СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОГО ГРИППА ПТИЦ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/02 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарии, более конкретно к отысканию средств для профилактики и лечения гриппа птиц.

Высокая контагиозность гриппа, отсутствие специфических средств лечения и профилактики, чрезвычайная изменчивость и способность возбудителя длительно персистировать в различных организмах способствуют быстрому распространению инфекции и затрудняют осуществление ветеринарных мероприятий по предупреждению и ликвидации заболевания. Возбудитель передается преимущественно воздушно-капельным путем, а также через инфицированные корма и воду и выделения их жизнедеятельности. Вирусы гриппа (ВГ) типа А инфицируют различные виды птиц и млекопитающих, включая людей, лошадей, свиней, китов, тюленей и т.д. Они характеризуются высокой антигенной гетерогенностью поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) и представлены согласно номенклатуре 15 подтипами НА и 9 NA. Естественными хозяевами вирусов гриппа А являются птицы водного и околоводного комплексов. От птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков. Несмотря на антигенную гетерогенность вирусов гриппа, только четыре подтипа НА: Н1-Н3 и Н5 и два NA (N1-N2) циркулировали среди людей. Вспышка гриппа среди людей в Гонконге в 1997, вызванная птичьим вирусом гриппа A/H5N1, показала впервые, что преодоление межвидового барьера птица-человек может происходить в естественных условиях. Это был первый случай прямой передачи вируса от птиц человеку. Из 18 госпитализированых больных 6 умерли, не выявлена передача вируса от человека к человеку. В 2003-2004 г. количество инфицированных в разных странах Юго-Восточной Азии возросло до 53, причем 43 человека скончалось. Ситуация осложняется возможностью формирования нового патогенного реассортанта между вирусами гриппа птиц (кур в данном случае) и эпидемическими вирусами гриппа человека. В связи с этим для купирования распространения инфекции на передний план выступает комплекс санитарно-гигиенических мер, в основе которого лежит применение высокоактивных средств дезинфекции и санирования.

Известны средства для профилактики респираторных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц - йодиноколь, йодинол и йодтриэтиленгликоль, содержащие йод в положительно валентной форме. К их числу также относят препарат аэрозольного применения для борьбы с инфекционным ларинготрахеитом, колибактериозом и аспергиллезом птиц (SU 566420 [1]).

Однако эти средства недостаточно эффективны в отношении вирусов гриппа, не обладают остаточным действием. Кроме того, по причине часто встречающейся повышенной чувствительности среди людей, в том числе работников животноводства, к препаратам йода, обслуживающий персонал во время распыления растворов, выдержки необходимой экспозиции и активного проветривания в помещение не допускается, что создает трудности при проведении дезинфекционных мероприятий.

Известно средство профилактики гриппа сельскохозяйственных животных и птиц, включающее низкомолекулярный гликоль, органическую или борную кислоту и конституенс и катионное поверхностно-активное вещество, твин 80, или твин 20, или твин 60 (RU 2012332 [2]).

Недостатком известного средства является его относительно низкая эффективность, а также то, что средство, приготовленное по предлагаемой рецептуре, используют для дезинфекции помещений свинарников и птичников путем мелкокапельного орошения поверхности, а также для заправки дезбарьеров (пропитка дезковриков), т.е. сами животные и птица лечебному или профилактическому воздействию не подвергаются.

Известно средство для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц, представляющее собой экстракт бересты, производимый ООО «Березовый мир» (RU 2283126 [3]).

К недостаткам известного средства следует отнести относительно невысокую эффективность, поскольку, как следует из описания к патенту, испытания проводились на мышах при общем количестве животных 30 экземпляров по 10 в каждой из групп, и выживаемость при максимальной дозе препарата составила 70% (см. табл.6 в [3]).

Заявляемое в качестве изобретения средство для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц направлено на расширение арсенала лекарственных средств.

Указанный результат достигается тем, что предлагается использовать полисурьмин в качестве средства для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц.

