СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 

В настоящее время доказано, что цитокины играют ключевую роль в регуляции процессов воспаления. Выделяют группу противовоспалительных цитокинов, объединенных по их доминирующему биологическому действию. Противовоспалительные цитокины: интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), фактор некроза опухоли альфа (ФНО_α) принимают участие в индукции и дальнейшем развитии процессов воспаления и повреждения тканей. Противовоспалительные цитокины являются мощными аутокринными стимуляторами защитных функций мононуклеарных клеток: обеспечивают их мобилизацию в очаг воспаления, являются хемоаттрактантами, повышают экспрессию поверхностных рецепторов, опосредующих фагоцитоз, усиливают микробицидность за счет индукции синтеза супероксидных и нитроксидных радикалов (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета. // Иммунология. - 1995. - N 3. - C. 30-36).

С другой стороны, противовоспалительные цитокины: интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-10 (ИЛ-10), интерлейкин-13 (ИЛ-13), трансформирующий фактор роста бета ТФР_β) являются антагонистами противовоспалительных цитокинов, оказывая некоторые противоположные эффекты при развитии воспалительной реакции (Фрейдлин И. С. Ключевая позиция макрофагов в цитокиновой регуляторной сети. // Иммунология. - 1995. - N 3 - С. 45-48). Противовоспалительные цитокины выступают как синергисты в подавлении продукции супероксидных и нитроксидных радикалов, действуя на фермент, участвующий в их образовании. Поэтому несомненный интерес представляет наличие другого ингибирующего механизма действия цитокинов на свободнорадикальные процессы, а именно способность непосредственно перехватывать свободные радикалы (антиокислительная активность).

Рекомбинантные и природные цитокины сейчас достаточно широко используются в качестве терапевтических средств. Например, способ локальной аутолимфокинотерапии, основанный на применении естественного комплекса цитокинов, с успехом используется в клинике заболеваний, связанных с хирургическим или травматическим повреждением тканей (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция. // Иммунология. - 1995. - N 1 - с. 4-7). Использование данного способа терапии ускоряет процессы заживления ран и способствует формированию более нежного рубца в месте повреждения.

Соответственно необходим способ определения противоспалительной активности цитокинов как терапевтического средства, что особенно важно при дальнейшем поиске лекарственных средств, включающих в свой состав цитокины и их комплексы.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа оценки противовоспалительной активности цитокинов является способ, представляющий собой определение ингибирующего действия рекомбинантного цитокина - трансформирующего фактора роста β на продукцию супероксидных и нитроксидных радикалов кератиноцитами (Heck D., Laskin D. Epidermal growth factor supresses nitric oxide and nitrogen peroxile production by keratinocytes. // J. Biol. Chem. - 1992. - v. 267. - p. 21277-21280).

В этом случае определяли ингибирующее действие ТФР_β на фермент NO-синтазу, катализирующий образование нитроксидного радикала, путем измерения уровня m-РНК этого фермента методом иммуноблоттинга. ТФР_β ингибировал образование нитроксидных радикалов, что указывает на его противовоспалительную активность. Недостатком такого способа оценки является то, что он дает возможность оценить ингибирующее действие ТФР_β только на фермент, образующий радикалы, но не на сами радикалы, хотя последний механизм может вносить серьезный вклад в противовоспалительную активность данного цитокина. Помимо этого недостатками этого способа являются также его трудоемкость, длительное время проведения и необходимость наличия дорогостоящих реактивов. Предлагаемый способ оценки противовоспалительной активности цитокинов имеет такие преимущества, как относительно высокая чувствительность (нг-мкг), достаточно короткое время исследования (20-30 минут на одну пробу с контролем), простота исполнения, а также доступность реактивов.

Техническим результатом предлагаемого способа является упрощение способа оценки противовоспалительной активности цитокинов. Технический результат достигается за счет оценки нового механизма противовоспалительного действия цитокинов - способности перехватывать свободные радикалы. Определение данной способности проводят с использованием модельной системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол (Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. и др. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол. // Вопросы мед. химии - 1998 - т. 44 - N 1 - с. 70-76).

