СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОПРОБИОТИКА, СОДЕРЖАЩЕГО ЖИВЫЕ БИФИДОБАКТЕРИИ И ЛАКТОБАКТЕРИИ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов - пробиотиков, и применяется для лечения и профилактики дисбактериозов.

Известно, что клинические проявления дисбактериоза кишечника, как правило, отмечаются на фоне отсутствия или дефицита бифидобактерий и лактобактерий, которые в норме являются основой микрофлоры кишечника людей всех возрастов. Именно бифидобактериям и лактобациллам принадлежит ведущая роль в поддержании барьерных функций кишечника и в жизнедеятельности организма в целом (1). Отсутствие или резкое снижение уровня бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике детей и взрослых является одним из патогенетических факторов длительных кишечных дисфункций и одной из причин, осложняющих течение ряда заболеваний (2).

К настоящему времени арсенал биопрепаратов, предназначенных для восстановления нормофлоры, включает монопрепараты из основных представителей нормофлоры - бифидумбактерин, бифидумбактерин форте, лактобактерии (3). Для того чтобы оказать свое лечебно-профилактическое действие, эти бактерии должны прижиться в кишечнике человека, и чем большее количество их адгезируется с эпителиоцитами кишечника, тем более стойкий клинический эффект будет от применения препарата.

Снижение количества бифидо- и лактобактерий при дисбактериозе ведет к повышению содержания в кишечнике условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, протея, гемолитической кишечной палочки и др.), а также снижает уровень неспецифического иммунитета (4). Поэтому в состав комплексных препаратов-пробиотиков помимо штаммов бифидо- и лактобактерий вводят биологически активные ингредиенты - лизоцим, интерферон, иммуноглобулины, биологически активные пептиды, факторы роста бифидобактерий (5), повышающих уровень иммунитета и элиминирующих условно-патогенные бактерии. Эти бактерийные препараты-пробиотики являются достаточно эффективными лечебно-профилактическими средствами, однако их эффективность в значительной степени ограничена тем, что используемые в их составе в качестве основного действующего начала производственные штаммы бифидо- и лактобактерий, являются чужеродными для каждого конкретного человека.

Известно, что становление нормофлоры кишечника человека начинается с первых дней жизни и от момента заселения кишечника штаммами бифидо- и лактобактерий (чаще всего материнскими), происходит «генетическая детерминация» штаммов в процессе жизни человека. То есть в процессе жизни штаммы становятся строго индивидуальными у каждого человека. Находясь в тесном контакте с клетками эпителиоцитов кишечника, штаммы бифидо-, лактобактерий обмениваются с клетками кишечника генетической информацией и становятся «генетически детерминированными» для данного человека и не приживаются в кишечнике другого человека, даже однояйцевого близнеца (6).

Поскольку сайты адгезии (места прикрепления к слизистой кишечника) для нормофлоры генетически детерминированы, производственные штаммы бифидо- и лактобактерий имеют низкую степень адгезии в кишечнике человека. В результате приема препаратов-пробиотиков из производственных штаммов бифидо- и лактобактерий не происходит приживления бактерий на слизистых кишечника, и бифидо- и лактобактерии транзитом выводятся из организма. Поэтому применять такие препараты нужно длительное время и эффект от их применения часто бывает кратковременным.

Собственные штаммы бактерий (аутоштаммы), выделенные из кишечника отдельного человека и размноженные в производственных условиях, приживаются в кишечнике у данного индивида с эффективностью до 100% и могут за короткое время полностью восстановить микробиоценоз кишечника. Для ускорения лечения дисбактериозов кишечника используется введение аутоштаммов бифидобактерий и лактобацилл. Даже кратковременный курс введения аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий способствует быстрому и эффективному восстановлению микрофлоры кишечника при дисбактериозе. Например, известен способ ускорения лечения дисбактериозов кишечника путем введения аутоштаммов бифидобактерий и лактобацилл [А.с. СССР 1286212, кл. А61К 35/74, опубл. 30.01.1987]. Аутоштаммы выделяли из фекалий путем последовательных десятикратных разведений физиологическим раствором исследуемого материала до 10^-8. Исследуемый материал из различных разведений засевали на соответствующие питательные среды для определения исходных уровней энтеробактерий, энтерококков, стафилококков, лактобактерий, бифидобактерий. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде MPC-4 в наибольшем разведении (10³), и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевали на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевали на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая была использована в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника.

