СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАКТИВА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/25 

Настоящее изобретение относится к химии биологически активных веществ белковой природы, точнее к получению реактивов для качественного и количественного определения эндотоксинов грамотрицательных бактерий.

Сущность изобретения сводится к разработке способа получения лиофилизированного лизата амебоцитов гемолимфы краба рода Paralithodes, который может быть использован в качестве чувствительного реактива для определения бактериальных эндотоксинов в различных средах.

Реактивы для определения бактериальных эндотоксинов в настоящее время получают из мечехвостов Limulus polyphemus (LAL-реактив, Limulus Amebocite Reagent), Tachipleus tridentates (TAL-реактив) и других видов. Эти реактивы нашли широкое применение в медицине и фармацевтике для проведения экспресс-анализа на содержание эндотоксинов в различных субстанциях и готовых препаратах. В комплект соответствующего теста для проверки среды на эндотоксин, например, LAL-теста, кроме LAL-реактива входят контрольный стандарт эндотоксина для построения калибровочной кривой и апирогенная вода для проведения реакций. LAL-тест может также использоваться для контроля качества продукции или сырья в пищевой промышленности. В настоящее время такой контроль осуществляется путем определения микробной обсемененности (традиционный тест), требующей значительных затрат времени и специально оборудованной лаборатории.

Для производства требуемых реактивов в настоящее время используются пять современных видов мечехвоста (класс морских членистоногих, подтип хелицеровых), обладающих механизмом коагуляции гемолимфы в ответ на попадание в нее эндотоксинов. Последние представляют собой липополисахариды, являющихся вместе с фосфолипидами и белками составными частями наружных мембран (оболочек) грамотрицательных бактерий, определяющими их важнейшие свойства, в частности взаимодействие бактерий с высшими организмами. В биосреды они попадают в результате процессов обсеменения бактериями из внешней среды.

Однако мечехвосты обитают только на мелководье теплых морей у берегов южной части Северной Америки (Атлантический океан, 1 род, 1 вид), Восточной и Юго-Восточной Азии и прилегающих островов (1 род, 4 вида); их запас ограничен. Кроме того, несмотря на то, что от животных отбирается только часть гемолимфы и они возвращаются в море для восстановления количества и качества последней, их смертность в результате операции по взятию гемолимфы увеличивается на 3-10%. К снижению запаса мечехвостов также ведет отлов их на сувениры и в качестве пищевого деликатеса. Все это приводит к необходимости ограничения вылова этих видов.

Потребность в LAL-реактиве и его аналогах постоянно увеличивается как за счет повышения требований к качеству инфузионных лекарственных препаратов и субстанций для их изготовления, так и к сырью для получения пищевых продуктов (введение системы управления качеством продукции на основе принципов ХАССП [1]). Для обеспечения работы контрольных лабораторий ведется как разработка физико-химических методов определения эндотоксинов, так и биотестов на основе сырья, способного, если не заменить мечехвоста, то хотя бы снизить нагрузку на существующий запас реликтовых животных. Поэтому проводятся исследования, в которых in vivo и in vitro исследуется эффект эндотоксина на коагуляционные системы различных беспозвоночных. Например, еще в работе [2], приведены данные по изучению свойств гемолимфы корнеголовых паразитов ракообразных, к которым относится, например Sacculina carcini.

В российской экономической зоне в Охотском море и северо-западной части Берингова моря у равношипого краба Litodes aequispina, обитающего на глубинах 120-830 м, встречается относящийся к этой группе паразит Briarosaccus callosus (Boschma). Оцененная к настоящему времени величина промыслового запаса краба-хозяина этого паразита в Охотском море составляет около 25 тыс. т при площади ареала примерно 100 тыс.кв.км. В Беринговом море запас значительно ниже. Зараженность этим паразитом равношипого краба составляет примерно 4%, т.е. запас В. callosus при средней массе краба 3 кг можно примерно оценить в 1000 т, что в пересчете на самого паразита составляет не более 100 т. Такого количества явно недостаточно для промышленной переработки. Поэтому внимание и было обращено на промысловые виды рода Paralithodes, также обладающие защитным механизмом гелирования гемолимфы с несколько менее выраженной активностью, но при существенно (в тысячи раз) большем промысловом запасе животных (Охотское и Баренцево моря).