Способ осуществляют следующим образом. Для определения противовоспалительной активности цитокинов проводятся измерения хемилюминесценции модельной системы гемоглобин - перекись водорода - люминол в присутствии тестируемого вещества и без него (контроль).

Сначала готовят реакционную среду, в состав которой входят следующие компоненты: 0,29 мкМ гемоглобина и 9,7 мкМ люминола в фосфатном буфере (50 мкМ KH₂PO₄, 100 мкМ ЭДТА, pH 7,4), общий объем 5 мл. Затем производят инициирование свободнорадикального окисления люминола введением в реакционную среду 27 мкМ перекиси водорода. Регистрируют хемилюминесценцию, сопровождающую окисление люминола в течение 10 минут. Максимальную интенсивность свечения в данном случае считают как интенсивность в контроле. Далее готовят новую реакционную среду, в тех же пропорциях добавляя все компоненты, а кроме того, еще и исследуемое вещество. Регистрируют максимальную интенсивность хемилюминесценции, считают ее как интенсивность свечения в эксперименте.

Подсчитывают соотношение интенсивности в эксперименте к интенсивности в контроле (I/I₀). Считают, что исследуемый цитокин или комплекс цитокинов обладает противовоспалительной активностью в том случае, когда I/I₀ ≤ 0,5. То есть добавление в модельную систему цитокинов, обладающих противовоспалительной активностью, должно вызывать уменьшение интенсивности хемилюминесценции на 50% по сравнению с контролем.

Пример 1. Определение противовоспалительной активности естественного комплекса цитокинов. Естественный комплекс цитокинов (ЕКЦ) представляет собой супернатант стимулированных фитогемагглютинином лимфоцитов, получаемых из периферической крови свиньи. Была выявлена биологическая активность цитокинов, входящих в состав комплекса. Так, специфическая активность ИЛ1β составила 3200±530 ЕД/мг белка, ИЛ6 - 700±100 ЕД/мг белка, ФНО_α - 212±53 ЕД/мг белка, МИФ - 3200±80 ЕД/мг белка. Количество ТФР_β1 было определено методом иммуноферментного анализа и составило 5860±230 пг/мг (Kovalchuk L.V., Gankovskaya L.V. // J. Ocular Pharmacology. - 1996. - v. 12. - N 3. - p. 271).

Для определения противовоспалительной активности ЕКЦ измеряли хемилюминесценцию модельной системы гемоглобин - пероксид водорода - люминол без добавления ЕКЦ и с добавлением различных концентраций ЕКЦ. Реакционная среда общим объемом 5 мл содержала 0,29 мкМ гемоглобина и 9,7 мкМ люминола в фосфатном буфере (50 мкМ KH₂PO₂, 100 мкМ ЭДТА, pH 7,4). Инициирование свободнорадикального окисления люминола осуществляли введением 27 мкМ перекиси водорода. Регистрировали хемилюминесценцию в течение 10 минут. При добавлении в модельную систему ЕКЦ в количестве от 1 до 50 мкг (концентрацию белка в супернатанте определяли по методу Бредфорда) происходило дозозависимое уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы (фиг. 1).

Уменьшение интенсивности свечения модельной системы на 50% ЕКЦ вызывал в количестве 16 мкг. Отсюда можно сделать вывод, что ЕКЦ обладает противовоспалительной активностью в количествах более 16 мкг.

Пример 2. Определение противовоспалительной активности рекомбинантного трансформирующего фактора роста β1. Определение противовоспалительной активности рекомбинантного ТФР_β производили по способу, описанному выше. Добавление в модельную систему ТФР_β в количествах от 1 до 100 нг также вызывало дозозависимое уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы (фиг. 2). Количество ТФР_β, вызывающее уменьшение максимальной интенсивности хемилюминесценции модельной системы на 50%, составляет 0,01 мкг (0,4 нМ).

