СПОСОБ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭНДОТОКСИНА В РАСТВОРЕ ГЕМОГЛОБИНА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/579 

Область техники

Изобретение является способом и относится к определению уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, более конкретно относится к способу количественного определения эндотоксина в 10% растворе гемоглобина. Способ является простым, обладает отличной чувствительностью и воспроизводимостью и является существенным то, что его можно применить в растворе гемоглобина несмотря на мешающие факторы.

Техническая проблема

Технической проблемой в настоящем изобретении является обеспечение такого способа определения уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, при помощи которого преодолеваются недостатки известных до сих пор методов.

Учитывая то, что пациенту с большой кровопотерей при инфузии "искусственной крови" следует ввести большой объем раствора гемоглобина, загрязнение гемоглобина бактериальными липополисахаридами (ЛПС) может быть основным препятствием для клинического применения раствора этого белка в качестве "кровезаменителя". Определение эндотоксина тестом "Limulus amoebocyte lysate-LAL" в растворах белков осложнено тем фактом, что белки, в том числе и гемоглобин, в основном интерферируют с тест-системой и дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Эндотоксины представляют собой самые значительные пирогены в фармацевтической промышленности. Это липополисахаридные (ЛПС) комплексы большого молекулярного веса в составе внешней мембраны грамотрицательных бактерий, обладающие витальной функцией в выживании бактерий. ЛПС является единым гликолипидом, обнаруженным только во внешней мембране грамотрицательных бактерий. Учитывая их связь с грамотрицательными бактериями, эндотоксины распространены повсюду, как и бактерии: в воздухе, воде и пище. Биологические эффекты эндотоксина разнообразны, и они представлены в таблице.

Таблица 1
Биологические действия и эффекты эндотоксина (Wako Pure Chemical Industries Ltd. Biological activities, 1992, In: Technical Bulletin: Endotoxin Test System, p.2).А. В организме
Пирогенность АбортЛетальная токсичностьПотеря массы телаАктивность Швартцмана
Эндотоксический шокИндукция неспецифичной устойчивости к инфекциямЛейкопенияИндукция интерфероновАгрегация тромбоцитовАктивность некроза опухолиПонижение уровня глюкозы в кровиАдъювантная активность Индукция толерантности к эндоктосинамВазоконстрикция и вазодилятация В. В клетках
Активация макрофаговС. В молекулах
Активация комплементовСозревание предшественников Т- и В-лимфоцитов
Митогенная активность В-лимфоцитовАктивация фактора XIIПродуцирование медиаторовАктивация плазминогенов интерферона, фактора некроза опухоли, простагландина, колоностимулирующего фактора, лейкотриенов, интерлейкина-1Гелеобразование лизата
Limulus

Высокий уровень чистоты раствора белков для парентерального применения необходим, так как в клинической практике даже очень небольшие количества эндотоксина могут вызвать у пациента многочисленные побочные последствия. 18 января 1980 года (38 FR 1404) лизат амебоцита краба-мечехвоста - Limulus polyphemus признан FDA биологическим продуктом, который можно использовать для определения эндотоксина вместо теста на кроликах. Тест на пирогенность, проводимый на кроликах, пригоден для применения в фармацевтической промышленности, так как кролики показывают одинаковую чувствительность к ЛПС, как и люди, и с помощью данного теста можно обнаружить различные виды пирогенов. Основным недостатком данного теста являются проблемы его проведения, использование подопытных животных со всеми их характеристиками и высокая стоимость. К настоящему времени разработаны многочисленные тест-системы для детекции эндотоксина, но только LAL-тест является удовлетворящей альтернативой USP (United States Pharmacopoeia № 25, 2002) тесту на кроликах.