Эксперименты, выполненные авторами, показывают, что при более низкой чувствительности к эндотоксину "сырого" лизата, получаемого из гемолимфы указанных выше животных (примерно на порядок ниже, чем нижний предел чувствительности LAL-реактива, 0,5 ЕЭ/мл), последний без разработки специальных мер повышения чувствительности может быть использован в пищевой промышленности, где соответствующий показатель достаточно обеспечить, например, в пределах требуемой кратности разведения реактива 10-5-2,5 ЕЭ/мл [3].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения LAL-реактива из гемолимфы мечехвоста, описанный в часто цитируемой в патентной литературе по LAL-тесту работе [4] (Levin J., Bang F.B., 1964). Гемолимфа в лабораторных экспериментах бралась пункционной иглой из полости сердца животного и помещалась в стеклянный сосуд центрифуги, содержавший антикоагулянт - 0.125% раствор N-этиленмаленимида в 3%-ом апирогенном растворе натрия хлорида при температуре 42°С при соотношении гемолимфа-антикоагулянт 1:1. Затем вся смесь подогревалась до 42°С в течение 8 мин и 10 мин центрифугировалась при перегрузке 150 g. Супернатант удалялся декантацией, а отфильтрованные амебоциты повторно заливались антикоагулянтом. Клетки вновь отделялись центрифугированием при том же режиме, а затем заливались апирогенным 0,9% раствором натрия хлорида, после чего смесь разливалась по апирогенным пластиковым пробиркам емкостью 50 мл. Промытые клетки вновь ценрифугировались при 150 g. После отделения супернатанта разрушались с помощью апирогенной воды для инъекций в отношении 7 мл воды на 3 мл амебоцитов. После перемешивания с помощью мешалки в течение 10-15 секунд смесь оставлялась на 24 ч при температуре 1-5°С для полного разрушения оболочек, после чего их части осаждались центрифугированием при 1500 g в течение приблизительно 15 минут. Лизат фильтровался и хранился при температуре 1-5°С. В цитируемой статье были только заложены основы промышленного получения LAL-реактива, причем первичная переработка велась при достаточно высоких температурах, свойственных среде обитания этих животных.

Детально вопрос был проработан в патенте США 3915805 (Levin J., 1975, [5]), где был описан метод количественного определения эндотоксина в биосредах и способ получения LAL-реактива, до сих пор лежащий в основе его производства. Способ включает консервирование гемолимфы мечехвоста рода Limulus, выделение из нее центрифугированием амебоцитов, их разрушение с помощью осмотического шока с последующим центрифугированием, экстракцию хлороформом и лиофильную сушку лизата.

Описанный способ предполагает использование для получения чувствительного реактива только мечехвоста и на начальной стадии переработки гемолимфы реализуется при температуре 42°С, что недопустимо при работе с холодолюбивыми крабами рода Paralithodes. Кроме того, оболочки амебоцитов этого рода не разрушаются указанным выше способом.

Современное состояние вопроса, подробности создания LAL-теста, развития метода диагностики и получения собственно лизата амебоцитов (LAL-реактива) на основе зарубежных и отечественных публикаций приведены в обзоре [6], где также в качестве сырья рассматриваются только мечехвосты. Отметим, что и более поздние патенты, касающихся разработки чувствительных к эндотоксину реактивов и отличающиеся как использованными механизмами увеличения чувствительности реактива, так и методов диагностики результатов взаимодействия реактива с исследуемой средой, базируются на переработке гемолимфы именно мечехвоста (см., например, патенты США 6270982, 6391570 и др.).

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения аналога LAL-реактива из морских беспозвоночных, обитающих в экономической зоне прибрежных морей России.