Недостатком известного способа является то, что выделенные аутоштаммы бифидо- и лактобактерий обладают низкой физиологической активностью.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является известный способ получения аутопробиотика [патент РФ 2139070, кл. А61К 35/74, C12N 1/20, опубл. 10.10.1999], содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии с повышенной физиологической активностью, предусматривающий их выделение из фекалий хозяина и использование в виде аутоштаммов для лечения дисбактериозов, при этом бифидобактерии и лактобациллы выделяют одновременно в виде естественного комплекса индигенных микроорганизмов путем разведения содержимого толстой кишки хозяина жидкой селективной питательной средой для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, добавления в него сыворотки крови того же хозяина, культивирования смеси и последующего пересева на питательную среду для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов.

Для этого проводят многократные разведения исследуемого образца жидкой селективной питательной средой, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл путем последовательных десятикратных разведений физиологическим раствором исследуемого материала до 10^-8. Исследуемый материал из различных разведений засевают на соответствующие питательные среды для определения исходных уровней энтеробактерий, энтерококков, стафилококков, лактобактерий и бифидобактерий. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде МРС-4 в наибольшем разведении (10³), и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевают на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевают на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая используется в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника у конкретного человека, от которого был получен биоматериал.

Недостатком известного способа получения аутоштаммов является то, что популяция бифидо- и лактобактерий выделяется непосредственно из фекалий, где они сосуществуют с большим количеством условно-патогенных микроорганизмов и, как правило, особенно при выраженном дисбиозе кишечника, имеют низкую физиологическую активность (уровень кислотообразования, продукция биомассы). Поэтому при известном способе выделения бифидо- и лактобактерий трудно получить биомассу в достаточном количестве, а также с высоким уровнем кислотообразующей и физиологической активности. Кроме этого, при выделении аутоштаммов в кишечнике, как правило, имеется дисбактериоз, поскольку он обнаруживается у 90% населения (7). При дисбактериозе сайты адгезии (места прикрепления микроорганизмов к слизистой кишечника) заняты условно-патогенными бактериями. Для устранения условно-патогенных бактерий и освобождения рецепторов адгезии для бифидо- и лактобактерий назначаются антибиотики, которые в то же время могут привести к усилению степени выраженности дисбактериоза.

Для повышения эффективности лечения дисбиозов важным арсеналом являются препараты из бактерий рода Bacillus, обладающие широким спектром антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов. Они могут заменить антибиотики, не причинив организму никакого вреда (8). Известна также способность бактерий рода Bacillus стимулировать рост и размножение бифидобактерий, а также повышать их физиологическую активность (9).

Задачей изобретения является разработка способа получения аутопробиотика, содержащего биомассу живых бифидобактерий и лактобактерий с повышенной физиологической активностью.

Поставленная задача достигается в предлагаемом способе получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии с повышенной физиологической активностью, предусматривающем их выделение из фекалий хозяина и использование в виде аутоштаммов для лечения дисбактериозов, при этом после выделения изолированных колоний бифидобактерий и лактобактерий их пересевают на жидкие накопительные питательные среды и вносят биомассу бактерий рода Bacillus в количестве 1×10⁸-1×10¹⁰ живых клеток на 1,0 л питательной среды.

Сущность изобретения заключается в том, что после выделения изолированных колоний аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий из биологического материала, их пересевали на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка и в среды вносили биомассу бактерий рода Bacillus (10) в количестве 1×10⁸-1×10¹⁰ живых клеток на 1,0 л среды.

В отличие от близкого аналога при выращивании биомассы аутоштаммов бифидо- и лактобактерий с целью повышения их физиологической активности в среду выращивания дополнительно вносили биомассу бактерий рода Bacillus, которая выделяла метаболиты, стимулирующие рост и уровень физиологической активности штаммов бифидо- и лактобактерий.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1 (по аналогу).

Пробу содержимого толстой кишки отбирают в предварительно взвешенную стерильную емкость. Определяют количество отобранной пробы путем повторного взвешивания контейнера. Для декантаминации биоматериала от транзиторной микрофлоры проводят последовательные десятикратные разведения испытуемого образца физиологическим раствором до 10^-8.

Для выделения бифидобактерий готовят 1 ряд из 10 пробирок со средой Блаурокка. Для выделения лактобактерий готовят 7 пробирок со средой МРС-4. Исследуемый материал из разведений 10^-6 засевают на соответствующие питательные среды для выделения лактобактерий и бифидобактерий. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде МРС-4 в наибольшем разведении (10³), и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевают на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевают на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая используется в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника.

Контроль полученного аутопробиотика осуществляют общепринятыми методами посева на селективные питательные среды: Эндо, Плоскирева, ΜΠΑ для определения посторонней микрофлоры - на этих средах в аэробных условиях рост бактерий отсутствует.