Сущность LAL-теста состоит в ферментативной реакции, происходящей между лизатами и эндотоксином, при этом образуется помутнение, т.е. гель. Преимущества LAL-текста, из-за которых его все чаще используют в фармацевтической промышленности: высокая чувствительность, очень быстрое проведение теста и низкая стоимость. Кроме этого, тест на кроликах, традиционный метод для детекции пирогенов, дает частичные результаты, так как наблюдаются только эффекты пирогенов. Тест на кроликах не может дать данных о дополнительных осложнениях, которые могут появиться вследствие освобождения эндотоксинов в катаболических процессах маскирующего их компонента или при накоплении эндотоксинов.

Процесс выделения гемоглобина из старых эритроцитов и его очистки, описанный в патенте DE 19707508, Bugarski и Dovezenski, "Verfahren zur Herstellung von Hemoglobin", 31.05.2000 года, который находится в собственности "Хемофарм Концерн", разработан для его применения в качестве носителя кислорода, т.е. "кровезаменителя". Гемоглобин, полученный данным способом, имеет хорошие характеристики относительно связывания, переноса и освобождения кислорода и является потенционально идеальным заменителем эритроцитов. Получением "кровезаменителя" занимается несколько компаний в мире, но в клинической практике такие препараты гемоглобина еще не используются из-за значительных проблем с токсичностью: гипертензия, брадикардия, лихорадка, диссеминированное внутрисосудистое свертывание и т.п. Повышение биологической активности ЛПС под влиянием гемоглобина представляет серьезный клинический риск. Является ли токсичность следствием свойств гемоглобина самого по себе или возможного наличия контаминантов (стромальные фосфолипиды или эндотоксины), еще не выяснено полностью и данные литературы достаточно противоречивы. Например, при введении кроликам гемоглобина, контаминированного ЛПС, он приводит к повышению смертности по сравнению с чистым гемоглобином, что указывает на роль эндотоксина в in vivo токсичности гемоглобина. Кроме этих результатов существуют данные о синергической токсичности ЛПС и гемоглобина.

В ходе работы по выделению и очистке гемоглобина из старых эритроцитов необходимо проводить оперативный контроль в течение процесса производства и контроль окончательного препарата гемоглобина на возможность наличия/отсутствия эндотоксина. Определение эндотоксина в окончательном препарате гемоглобина можно выполнять при проведении на кроликах теста на пирогенность, но количественное определение уровня эндотоксинов возможно только при применении LAL-теста.

Уровень эндотоксина выражается в единицах эндотоксина (Endotoxin Unit, EU - Эндотоксиновая единица, ЭЕ), и это активность, которую имеет 0,1 нг референсного стандарта US, серия EC-6 (FDA), т.е. серия G (USP 25). В одном флаконе EC-6 содержится 10 000 ЭЕ.

Уровень техники

Определение уровня эндотоксина в растворе гемоглобина является значимой проблемой, преимущественно для компаний, занимающихся получением "кровезаменителей" на основе гемоглобина. Многолетнее сотрудничество между Службой исследования "Хемофарм Концерн", Институтом медицинского исследования и Кафедрой химической инженерии в проекте "Кровезаменитель на основе гемоглобина" привело к созданию потенциально успешного "кровезаменителя". Результатом данного сотрудничества является патент DE 19707508, Bugarski и Dovezenski, Verfahren zur Herstellung von Hemoglobin, 31.05.2000 г.

Несколько биотехнологических компаний в мире тоже занимаются проблематикой "кровезаменителя", и судя по доступной литературе у них имеются разработанные методы для определения эндотоксина в растворах гемоглобина. Но в отличие от настоящего изобретения во всех указанных работах, раствор гемоглобина не анализировали в аспекте "коммерческого" препарата, т.е. нигде не применяли (или это не было упомянуто) требования фармакопей (European Pharmacopoeia № IV,раздел 2.6.14, 2002 г. и USP № 25, раздел 85, 2002), относящиеся к применению LAL-теста у коммерческих препаратов: предел эндотоксина, максимальное допустимое разбавление и положительный контроль продукта.