Эта задача решается путем получения реактива, чувствительного к присутствию бактериального эндотоксина, из гемолимфы краба рода Paralithodes (тип членистоногие, подтип жабродышащие, класс ракообразные), например, из гемолимфы камчатского краба (точнее, крабоида) Paralithodes camtschaticus, в дальнейшем - ПАЛ-реактив (от латинского: PAL-reagent, Paralithodes Amebocyte Lysat Reagent).

ПАЛ-реактив получают из гемолимфы здоровых свежевыловленных промысловых особей камчатского краба массой не менее 3-4 кг, которые непосредственно после отлова поступают на взятие гемолимфы или предварительно помещаются в аквариальный бассейн с проточной морской водой при условии содержания при температурном режиме, соответствующем межлиночному циклу развития животных (для июля-августа в прибрежных водах ряда заливов Баренцева моря на глубинах 10-15 м, например, от +5 до +8°С), насыщения воды кислородом не менее 6 мл/л и обеспечения характерного для вида и ареала промысла рациона питания.

Взятие пробы гемолимфы осуществляется в охлаждаемом боксе путем введения стерильной пункционной иглы в полость сердца животного, с последующим наполнением на весах апирогенных пластмассовых сборников, предварительно частично заполненных стерильным раствором консерванта, охлажденного до 4-6°С. Затем в смесь вводят криопротектор, в качестве которого используют диметилсульфоксид. Смесь тщательно перемешивают, после чего разливают по пластиковым пробиркам, запечатывают, маркируют, производят постадийное криогенное замораживание и помещение проб в криостат, заполненный жидким азотом для хранения и транспортировки. На длительное хранение в ожидании переработки пробы помещаются в морозильную камеру с температурой не выше -70°С.

Возможен и другой способ взятия проб, отработанный в свое время на мечехвостах. Он включает отсечение части когтя одной из ходильных ног и непосредственное заполнение гемолимфой сборника с консервантом. Если после процедуры взятия пробы животное выпускается в море, то отверстие на когте закрывают с помощью пластыря или другим способом.

В качестве консерванта в предлагаемом способе используют композицию следующего состава (из расчета в граммах на 1000 мл):

Лимонная кислота3,3Цитрат натрия26,3Бифосфат натрия22,2Глюкоза32,0Трилон Бне более 11,2Вода для инъекций (ФС 42-2620-97)остальное.

Величина рН консервата должна лежать в пределах 4,4-4,6.

При условии использования полученного консервата в течение 60 суток допускается исключение процедуры криозамораживания и хранение проб в холодильнике при температуре 1-5°С.

В процессе переработки гемолимфы из криозамороженных проб для получения лизата амебоцитов пробы размораживаются, полученный консерват из транспортных сборников разливается в апирогенные пластиковые пробирки и центрифугируется при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляется, а затем производится двукратная отмывка амебоцитов и ресуспендирование их очищенной апирогенной водой.

Для разрушения амебоцитов суспензию заливают в апирогенные целлофановые мешки для диализа. Мешки помещают в сосуд с очищенной депирогенизированной водой при рН 8,0. Диализ проводится при температуре +4°С в течение 18-24 часов со сменой воды в сосуде через 9-12 часов. Отделение разрушенных оболочек клеток от лизата осуществляется центрифугированием (режим см. выше), после чего лизат экстрагируют хлороформом.

Активирование лизата проводят добавлением 25%-ного депирогенизированного раствора сульфата магния из расчета 0,1 мл раствора на 1 мл лизата. Стерильный активированный лизат разливают в стеклянные флаконы емкостью, например, 5 мл по 1 мл в каждый и подвергают лиофильной сушке. Объем флакона может подбираться в зависимости от конструкции устройства для лиофильной сушки.

Ниже (см. табл.1) приводится сопоставление различных методов анализа микробиологического состояния сырья с использованием ПАЛ- и LAL-тестов и традиционным методом (определение микробной обсемененности).