Препарат полисурьмин (латинское название polysurminym) является неорганическим ионнообменным полимером. Относится к фармакологической группе детоксицирующих средств. Активным веществом является порошок белого цвета без запаха и вкуса, нерастворимый в воде и спирте. Включен в перечень лекарственных средств Приказом Минздрава РФ от 31.12.1999 г. №472. Известным назначением полисурьмина является выведение из организма радионуклидов (см. Корзун В.Н. и др. International Journal of Radiation Medicine, 1999, 2(2): 75-91 [4]). Связывает радиоактивные изотопы стронция и предупреждает их всасывание из пищеварительного тракта. Известно применение полисурьмина при лечении радиогенного зоба (RU 2076682 [5]), а также для лечения радиационных патологий, вызванных попаданием радионуклидов внутрь организма (RU 2063229 [6]).

Использование полисурьмина для лечения птичьего гриппа не известно.

Сущность заявляемого изобретения поясняется примерами его реализации.

Исследование вирулицидных свойств препарата "Полисурьмин".

Пример 1. Использовали высокопатогенный штамм вируса гриппа A (H5N1), выделенный во время эпизоотии среди домашних птиц в Новосибирской области в июле 2005 года. Штамм активно репродуцируется в культурах клеток СПЭВ, которые использовали для изучения инфекционных свойств вируса. Также использовали питательные среды, сыворотки, антибиотики, стерильную пластиковую посуду одноразового пользования для культивирования вируса гриппа птиц.

Препарат "Полисурьмин" использовался в виде тонко измельченного порошка. Суспензию препарата получали на дистиллированной воде или на физиологическом растворе. Осаждение полисурьмина из суспензии проводили путем центрифугирования при 4°С в течение 10-15 мин. Полученную надосадочную жидкость использовали для изучения вирулицидной активности в отношении вируса гриппа А (H5N1).

Полученные результаты представлены в виде таблиц.

Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что препарат "Полисурьмин" в виде суспензии на физиологическом растворе или дистиллированной воде в разных концентрациях способен активно подавлять инфекционную активность вируса гриппа H5N1. Полное подавление инфекционной активности вируса наблюдали при добавлении в суспензию, содержавшей концентрацию полисурьмина 3,12 мг в мл и экспозиции в течение 1 часа вируса гриппа. Суспензия полисурьмина в концентрации препарата 1,5 мг в мл была способна подавлять инфекционную активность вируса гриппа А в 10000 и более раз в течение 30 мин или 1 часа. Содержание вируса гриппа А в физиологическом растворе без препарата в этих условиях не приводило к снижению его инфекционной активности для культур клеток СПЭВ (табл.1).

Пример 2. Была исследована способность физиологического раствора после осаждения полисурьмина инактивировать инфекционную активность вируса гриппа птиц. В этом случае получали суспензию полисурьмина на физрастворе (0,3 мг в мл), а после естественного осаждения препарата в течение суток жидкость слегка оплесцировала. Надосадок отбирали и вносили в емкость с надосадочной жидкостью вирус гриппа А на 1 час, после чего исследовали остаточную инфекционность. Как видно из данных табл.2, инфекционная активность была равна менее чем 1,01 g, в то время в контрольном растворе без препарата титры вируса гриппа составили 7,01 g ТЦД 50/мл.

Во втором варианте опыта суспензию полисурьмина осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин и исследовали надосадочную жидкость, добавляя в нее вирусосодержащий материал. Как оказалось, осветленная центрифугированием при 2000 об/мин, а затем и при 16000 об/мин надосадочная жидкость сохраняла высокую способность инактивировать инфекционные свойства вируса гриппа птиц H5N1. Фактически происходила полная инактивация вируса при достаточно высоком титре вируса гриппа в контроле - 6,01 g ТЦД 50/мл.

Из данных табл.2 видно, что ресуспендированный в небольшом количестве физраствора осадок полисурьмина также способен полностью подавлять инфекционную активность вируса гриппа в течение 1 часа.

Данные табл.3 свидетельствуют о том, что надосадочная жидкость, полученная после осаждения полисурьмина центрифугированием, сохраняет высокие вирулицидные свойства и в условиях ее разведения в 2 раза, а разведение ее в 4 раза приводило к снижению инфекционной активности вируса почти в 100000 раз по сравнению с контрольным опытом.

Вирулицидные свойства надосадочной жидкости снижаются при хранении ее в течение 5 суток при 4°С. Исследования показали, что в этих условиях раствор полисурьмина был способен подавлять инфекционную активность вируса гриппа А птиц в 1000 раз (см. табл.3).