Для сравнения добавляли в реакционную среду 0,01 мкг сывороточного человеческого альбумина, используемого в качестве наполнителя для рекомбинантного ТФР_β, изменений параметров хемилюминесценции не происходило. Количество альбумина, уменьшающее максимальную интенсивность хемилюминесценции на 50%, составляет 100 мгк (1,45 мкМ).

Таким образом, рекомбинантный ТФР_β обладал большей способностью перехватывать свободные радикалы, образующиеся в данной модельной системе, чем альбумин, т.е. обладал наибольшей противовоспалительной активностью.

Пример 3. Определение противовоспалительной активности цитокинов слезной жидкости кроликов. Измеряли противовоспалительную активность цитокинов в слезной жидкости в норме, после хирургического повреждения тканей склеры (антиглаукоматозная операция) и во время лечения данного повреждения аутологичным комплексом цитокинов.

Известно, что в норме в слезной жидкости определяются такие цитокины, как ФНО_α в 30% случаев, и ТФР_β в 100% случаев, что может оказывать противовоспалительное действие (Еричев В.П., Ганковская Л.В. и др. The role of natural cytokine complex for the prophilactics of extra scaring after glaucoma surgery. //2^nd International glaucoma symposium. - Israel - 1998 - p. 138).

По способу, описанному выше, готовили реакционную среду, в которую добавляли 200 мкл слезной жидкости кроликов. Производили регистрацию хемилюминесценции в контроле и в присутствии 200 мкл слезной жидкости кроликов. Были получены следующие результаты: 200 мкл слезной жидкости здоровых кроликов вызывало уменьшение интенсивности хемилюминесценции модельной системы на 65%, 200 мкл слезной жидкости кроликов, собранной на 14-е сутки после операции у леченых природным комплексом цитокинов и нелеченных кроликов, уменьшение интенсивности хемилюминесценции составило 74 и 32% соответственно (фиг. 3). То есть наибольшей способностью перехватывать свободные радикалы обладала слезная жидкость кроликов после 14 суток инстилляций ЕКЦ, что позволяет сделать предположение о том, что цитокины могут вносить вклад в противовоспалительную активность слезной жидкости наряду с другими ее компонентами. Высокая противовоспалительная активность слезы на 14-й день после операции и инстилляций ЕКЦ соответствует клинической картине заживления рубца.

Итак, данным способом показано наличие противовоспалительной активности рекомбинантного ТФР_β и ЕКЦ. При определении противовоспалительной активности слезной жидкости показана возможность вклада цитокинов в антиокислительную активность слезы. Оценка противовоспалительной активности цитокинов посредством определения их способности перехватывать свободные радикалы может иметь важное значение для объяснения патогенеза некоторых воспалительных заболеваний и обоснования применения цитокинов в качестве терапевтических средств.

Способ относится к иммунологии, предназначен для оценки противовоспалительной активности цитокинов. Проводят оценку ингибирования свободных радикалов цитокинами в модельной системе гемоглобин - пероксид водорода - люминол. Для этого определяют показатель интенсивности хемилюминесценции в модельной системе гемоглобин - пероксид водорода - люминол. Затем добавляют в модельную систему исследуемый цитокин в количестве 0,1-100 нг и повторно определяют показатель интенсивности хемилюминесценции. При снижении данного показателя на 50% и более относительно исходного уровня оценивают активность цитокина как противовоспалительную. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ оценки противовоспалительной активности цитокинов, включающий оценку ингибирования супероксидных радикалов, отличающийся тем, что оценку ингибирования осуществляют по инактивации свободных радикалов, при этом определяют показатель интенсивности хемилюминесценции в модельной системе гемоглобин - пероксид водорода - люминол, добавляют оцениваемый цитокин в количестве 0,1 - 100 нг и повторно определяют показатель интенсивности хемилюминесценции и при его снижении на 50% и более относительно исходного уровня оценивают активность цитокина как противовоспалительную. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество добавляемого в модельную систему цитокина выбирают в соответствии с содержанием его в сыворотке крови здорового донора.