Таблица 1.Сравнение методов анализа микробиологического состояния пищевого сырьяПоказатели сравненияВозможные методы экспресс-анализаТрадиционный методРазрабатываемый ПАЛ-тестСуществующий LAL-тестОпределение микробной обсемененностиВремя, требуемое для получения результата анализа1 ч (качественный анализ)1 ч (качественный анализ)5-7 сутокОборудованиеЛабораторный стол, вод. баня, центрифуга, набор посудыЛабораторный стол, вод. баня, центрифуга, набор посудыАккредитованная лабораторияСтоимость анализа150-300* руб.600-1200*руб.600-900 руб.*) в зависимости от требуемой чувствительности реактива

Данные табл.1 позволяют по простоте реализации и экономическим соображениям отдать предпочтение именно предлагаемому ПАЛ-тесту.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Камчатский краб на линочной стадии 3-3а без обрастаний и изъязвлений массой 3-4 кг в помещении или боксе с температурой воздуха не выше 10-15°С помещается в кювету, где он обмывается чистой водой, подсушивается и закрепляется на штативе или планшете для взятия гемолимфы.

Перед взятием гемолимфы на консервацию у одного из животных берется проба на микроскопирование для определения качества сырья. Забор 1-2 мл гемолимфы производится пункционной иглой из полости сердца. Затем с помощью предметных стекол приготавливается не менее 3-х препаратов "раздавленная капля", которые анализируется с помощью микроскопа типа МБИ-6 при увеличении 15×20. При этом оценивается состояние и количество амебоцитов по всему пространству проб. Пробы считаются положительными, если в поле зрения объектива одновременно находится не менее 20 амебоцитов, среди которых отсутствуют элементы разрушенных и деградировавших клеток.

Взятие гемолимфы для получения консервата осуществляют путем введения в полость сердца животного стерильной пункционной иглы с трокаром, предварительно заполненных консервантом. После появления капли гемолимфы на выходе из иглы трокар вводят в полость сердца, иглу удаляют, а к выходному штуцеру трокара подключают патрубок для подсоединения к пластиковому сборнику гемолимфы, заранее частично заполненному консервантом и установленному на весы в охлаждаемом до температуры не выше 15°С боксе. В полученную порцию консервата стерильным шприцом добавляют криопротектор диметилсульфоксид в количестве не более 10% от общего количества консервата и тщательно перемешивают. Полученный консерват разливают в апирогенные пробирки по 1,5-2,5 мл. Пробирки запечатывают и охлаждают до 0°С в ледяной шуге, затем поэтапно со скоростью в пределах 1-3 град./мин - в смеси спирта с жидким азотом до температуры минус 30-40°С, после чего их помещают в криостат, заполненный жидким азотом. В транспортном криостате пробы доставляют на переработку или длительное хранение.

Для получения лизата амебоцитов пробы гемолимфы размораживают в течение 1 часа при 4-6°С, затем пробирки центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляют декантацией и микроскопируют на отсутствие амебоцитов. Затем концентрат амебоцитов заливают 3-х кратным объемом очищенной депирогенизированной воды и вновь центрифугируют при том же режиме. Операцию повторяют дважды.

Для разрушения амебоцитов промытый осадок амебоцитов заливают равным объемом воды для инъекций и перемешивают стеклянной апирогенной палочной для образования суспензии. Суспензию амебоцитов сливают в апирогенные целлофановые мешки для диализа, которые помещают в сосуд с водой для инъекций при рН 8,0. Диализ проводят в течение 24 часов со сменой воды через 12 часов при температуре 4-6°С. Отделение разрушенных оболочек клеток от лизата осуществляют центрифугированием при указанном выше режиме. Супернатант собирают в апирогенные емкости и отправляют на дальнейшую переработку или лиофилизируют на месте.

В последнем случае в сосуд с неактивным лизатом добавляют 25%-ный депирогенизированный раствор сульфата магния из расчета 0,1 мл раствора на 1 мл лизата. Затем активированный лизат разливают в стеклянные апирогенные флаконы емкостью 5 мл по 1 мл (10-5-2,5 ЕЭ/мл) и проводят лиофильную сушку. В порошке проверяют активность, а в процессе изготовления ведут постадийный контроль качества (см. пример табл.2).