Оценку количественного содержания бактерий аутоштаммов в биомассе аутопробиотика бифидобактерий проводят на среде Блаурокка и лактобактерий на агаризованной среде МРС-4 (путем подсчета колоний в среде Блаурокка в 10^-8, 10^-9 разведениях, на агаризованной среде МРС-4 в 10^-6, 10^-7 разведениях и выражают в КОЕ/ г кишечного содержимого). В биомассе аутопробиотика содержание бифидобактерий составило (1,0-2,4)×10⁹ КОЕ/г, содержание лактобактерий - (1,0-2,5)×10⁷ КОЕ/г. Уровень кислотообразующей активности бифидобактерий составил (104±4) Т° (единиц Тернера).

Пример 2 (по предлагаемому способу).

Подготовку биоматериала и выделение изолированных колоний бифидобактерий и лактобактерий ведут, как в примере 1, но при пересеве изолированных колоний бифидо- и лактобактерий на накопительные жидкие питательные среды (МРС-4 и Блаурокка), добавляют биомассу бактерий штамма Bacillus subtilis 3Н (микробная основа препарата - пробиотика «Бактоспорин») в количестве 1×10¹⁰ клеток на 1,0 л питательной среды и помещают в термостат при 38°С в течение 48 часов. По истечении указанного времени на поверхности среды образуется пленка из бактерий Bacillus subtilis, под ней, в культуральной жидкости, содержится биомасса бифидобактерий или лактобактерий. С поверхности накопительных сред, содержащих биомассу аутоштаммов бифидо- и лактобактерий, убирают пленку с биомассой бактерий Bacillus subtilis. После этого используют биомассу бифидо- или лактобактерий в качестве аутоштаммов.

Контроль полученного аутопробиотика осуществляют путем посева на селективные питательные среды: Эндо, Плоскирева, ΜΠΑ для определения посторонней микрофлоры. На средах Эндо и Плоскирева в аэробных условиях рост бактерий отсутствует. На среде ΜΠΑ вырастают колонии бактерий Bacillus subtilis. Наличие колоний Bacillus subtilis в аутопробиотике бифидо- или лактобактерий является желательным явлением. Обладая бифидогенной активностью (Патент №2174400, опубл. 10.10.2001) бактерии Bacillus subtilis увеличивают количество биомассы бифидобактерий в накопительной среде, что способствует приживлению и размножению аутоштаммов в кишечнике. Bacillus subtilis, обладая антагонистической активностью, осуществляют декантаминацию посторонней микрофлоры в кишечнике, что также облегчает приживление аутоштаммов.

Оценку количественного содержания бактерий аутоштаммов в биомассе аутопробиотика бифидобактерий проводили на среде Блаурокка и лактобактерий на среде МРС-4. В биомассе аутопробиотика содержание бифидобактерий составляет (5,0-7,4)×10⁹, содержание лактобактерий - (7,0-9,5)×10⁷. Уровень кислотообразования бифидобактерий составляет (118±3)°Т.

Получение аутоштаммов по примеру №2 позволило повысить количество биомассы бифидо- и лактобактерий в накопительных средах и повысить уровень кислотообразующей активности бифидобактерий по сравнению с примером №1.

Пример 3 (по предлагаемому способу).

Подготовку биоматериала и выделение изолированных колоний бифидобактерий и лактобактерий ведут, как в примере 1, при пересеве изолированных колоний бифидо- и лактобактерий на накопительные жидкие питательные среды (МРС-4 и Блаурокка), добавляют биомассу бактерий штамма Bacillus subtilis 11B (микробная основа препарата-пробиотика «Витоспорин») в количестве 1×10⁹ клеток на 1,0 л питательной среды и помещают в термостат при 38°С в течение 48 часов. По истечении указанного времени на поверхности среды образуется пленка из бактерий Bacillus subtilis 11В, под ней в культуральной жидкости содержится биомасса бифидобактерий или лактобактерий. С поверхности накопительных сред, содержащих биомассу аутоштаммов бифидо- и лактобактерий, убирают пленку с биомассой бактерий Bacillus subtilis. В биомассе аутопробиотика содержание бифидобактерий составляет (8,5-9,2)×10⁹, содержание лактобактерий - (8,0-10,0)×10⁷. Уровень кислотообразования бифидобактерий составляет (121±3)Т°. После этого используют биомассу бифидо- или лактобактерий в качестве аутоштаммов.

Пример 4 (по предлагаемому способу).

