid - decarboxylase activity of bacteria isolated from fermented pork sausages. International Journal of Food Microbiology, 66 (2001), 185-189.

Таблица Пример 1Пример 2Пример 3Пример 4Пример 5Пример 6Пример 7Пример 8Пример 9Пример 10рН биомассы до после инактивирования молочной кислоты физиологическим раствором          5,65,65,55,55,65,65,65,65,75,7-6,1-5,9-6,0-5,9-6,1Время инкубирования и учет результатов          96 ч48 ч96 ч48 ч96 ч48 ч96 ч48 ч96 ч48 ч

Микроорганизмы ежедневно пересевают в течение 7 дней в жидкую питательную среду МРС, содержащую 0,1% соответствующей аминокислоты (тирозин, гистидин моногидрохлорид, орнитин, лизин), 0,005% пиридоксаль-5-фосфата для активизации фермента декарбоксилазы. Полученную биомассу освобождают от образовавшейся молочной кислоты. Для этого биомассу после последнего пересева центрифугируют в пробирках типа эппендорф в течение 5 мин при 12000 об/мин и тщательно перемешивают в физиологическом растворе, взятом в количестве 1 мл. Помещенную в физиологический раствор биомассу вносят в среду Мюллера, разлитую по 5 мл в пробирки и простерилизованную автоклавированием 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин. Конечное значение рН среды при температуре 25°С должно быть 6,0±0,2. В течение следующих 48 ч отмечают изменение окраски среды от желтой до красно-фиолетовой за счет подщелачивания образующимися биогенными аминами. Изобретение позволяет повысить точность определения декарбоксилазной активности молочнокислых бактерий, исключает возможность ошибки, обусловленной неправильной постановкой метода. 1 табл.

Способ определения декарбоксилазной активности молочнокислых бактерий, включающий пересев микроорганизмов в течение 7 дней на жидкую питательную среду МРС, содержащую соответствующую аминокислоту - тирозин, гистидин моногидрохлорид, орнитин, лизин, пиридоксаль-5-фосфат как ко-фактор для активизации фермента декарбоксилазы, внесение биомассы в декарбоксилазный бульон Мюллера, инкубирование и учет результатов, отличающийся тем, что перед внесением биомассы в бульон ее отделяют от питательной среды центрифугированием и ресуспендируют в физиологическом растворе, а инкубирование проводят в течение 48 ч.