В работе Roth et al., "Production of modified crosslinked cell-free hemoglobin for human use: the role of quantitative determination of endotoxin contamination", 1993,Transfusion, 33(11):919-24, для тестирования раствора гемоглобина использовали способ LAL гель-сгусток. Определяли предел концентраций гемоглобина 1 мкг/мл - 100 мг/мл, что соответствует концентрациям растворов, тестированных в опытах авторов изобретения, но задается вопрос - как можно отличить ситуацию, в которой гемоглобин усиливает тест, от ситуации, в которой гемоглобин контаминирован эндотоксинами - в обеих ситуациях получается положительная реакция.

В работе Kaca et al., "Human hemoglobin increases the biological activity of bacterial lipopolysaccharides in activation of Limulus amebocyte lysate and stimulation of tissue factor production by endothelial cells in vitro, 1994, Journal of Endotoxin Research, 1, 243-252", использованы способы LAL гель-сгусток и хромогенный. Тестировали растворы гемоглобина с концентрациями 0,01-1 мг/мл, инкубация смеси образец-лизат продолжалась 90 минут, а поглощение измеряли при длине волны 620 нм. Самая высокая тестированная концентрация (1 мг/мл), ниже концентраций, тестированных в опытах авторов изобретения, что значительно облегчает проведение испытаний.

В работе Kaca et al., "Hemoglobin, a newly recognized lipopolysaccharide (LPS)-binding protein that enhances LPS biological activity", 1994, J. Biol. Chem. 7. 269(40):25078-84, использованы способы LAL гель-сгусток и хромогенный. Тестировали растворы гемоглобина концентрациями 0,2-2 мг/мл, а поглощение измеряли при длине волны 405 нм. Самая высокая тестированная концентрация (2 мг/мл), чуть более высокая, чем в предыдущей работе, но тем не менее более низкая, чем концентрация, которую следует тестировать по требованиям USP 25 и EP IV.

В работе Winslow et al., "Pilot-scale preparation of hemoglobin solutions", 1994, In: Methods in Enzimology, Vol.231. 3-16, использовали LAL-кинетический турбидиметрический анализ. Для получения стандартной кривой вместо LAL-воды использовали раствор гемоглобина, а потом с полученной таким образом кривой отсчитывали концентрации эндотоксина в тестированных образцах гемоглобина. Поскольку подробности способа не указаны, не выяснено с какими концентрациями гемоглобина проводились тесты.

В работе Tani et al., "Endotoxin removed from hemoglobin solution using Polymyxin-B immobilized fibre (PMX-F) followed by a new turbidimetric endotoxin assay" (1992, Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech. 20(2-4), 457-462), использован LAL кинетический турбидиметрический анализ. Для получения стандартной кривой вместо LAL-воды использовали раствор гемоглобина и поглощение измеряли при длине волны 660 нм. Потом с полученной таким образом кривой отсчитывали концентрации эндотоксина в тестированных образцах гемоглобина. Данный подход больше всех похож на подход, использованный в настоящем изобретении, но вместо инкубации здесь использовали полимиксин в, обладающий большей аффинностью к эндотоксинам, чем гемоглобин, и поэтому он связывает их в растворе.

В патенте US 005084558 A, Rausch и Feola, 1992, «Extra pure semi-synthetic blood substitute», в способе определения «кровезаменителя», для тестирования эндотоксина использовали хромогенный метод в 10% растворе гемоглобина (10 г/100 мл). Поскольку подробности не указаны, то не выяснено, соблюдены ли при проведении испытания требования USP 25 и ЕР IV.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена гистограмма восстановления положительного контроля продукта для различных разведении образца гемоглобина, тестированных LAL кинетическим турбидиметрическим анализом при длине волны 650 нм с использованием соответствующего фильтра.

На фиг.2 представлена гистограмма восстановления положительного контроля у продукта для различных разбавлении образца гемоглобина, тестированных LAL кинетическим турбидиметрическим анализом при длине волны 660 нм с использованием соответствующего фильтра.