Таблица 2.Постадийный контроль качества при получении образцов лизата амебоцитов краба (серия 10504) Показатели качествапараметрметодрезультат1234Качество гемолимфыстерильностьГФ XI, вып.2, стр.187, изм. №3стерильноЦелостность клетокМикроскопияОтсутствие разрушенных клетокКачество осаждения амебоцитовНаличие клеток и их остатков в супернатантеМикроскопияОтсутствие клеток и их остатков в супернатантеКачество диализаНаличие клетокМикроскопияОтсутствие целых клетокрНПотенциометрически6,5Качество лизата после центрифугированияОтсутствие остатков клетокМикроскопияОтсутствие остатков клетокКачество лизата после активации и стабилизацииЧувствительность лизатаОФС 42-0002-0010 ЕЭ/млКачество лиофильной сушкистерильностьГФ XI, вып.2, стр.187, изм. №3СтерильноОстаточная влажностьГФ XI, вып.1, стр.1767%Чувствительность лизатаОФС 42-0002-0010 ЕЭ во флаконе

Проверку активности проводят методом сравнительного анализа полученного реактива со стандартным LAL-реактивом. В качестве примера сравнения ниже приводятся экспериментальные результаты, полученные на одном и том же эндотоксине с различными степенями разведения, а все калибровки проведены на контрольном стандарте эндотоксина из комплекта LAL-теста.

Для проведения стандартного LAL-теста применяли реактивы фирмы Associates of Cape Cod Inc.: LAL-реактив (Pyrotell®). В работе использовали LAL-реагент с чувствительностью λ=0,25 ЕЭ/мл (lot# 502-07-262), контрольный стандарт эндотоксина (lot# 94, 500 нг во фл.), оттитрованный по RSE (FDA) (lot# EC-6-1), воду для анализа по LAL-тесту (lot# 314-2881).

Для проведения ПАЛ-теста использовались лабораторный образец реактива - ПАЛ-реактив серии 30504 с чувствительность 1.0 ЕЭ/мл, контрольный стандарт эндотоксина и очищенная депирогенизированная вода от описанного выше LAL-теста.

В обоих случаях определение концентрации бактериальных эндотоксинов проводили качественным гель-тромб методом, осредняя результат по трем опытам в каждой серии при калибровке через 0,2 ЕЭ/мл согласно [7].

Результаты измерений приведены в табл.3.

Таблица 3.Сравнительный анализ измерения содержания эндотоксина с помощью ПАЛ- и ЛАЛ-реактивовРеактивСодержание эндотоксина в пробе, ЕЭ/млОсредненный результат измерений, ЕЭ/млОтносительная погрешностьПАЛ-реактив12,012,6+0,05LAL-реактив-"-12,4+0,033ПАЛ-реактив6,05,6-0,067LAL-реактив-"-6,2+0,33ПАЛ-реактив3,03,2+0,067LAL-реактив-"-2,8-0,067

Во всех трех сдвоенных опытах проведения определений калиброванного содержания эндотоксина относительная погрешность среднеарифметического значения содержания эндотоксина не выходила за пределы ±7%.

Пример 2.

Камчатский краб, отвечающий требованиям п.1, в помещении с температурой воздуха не выше 10-15°С обмывают чистой водой и обсушивают. Затем краб закрепляется на штативе или наклонном планшете, установленном рядом с ламинарным боксом или другим видом бокса, обеспечивающим отсутствие загрязнения продукта с таким расчетом, чтобы окончание одной из его ходильных ног оказывалось в чистой зоне, обеспечивающей стерильные условия заполнения гемолимфой апирогенного сборника. Нога в районе сустава между третьим и четвертым члениками обертывается стерильной марлей, препятствующей случайному попаданию посторонних жидкостей в зону взятия гемолимфы. Зона взятия гемолимфы от четвертого членика до конца когтя (коксоподита) обрабатывается антисептиком, например хлоргексидином.