Как свидетельствуют данные, представленные в табл.4, вирулицидные свойства физиологического раствора после осаждения препарата "Полисурьмин" в концентрации 3,0 мг в мл способствовали полной инактивации инфекционных свойств вируса гриппа А птиц H5N1 в течение 10 мин после воздействия надосадочной жидкости на вирусосодержащий материал, инфекционный титр которого достигал 4,01 g ТЦД 50/20 мкл. Меньшие концентрации полисурьмина не приводили к способности физиологического раствора подавлять инфекционные свойства вируса гриппа птиц.

Пример 3. Исследование вирулицидных свойств препарата, полученного пропусканием воды через порошок полисурьмина.

В табл.5 представлены данные, полученные при прохождении воды через картридж, наполненный полисурьмином через каждые 5 л. Вода, прошедшая через картридж, содержащий препарат полисурьмин, обладает слабой вирулицидной активностью в отношении вируса гриппа А птиц. Лишь проба №6 была способна в течение 30 мин снизить инфекционную активность вируса гриппа А в 100 раз. Однако уже в 7-й пробе не было обнаружено вирулицидных свойств воды.

Пример 4. Исследование вирулицидных свойств надосадочной жидкости в зависимости от срока хранения.

Из данных, представленных в табл.6, видно, что надосадочная жидкость в течение 4 часов сохраняла максимальную вирулицидную активность в отношении вируса гриппа. Однако через 4 дня вирулицидные свойства ее снижались, и она была способна снижать инфекционную активность вируса в 1000 раз, а через 8 дней хранения надосадочной жидкости при 4°С, титры вируса гриппа А после 30-минутной экспозиции в надосадочной жидкости снижались в 100 раз. Эти данные свидетельствуют о снижении вирулицидных свойств надосадочной жидкости, содержащей полисурьмин по мере хранения при 4°С.

Пример 5. Изучение острой и хронической токсичности полисурьмина на белых мышах.

Изучение токсичности полисурьмина проводили на белых мышах с массой тела 18-20 г (по 5 голов на каждую испытываемую дозу). Для определения острой токсичности препарат вводили мышам внутримышечно и перорально, однократно, в дозах 250, 500, 750, 1000 и 2000 мг/кг, а хронической токсичности, трехкратно, с интервалом три дня - 250, 500 и 1000 мг/кг массы тела. При этом учитывали их поведение, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к корму, подвижность, частоту дыхания, время возникновения и характер интоксикации, сроки гибели или выздоровления. Кроме того, брали кровь для гематологического исследования, производили патвскрытие для сравнительной оценки органов и тканей с органами контрольной группы.

Было установлено, что препарат, независимо от дозы и метода введения, не обладал острой и хронической токсичностью. За весь период наблюдения все мыши в обоих случаях оставались живы. Однако, максимальные дозы препарата 1000 и 2000 мг/кг приводили к увеличению количества лейкоцитов (15,8-16,7×10 мм), снижению гемоглобина и количества эритроцитов (5,6-6,0×10 мм) и лимфоцитов (53,0-58,0%).

Пример 6. Использование лекарственного средства полисурьмина в очаге по гриппу птиц.

В Республиканскую ветеринарную лабораторию были доставлены трупы птицы, принадлежащие индивидуальному сектору селения Параул Карабудахкентского района Республики Дагестан. По описаниям ветеринарного врача, обслуживающего данное хозяйство, у птицы наблюдались следующие клинические признаки: депрессия, сонливость, хрипы, синюшность гребня и сережек, отек в области головы и шеи, диарея, геморрагии на коже конечностей.

Патологические изменения. При вскрытии трупов обнаружены: ринит, синусит, конъюнктивит, отек подкожной клетчатки в области головы и шеи, геморрагии в трахее, в скелетных мышцах, на слизистых пищеварительного тракта, особенно в кишечнике в области бифуркации. Кровоизлияния на слизистых ободочках железистого желудка наблюдались в виде множественных точек, пятен и полосок.

Из органов доставленной птицы с помощью ПЦР был выделен генетический материал вируса гриппа птиц (H5N1). Для проведения испытания препарата "Полисурьмин" на больной птице в данном индивидуальном хозяйстве, поголовье разделили на опытную (600 голов) и контрольную (50 голов) группы.

Полисурьмин - мелкокристаллический порошок белого цвета без запаха. Нерастворим в воде. Его разводили из расчета 1 кг на 3 л кипяченой, остуженной воды с последующим отстаиванием 4-5 часов. Надосадочную жидкость слили в емкость, довели ее до 3 л путем подливания кипяченой, остуженной воды. Для выпаивания 1 л надосадочной жидкости развели в 100 л водопроводной воды и разлили в приготовленные для этой цели поилки.