Описание решения технической проблемы

Изобретение относится к способу количественного определения эндотоксина, который является простым в рутинном применении, обладает отличной чувствительностью и воспроизводимостью и, что важно, его можно применить на образцах гемоглобина несмотря на мешающие факторы. Для количественного анализа уровня эндотоксинов в образцах гемоглобина был использован кинетическо-турбидиметрический LAL (Limulus amoebocyte lysate) анализ, т.е. анализ с использованием лизата амебоцитов Limulus, при длинах волн 650 и 660 нм. Эти длины волн выбраны исходя из того факта, что гемоглобин не поглощает свет в этой части спектра и, следовательно, не может влиять на результаты LAL анализа. Кроме того, в одной из работ уровня техники (Tani et al., Endotoxin removed from hemoglobin solution using Polymyxin-B immobilized fibre (PMX-F) followed by a new turbidimetric endotoxin assay (1992, Biomat., Art. Cells&Immob. Biotech. 20 (2-4), 457-462)), уровень эндотоксинов определен при длине волн 660 нм. В этой связи появилась потребность проведения испытаний при длине волн 650 и 660 нм с целью установления возможных различий в эффективности теста при этих двух длинах волн (пример 1 и пример 2).

Все процедуры LAL-теста выполнены по рекомендациям производителя аппаратов и реактивов (Charles River Endosafe) так, чтобы удовлетворить требованиям фармакопеи (ЕР IV, раздел 2.6.14, 2002):

- Лабораторная посуда

Лабораторная посуда, использованная в опытах, изготовлена из боросиликатного стекла, не абсорбирующего эндотоксин (C.R. Endosafe). После использования пробирки и пипетки промывают дистиллированной водой, высушивают и проводят депирогенизацию в фольге при температуре 180°С в течение 4 часов (endotoxin-free). Реакционные кюветы являются одноразовыми и после использования их выбрасывают. Вода, используемая в опытах, является качества LAL Reagent Water (LRW), что значит, что она имеет ≤0,01 ЭЕ/мл (сертификат C.R. Endosafe).

- Совместимость контрольного стандарта эндотоксинов и лизатов

В работе использованы совместимые серии контрольного стандарта эндотоксина (CSE) и LAL реактива (лизатов) производителя "C.R. Endosafe". Совместимость подтверждается сертификатами производителя, в которых указан и способ растворения стандарта эндотоксина для достижения соответствующей начальной концентрации по отношению к данному лизату. Лизаты растворяли по инструкциям производителя.

- Способ

Концентрацию эндотоксина в растворе гемоглобина в образце определяли с применением кинетического турбидиметрического анализа LAL-теста. Кинетический турбидиметрический анализ является способом LAL-теста, в котором количество эндотоксина в образце определяется на основании времени, необходимого для достижения смесью образец-лизат заранее заданной степени помутнения (заданное турбидиметрическое время).

- Аппаратура

В опытах уровень эндотоксина определяли с использованием аппарата ATi-320 производителя "C.R. Endosafe". Аппарат состоит из сухого инкубатора (37±1°C) с источником света, фотодетектора и комплекта программного обеспечения для анализа данных (ATi-Ana). Стандартную кривую делали с контрольным стандартом эндотоксина (CSE) в диапазоне концентраций 1 ЭЕ/мл-0,01 ЭЕ/мл. Продолжительность теста 60 минут, начальное значение OD-0,02, и при использовании соответствующих фильтров измеряли поглощение при длинах волн 650 и 660 нм. После завершения теста анализ данных выполняли посредством программного обеспеченя ATi-Ana, производителя "C.R. Endosafe".

- Достоверность стандартной кривой

Стандартную кривую получали каждый день и с нее отсчитывали значения эндотоксина в образцах. Стандартную кривую считали достоверной, если она удовлетворяла следующим критериям:

- коэффициент корреляции полученной кривой r≤-0,98;

- наклон кривой в пределах -0,1 и -1,0;

- максимальное допустимое отклонение каждого отдельного значения стандарта эндотоксина по отношению к среднему значению данной концентрации составляет ≤10%.