Подготовку биоматериала и выделение изолированных колоний бифидобактерий и лактобактерий ведут как в примере 1, при пересеве изолированных колоний бифидо- и лактобактерий на накопительные жидкие питательные среды (МРС-4 и Блаурокка), добавляют биомассу бактерий штамма Bacillus cereus (микробная основа препарата-пробиотика «Бактисубтил») в количестве 1×10⁸ клеток на 1,0 л питательной среды и помещают в термостат при 38°С в течение 48 часов. По истечении указанного времени на поверхности среды образуется пленка из бактерий Bacillus cereus, под ней в культуральной жидкости содержится биомасса бифидобактерий или лактобактерий. С поверхности накопительных сред, содержащих биомассу аутоштаммов бифидо- и лактобактерий, убирают пленку с биомассой бактерий Bacillus subtilis. В биомассе аутопробиотика содержание бифидобактерий составляет (6,0-7,8)×10⁹, содержание лактобактерий - (7,5-9,5)×10⁷. Уровень кислотообразования бифидобактерий составляет (120±3)Т°. После этого используют биомассу бифидо- или лактобактерий в качестве аутоштаммов.

Внесение биомассы бактерий рода Bacillus в количестве менее 1×10⁸ живых клеток на 1,0 л питательной среды не обеспечивает получение аутопробиотика с высокой физиологической активностью. А внесение биомассы бактерий рода Bacillus в количестве более 1×10¹⁰ живых клеток на 1,0 л питательной среды не приводит к дальнейшему росту физиологической активности получаемого аутопробиотика.

Контроль полученного аутопробиотика по предлагаемому способу с использованием разных штаммов бактерий рода Bacillus осуществляют путем посева на селективные питательные среды: Эндо, Плоскирева, ΜΠΑ для определения посторонней микрофлоры. На средах Эндо и Плоскирева в аэробных условиях рост бактерий отсутствует. На среде ΜΠΑ вырастают колонии бактерий рода Bacillus.

В биомассе аутопробиотика, полученному по предложенному способу (пример 2, 3, 4), содержание бифидобактерий составило (5,0-9,2)×10⁹ КОЕ/г, содержание лактобактерий - (7,0-10)×10⁷ КОЕ/г. Уровень кислотообразования бифидобактерий составил 118-121°Т. Данные показатели превышают физиологическую активность аутопробиотика - аналога.

Таким образом, предложен способ получения аутопробиотика из естественного микробиоценоза бифидобактерий и лактобацилл толстого кишечника, в котором с целью стимуляции роста и размножения бифидо- и лактобактерий, повышения их физиологическую активности и лучшего приживления в кишечнике аутоштаммов, в накопительные среды биомасс бифидо- и лактобактерий вносят биомассу бактерий рода Bacillus.

Литература

1. Воробьев А.А., Лыкова Е.Л. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Микробиология. 1999, №6. С. 102-105.

2. Гончарова Г.И. и др. Микробная экология кишечника в норме и при патологии // Антибиотики и химиотерапия, 1989, т. 34, №6. С. 462-465.

3. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М.: Медицина. 1978. С. 94-101.

4. Шендеров Б.А. «Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. /Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрокталогии, 1998, №1. С. 61-65.

5. Бондаренко А.В. и др. Пути совершенствования этиопатогенетической терапии дисбактериозов // Микробиология. 1998, N 5. С. 96-101.

6. Коршунов В.М. и др. «Коррекция микрофлоры кишечника при химиотерапевтических дисбактериозах с помощью аутоштаммов бифидобактерий и лактобактерий // ЖМЭИ, 1985, №9. С. 20-25.

7. Воробьев А.А. и др. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины// Вестник РАМН, 1997, №2. С. 4-6.

8. Осипова И.Г. и др. Споровые пробиотики // Микробиология, 2002 г., №3. С. 113-119.

9. Нуртдинова А.Н. «Разработка и изучение биологических свойств комплексного препарата - бифидоспорина». Автореферат канд. дис., Уфа, 2003, 22 с.

10. Патент РФ №2182172 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности», опубл. 13.10.2002. БИ №29.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов - пробиотиков. Способ предусматривает выделение бифидобактерий и лактобактерий из фекалий хозяина. При этом после выделения изолированных колоний бифидобактерий и лактобактерий их пересевают на жидкие накопительные питательные среды и вносят биомассу бактерий рода Bacillus в количестве 1×10⁸-1×10¹⁰ живых клеток на 1,0 л питательной среды. Изобретение позволяет получить аутопробиотик с повышенной физиологической активностью. 4 пр.

Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии с повышенной физиологической активностью, предусматривающий их выделение из фекалий хозяина и использование в виде аутоштаммов для лечения дисбактериозов, отличающийся тем, что после выделения изолированных колоний бифидобактерий и лактобактерий их пересевают на жидкие накопительные питательные среды и вносят биомассу бактерий рода Bacillus в количестве 1×10⁸-1×10¹⁰ живых клеток на 1,0 л питательной среды.