Взятие пробы гемолимфы осуществляется путем вскрытия когтя коксоподита с образованием отверстия диаметром 4-5 мм и введения когтя в пластиковый патрубок с замком, соединенный с пластиковым стерильным контейнером (гемаконом) для сбора проб. Заполненным на 1/3 консервантом гемакон устанавливается на электронные весы в охлаждаемом до температуры не выше 10-15°С боксе, показания весов обнуляются, а заполнение гемолимфой производится до показания равного массе консерванта. Затем гемакон маркируется, охлаждается и хранится при температуре 1-5°С.

Пробы гемолимфы доставляются на переработку, где в чистом помещении разливаются в ламинарном боксе в стерильные пластиковые пробирки с крышками и центрифугируются на лабораторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляют и микроскопируют на отсутствие амебоцитов. Концентрат амебоцитов заливают 3-х кратным объемом апирогенной воды и центрифугируют при том же режиме, повторяя операцию дважды.

Дальнейшую переработку гемолимфы ведут аналогично примеру 1.

Источники информации

1. ГОСТ Р 51705.1-2001. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП.

2. Levin J. 1967. Blood coagulation and endotoxin in invertebrates // Federation Proceedings, vol.26, N6, November-December. P.1707-12.

3. Галынкин В.А., Заикина Н.Л., Каграманова К.А., Карцев В.В., Потехина Т.С. Санитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности. - СПб, 2004. - 248 с.

4. Levin J., Bang F.B. (1964) The Role of Endotoxin in the Extracellular Coagulation of Limulus Blood // Bull. John Horkins Hosp., Vol.115, N3. - P.265-274.

5. Levin J. Quantitative detection of endotoxin in biological fluids. Патент США 3915805 (приоритет от 29.05.1973; выдан 28.10.1978).

6. Ситников А.Г., Глазова Н.В., Травина Л.А и др. ЛАЛ-тест. Современные подходы к определению пирогенности. - СПб.: ТЕХ-БИОМ, 1994. - 98 с.

7. ОФС 42-0002-00. Бактериальные эндотоксины.

Настоящее изобретение относится к получению реактивов, чувствительных к эндотоксинам грамотрицательных бактерий и предназначено для контроля допустимого содержания эндотоксина в различных средах, включая пищевое сырье. Способ включает взятие гемолимфы крабов рода Paralithodes, ее консервацию, выделение амебоцитов из гемолимфы путем центрифугирования, выделение ферментов амебоцитов разрушением их оболочек с последующим центрифугированием и лиофильной сушкой лизата. Разрушение оболочек амебоцитов проводят диализом против подщелаченной до рН 8,0 очищенной депирогенизированной воды в течение 24 часов при температуре 4-6°С со сменой воды через 12 ч. Перед лиофильной сушкой в лизат вводят 25%-ный раствор сульфата магния. Способ позволяет использовать в качестве сырья гемолимфу промысловых животных, обитающих у берегов России, причем сами животные после взятия гемолимфы поступают на переработку. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения реактива для определения бактериальных эндотоксинов из гемолимфы морских членистоногих, включающий взятие гемолимфы, ее консервацию, выделение амебоцитов из гемолимфы путем центрифугирования, выделение ферментов амебоцитов разрушением их оболочек с последующим центрифугированием и лиофильной сушкой лизата, отличающийся тем, что используют гемолимфу крабов рода Paralithodes, разрушение оболочек амебоцитов проводят диализом против подщелаченной до рН 8,0 очищенной депирогенизированной воды в течение 24 ч при температуре 4-6°С со сменой воды через 12 ч, перед лиофильной сушкой в лизат вводят 25%-ный раствор сульфата магния.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что взятие гемолимфы и ее консервацию ведут при температуре не выше 10-15°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве консерванта для гемолимфы используют апирогенный раствор следующего состава из расчета граммов на 1000 мл:

лимонная кислота безводная3,3цитрат натрия водный26,3бифосфат натрия водный22,2глюкоза32,0трилон Бне более 11,2вода для инъекцийостальное