- Максимальное допустимое разведение

Максимальное допустимое разведение (MVD) является самым большим разбавлением, которое можно применить на образце с целью удаления мешающих факторов, но чтобы возможно присутствующие в образце эндоксины не разбавились настолько, чтобы тест-система не могла их обнаружить. Значение MVD вычисляли по следующей формуле:

MVD = концентрация продукта · K/λ · M

Максимальное допустимое разведение для 10%-ного раствора гемоглобина тестировали по отношению к стандартной кривой, последняя точка (λ) 0,01 ЭЕ/мл которой составляет 40. Это значит, что тестированный образец начальной концентрацией 10 г/100 мл можно разбавлять 40 раз (чтобы преодолеть влияние мешающих факторов), а чтобы возможные присутствующие в образце эндотоксины не разбавились более пределов детекции тест-системы.

- Влияние мешающих факторов у образцов в LAL-тесте

Чтобы результаты теста на бактериальные эндотоксины были достоверными, необходимо проверить влияние мешающих факторов раствора гемоглобина в LAL-реакции. Влияние является переменным и часто очень трудно установить его самые важные механизмы. Влияние может проявиться как ингибирование (чувствительность теста по некоторым причинам уменьшена, и это вызывает удлинение ожидаемого времени гелеобразования) или как усиление (приводит к повышению чувствительности теста и понижению времени гелеобразования). С целью определения влияния к образцу прибавляют определенное количество эндотоксина (положительный контроль продуктов, англ. spike - спайк) и потом наблюдают за способностью тест-системы обнаружить дополнительное количество эндотоксина. Параллельно тестируют и чистые ("без спайка") образцы. Если средняя концентрация эндотоксина в положительном контроле образца (спайке), вычисленная по отношению к стандартной кривой и уменьшенная на значение измеримых эндогенных эндотоксинов в чистом образце, в пределах 50-200% по отношению к известной концентрации положительного контроля продукта, образец не влияет на LAL-тест. Данное среднее значение эндотоксина называется восстановление спайка (spike recovery), и оно является основным критерием достоверности LAL-теста для определенного образца.

Значение спайка для количественной техники, т.е. количество CSE, прибавляемое к образцу, определяют на основании Pass/Fail Cutoff (PFC) значения:

PFC = EL × концентрация продукта/r

где:

EL (ЭЕ/мл) - предельная концентрация эндотоксина в продукте по требованиям фармакопеи (EP IV); поскольку предельная концентрация эндотоксина для гемоглобина не определена фармакопеей, ее вычисляют следующим способом:

EL = K/M = 5,95 ЭЕ/г гемоглобина = 0,595 ЭЕ/мл раствора гемоглобина

где:

K - максимально допустимая доза эндотоксина для людей; для парентеральных препаратов K=5,0 М.Е/кг;

M - максимальная доза препарата/кг массы тела, которую назначают в течение одного часа; для 10% раствора гемоглобина данная доза соответствует дозе, назначаемой кроликам в тесте на пирогенность и составляет 0,84 г/кг массы тела;

концентрация продукта - в случае гемоглобина, дозу которого определяют как массу по отношению к массе тела, концентрация соответствует значению 100 мг/мл;

r - разбавление продукта, для неразбавленного продукта составляет 1.

Если значение PFC≤1,0, значение спайка должно находиться в пределах 0,1-0,5 ЭЕ/мл; если значение PFC>1,0, значение спайка должно находиться в диапазоне 1,0-5,0 ЭЕ/мл. Поскольку для 10% раствора гемоглобина PFC<1,0, ко всем образцам гемоглобина, тестированным кинетическим турбидиметрическим и хромогенным методами, прибавляли по 0,5 ЭЕ/мл.

Пример 1. Кинетический турбидиметрический метод, поглощение при длине волны 650 нм

Из CSE (выделенный из Е. coli, серия ЕС-5) с начальной концентрацией 2000 ЭЕ/мл, приготовлена серия разбавлении CSE в LRW с пределами концентраций 5,0-1,0-0,5-0,1-0,01 ЭЕ/мл. Концентрации 1,0-0,01 ЭЕ/мл использовали для получения стандартной кривой с поглощением при длине волны 650 нм при применении соответствующего фильтра, а концентрацию 5 ЭЕ/мл - для образцов, у которых проводят «спайк». Полученная стандартная кривая удовлетворяет таким же критериям линейности, как и стандартная кривая при длине волны 405 нм.

