Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае - продуцент меланина, используемый в качестве тест-объекта для отбора меланинпродуцирующих штаммов холерных вибрионов Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 C12P1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается нового бактериального штамма-продуцента меланина, который может быть использован в качестве тест-объекта при изучении меланиногенеза у штаммов холерных и эктеропатогенных вибрионов, для которых образование этого пигмента не характерно.

Целью изобретения является получение штамма бактерий Vibrio cholerae KM-18 019 серовара продуцента пигмента меланина.

Штамм Vibrio choeerae KM-18 представляет собой спонтанный мутант, возникший при длительном хранении исходного штамма без пересева в полужидком агаре из настоя сердечной мышцы (рН 7,6) при комнатной температуре в анаэробных условиях. Мутант селекционируют путем отбора клеток, интенсивно образующих меланин.

Оптимальными условиями хранения штамма являются лиофильное высушивание или содержание в полужидком агаре (0,25%) из настоя сердечной мышцы или агаре Мартена (рН 7,6) под слоем стерильного вазелинового масла. Высушенную культуру сохраняют при 4°С в полужидком агаре при 22-25°С.

Штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Слегка изогнутые палочки, спор и капсул не образуют, грамотрицательные.

На стандартных плотных средах с рН 7,6 (2%-ный агар из настоя сердечной мышцы, 2%-ный агар Мартена. 2%-ный агар Хот- тингера) при 37° через сутки растет в виде гладких, круглых, плосковыпуклых с ровным

сь

00

ГО

со о

краем колоний коричневой окраски диаметром 2-2,5 мм. В жидких стандартных средах с рН 7,6 (1 %-ный пептонная вода, бульон из настоя сердечной мышцы, бульон Мартена, бульон Хоттингера) при 37°С через сутки наблюдается равномерное помутнение и в аэробных условиях коречневая окраска среды.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: сбраживает глюкозу, маннит, сахарозу, мальтозу, крахмал, маннозу; не сбраживает арабинозу, мактозу.

Отношение к источникам азота.

Для хорошего роста в питательных средах должно быть от 100 до 200 мг.% амин- ного азота. Штамм не обладает уреазной активностью.

Имеет декарбоксилазу лицина и орген- тина, не имеет дигидролиэа аргинина, обладает протеолитической активностью.

Продуцент индол, не продуцирует сероводород, разжижает желатин.

Растет в 1 %-ный пептонной воде с 1% NaCI, не растет - в присутствии 7% NaCl.

Чувствителен к стрептомицину, тетрациклину, эритромицину, мономицину, нео- мицину, левомецитину. Агглютинируется холерными выворотками О-в разведении 1:100 и RO - 1:200. Лизируется цельным фагом эльтор. Сохраняет антигенную структуру вибриона 019 серовара.

Добавление в питательную среду 0,1% тирозина в сочетании с 0,1% цистеина стимулирует образование большего количества пигмента, чем добавление 0.1 % тирозина или 0,1% фенилаланина. Штамм стойко сохраняет свойство синтезировать меланин и его можно использовать в качестве тест- объекта при изучении меланогенеза у холерных и энтеропатогенных вибрионов.

Растет в аэробных и микроаэробных условиях; при полном отсутствии 02 роста нет.

Рост происходит при рН 6-9,6, оптимум 7,6.

Температура границы роста 16 и 40°С, оптимальная температура 37°С.

П р и м е р 1. Использование штамма V.choleral KM-18 019 серовара в качестве тест-штамма при выращивании культур на плотных питательных средах.

Штамм V. cholerae KM-18 и исследуемые на наличие пигмента культуры штаммов 1, 2, 3 высевают в жидкую питательную среду (бульон из настоя сердечной.мышцы,

рН 7,6). После подращивания при 37°С в течение 5-6 ч пересевают на 2%-ный агар из настоя сердечной мышцы (рН 7,6) и инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч. Выросшие колонии тест-штамма и среда имеют коричневое окрашивание. Проводят сравнительное исследование колоний штаммов 1, 2, 3 и КМ-18, отбирают колонии, сходные по морфологии и наличию пигмента с тестштаммом.

П р и м е р2. Применение штамма V. cholerae КМ-18 019 серовара в качестве тест-штамма при выращивании культур на питательных средах, обогащенных аминокислотами.

Штамм V. cholerae. КМ-18 019 серовара и исследуемые на меланогенез штаммы выращивают на агаре из настоя сердечной мышцы (рН 7,6) с добавлением 0,1 % L-фени- лаланина и L-тирозина или L-тиронина и Lдистеина при 37°С в течение 24 ч. Указанные условия культивирования способствуют образованию пигмента.

Примерз. Использование штамма V, cholerae KM-18 019 серовара как эталонного при качественном определении меланина.

Отобранные колонии изучаемых штаммов и культуру эталонного штамма пересевают в пробирку, содержащую 5 мл бульона

из настоя сердечной мышцы (рН 7,6), и инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Затем для доказательства наличия пигмента меланина к жидким культурам в одну пробирку добавляют 15% Н202, в другую- раствор

KMnO/i (по каплям). Питательная среда у эталонного штамма обесцвечивается. При наличии меланина у исследуемых штаммов также должно произойти обесцвечивание. При добавлении небольшого количества

FeCia (по каплям) в среде с наличием меланина образуется тонкодисперсный осадок коричневого цвета, по мере увеличения количества РеС1з осадок исчезает.

Использование предлагаемого штамма,

продуцирующего меланин, как эталонного ускоряет выполнение экспериментов в научных исследованиях, при изучении меланогенеза у холерных и энтеропатогенных вибрионов.

Формула изобретения

Штамм бактерий Vibrio cholerae-КМ-18 019 серовара - продуцент меланина, используемый в качестве тест-объекта для отбора меланинпродуцирующих штаммов

холерных вибрионов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается нового бактериального штамма - продуцента меланина, который может быть использован в качестве тест-объекта при изучении меланиногенеза у штаммов холерных и эмперопатогенных вибрионов, для которых образование этого пигмента не характерно. Целью изобретение является получение штамма бактерий Vibrio cholerae KM-18 019 серовара - продуцента пигмента меланина. Использование предлагаемого штамма как эталонного ускоряет выполнение экспериментов при изучении меланиногенеза у холерных и энтеропатогенных вибрионов. у Ј