Падеж поголовья птицы на следующий день после выпойки препаратом составил: в опытной группе 70 голов (12%), в контрольной - 12 голов (24%).

На следующий день после выпойки в Республиканскую ветеринарную лабораторию были доставлены по 10 голов свежепавшей птицы из опытной и контрольной групп. При вскрытии обнаружены аналогичные описанным выше патолого-анатомические изменения как в контрольной, так и в опытной группе.

Однако при исследовании в ПЦР контрольной группы птицы был выделен генетический материал вируса гриппа птиц (H5N1), тогда как из органов птицы опытной группы генетический материал вируса гриппа птиц не выделялся.

Таким образом полисурьмин является высокоэффективным средством для лечения и профилактики вирусного гриппа птиц.

Таблица 1.Вирулицидное действие суспензии полисурьмина в различных концентрациях в отношении высокопатогенного варианта вируса гриппа H5N1Инфекционный титр вируса гриппа H5N1 для культур клеток СПЭВ (в 1 g ТЦД50/мл)Концентрация препарата (мг/мл)502512,56,253,121,5Контроль вирусаВирус + суспензия препарата - 30 мин0000<1,02,56,7Вирус + суспензия препарата - 1 час000002,06,7

Таблица 2.Способность растворов после осаждения препарата "Полисурьмин" (0,3 мг в мл) инактивировать инфекционные свойства высокопатогенного варианта вируса гриппа H5N1Варианты опыта1 g ТЦД50/млВарианты опыта1 g ТЦД50/млНадосадок после естественного осаждения<1,0Суспензия полисурьмина до центрифугирования1,2Осадок0Надосадок после центрифугирования2000 об/мин 5 мин016000 об/мин 10 мин0Без препарата7,0Физиологический раствор без препарата6,0

Таблица 3.Способность разных разведений надосадочной жидкости после осаждения препарата "Полисурьмин" снижать инфекционную активность вируса гриппа H5N1 в течение 30 мин и 1 часа (исходная концентрация препарата 3,0 мг в мл)Разведние надосадочной жидкостиИнфекционный титр вируса гриппа H5N1 для культур клеток СПЭВ (в 1 g ТЦД50/мл)30 мин60 мин4 сутокЦельный раствор005,01:200Н.д.1:44,83,2Н.д.1:87,05,0Н.д.Контроль вируса8,08,08,0

Таблица 4.Вирулицидное действие надосадочной жидкости, полученной после осаждения полисурьмина, на вирус птичьего гриппа A H5N1 (через 10 мин после обработки)Титр вируса гриппа птиц для культур клеток СПЭВВирулицидное действие надосадочной жидкости, полученной после осаждения полисурьмина в концентрации (мг/мл)30,03,00,30,3:20,3:4контроль вирусав 1 g ТЦД50/мл003,04,03,84,0

Таблица 5.Вирулицидное действие воды, прошедшей через картридж, содержащий полисурьмин, на вирус гриппа А птиц H5N1Титр вируса гриппа птиц для культур клеток СПЭВВирулицидные свойства проб воды, отобранных по мере прохождения через картридж, наполненный полисурьминомНомера проб воды, обработанных вирусом гриппа А птиц1234567Контроль вирусав 1 g ТЦД50/мл5,54,24,84,84,03,55,55,5

Таблица 6.Динамика сохранения вирулицидных свойств надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата "Полисурьмин" в отношении вируса гриппа А птиц H5N1Титр вируса гриппа птиц для культур клеток СПЭВ
в 1 g ТЦД50/мл Титры вируса гриппа А птиц H5N1 после 30 - минутной экспозиции в надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата "Полисурьмин" (время получения надосадочного раствора)4 часа4 дня8 днейконтроль вирусаНадосадок после осаждения при 2000 об/мин04,15,07,0Надосадок после осаждения при 16000 об/мин06,07,09,0

Изобретение относится к области ветеринариии. В качестве средства для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц применяют полисурьмин. Полисурьмин подавляет инфекционную активность вируса гриппа. 6 табл.

Применение полисурьмина в качестве средства для профилактики и лечения вирусного гриппа птиц.