10%-ные растворы (10 г/100 мл = 100 мг/мл) гемоглобина для тестирования (НВ/1 и НВ/2) разбавляют в 10 раз (обозначены соответственно как НВ/1/10 и НВ/2/10). Эти растворы затем инкубируют при температуре 60-80°С в течение 10-20 минут. Инкубированный раствор НВ/1/10 разбавляют до общей степени разведения в 40 раз, что соответствует концентрации 2,5 мг/мл. Инкубированный раствор НВ/2/10 разбавляют до следующих конечных разведении: 20 (5,0 мг/мл), 40 (2,5 мг/мл), 80 (1,25 мг/мл) и 160 (0,625 мг/мл). Все серии разбавлении белков проводят с LRW так, что степень разведения в шаге не превышает 1:10. По 0,1 мл HB/1/1, HB/1/40, HB/2/1, HB/2/10, HB/2/20, HB/2/40, HB/2/80 и HB/2/160 помещают в 4 кюветки для каждой пробы. В две кюветки для всех образцов прибавляют 0,01 мл CSE с концентрацией 5,0 ЭЕ/мл, чтобы получить значение спайка 0,5 ЭЕ/мл. Затем во все кюветки прибавляют по 0,1 мл соответствующего лизата. Все кюветки помещают в аппарат для перемешивания и потом помещают в аппарат ATi-320, в котором их инкубируют при 37±1°C в течение 60 минут при длине волны 650 нм, используя соответствующий фильтр.

Уровень эндотоксина в различных разведениях гемоглобина определяют считыванием со стандартной кривой. Результаты теста образца гемоглобина представлены в таблице 2.

Таблица 2 РазведениеВосстановление спайка (%)Средняя концентрация (ЭЕ/мл)CVОбразец    HB/1/11----
----###
0,0007###
14,4873,6
7,50,0181
0,038011,648
21,326HB/1/4040----
----###
######
###73,7
70,514,7344
14,63833,064
0,000HB/2/11----######0,0######HB/2/1010----0,98191,00336,42,80071,263HB/2/2020----1,17495,00069,88,15002,800HB/2/4040----
----1,3612
0,88782,816
1,04360,6
80,6213,4758
17,52011,252
2,857HB/2/8080----3,78120,00069,031,38621,386HB/2/160160----17,924126,541119,7113,68311,575

Учитывая то, что по MVD 10% раствор гемоглобина можно разбавлять не более 40 раз, то результаты, показывающие удовлетворящее восстановление спайка для разведения в 40 раз, можно считать достоверными.

Пример 2.Кинетический турбидиметрический метод, поглощение при длине волны 660 нм

Из CSE (выделенный из E. coli, серия EC-5) с начальной концентрацией 2000 ЭЕ/мл приготовлена серия разбавлений CSE в LRW с пределами концентраций 5,0-1,0-0,5-0,1-0,01 ЭЕ/мл. Концентрации 1,0-0,01 ЭЕ/мл использовали для получения стандартной кривой с поглощением при длине волны 660 нм при применении соответствующего фильтра, а концентрацию 5 ЭЕ/мл - для образцов, у которых проводят спайк. Полученная стандартная кривая удовлетворяет таким же критериям линейности, как и стандартная кривая при длине волны 405 нм.

10%-ные растворы (10 г/100 мл = 100 мг/мл) гемоглобина для тестирования (НВ/1 и НВ/2) разбавляют в 10 раз (обозначены соответственно как НВ/1/10 и НВ/2/10). Эти растворы затем инкубируют при температуре 60-80°С в течение 10-20 минут. Инкубированный раствор НВ/1/10 разбавляют до общей степени разведения в 40 раз, что соответствует концентрации 2,5 мг/мл. Инкубированный раствор НВ/2/10 разбавляют до следующих конечных разведении: 20 (5,0 мг/мл), 40 (2,5 мг/мл) и 160 (0,625 мг/мл). Все серии разбавлении белков проводят с LRW так, что степень разведения в шаге не превышает 1:10. По 0,1 мл НВ/1/1, НВ/1/40, НВ/2/1, НВ/2/10, НВ/2/20, НВ/2/40 и НВ/2/160 помещают в 4 кюветки для каждой пробы. В две кюветки для всех образцов прибавляют 0,01 мл CSE с концентрацией 5,0 ЭЕ/мл, чтобы получить значение спайка 0,5 ЭЕ/мл. Во все кюветки потом прибавляют по 0,1 мл соответствующего лизата. Все кюветки помещают в аппарат для смешивания и затем помещают в аппарат ATi-320, в котором их инкубируют при 37±1°С в течение 60 минут при длине волны 660 нм, используя соответствующий фильтр.

Уровень эндотоксина в различных разведениях гемоглобина определен считыванием со стандартной кривой. Результаты теста образца гемоглобина представлены в таблице 3.

Таблица 3 РазведениеВосстановление спайка (%)Средняя концентрация (ЭЕ/мл)CV (%)Образец    НВ/1/11----######1,10,005620,011НВ/1/4040----######----######79,315,86321,33999,70,005620,011НВ/2/11----0,0760###40,40,27790,000НВ/2/1010----3,03876,07621,04,08934,638НВ/2/2020----7,437729,8323,17,74890,000НВ/2/4040----0,88781,043----2,290125,74355,912,07343,66964,415,16640,000НВ/2/160160----10,889613,23269,866,75536,300

Учитывая то, что по MVD 10% раствор гемоглобина можно разбавлять не более 40 раз, то результаты, показывающие удовлетворяющее восстановление спайка для разведения в 40 раз, можно считать достоверными.

На основании результатов, представленных в Примерах 1 и 2, ясно, что при соответствующих указанных модификациях уровень эндотоксинов в растворе гемоглобина можно определить с одинаковой точностью и надежностью при обоих длинах волн, т.е. 650 и 660 нм.

Изобретение относится к способу определения уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, более конкретно к способу количественного определения эндотоксина в 10% растворе гемоглобина. Способ определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина включает применение кинетического турбидиметрического LAL (Limulus amoebocyte lysate) анализа при длине волны 650 или 660 нм с использованием оптического фильтра, при этом он содержит следующие стадии модификации образца: а) разведение 10% вес/объем раствора гемоглобина до концентрации 10 мг/мл; b) инкубирование полученного разведения в пределах температуры 60-80°С в течение 10-20 минут; с) разведение инкубированного раствора LAL-водой вплоть до концентрации 2,5 мг/мл; d) тестирование полученного раствора с применением кинетического турбидиметрического LAL анализа при длине волны 650 или 660 нм с использованием оптического фильтра; е) считывание полученных концентраций эндотоксина со стандартной кривой, полученной для кинетического турбидиметрического LAL анализа. Изобретение позволяет разработать способ определения уровня эндотоксина в растворе окрашенных белков, при помощи которого преодолеваются недостатки известных до сих пор методов, т.к. белки, в том числе и гемоглобин, в основном интерферируют с тест-системой и дают ложноположительные или ложноотрицательные результаты. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.

1. Способ определения уровня эндотоксина в растворе гемоглобина, включающий применение кинетического турбидиметрического LAL - Limulus amoebocyte lysate анализа при длине волны 650 нм или 660 нм с использованием оптического фильтра, отличающийся тем, что он содержит следующие стадии модификации образца:

a) разведение 10% вес/объем раствора гемоглобина до концентрации 10 мг/мл;

b) инкубирование полученного разведения в пределах температуры 60-80°С в течение 10-20 мин;

c) разведение инкубированного раствора LAL-водой вплоть до концентрации 2,5 мг/мл;

d) тестирование полученного раствора с применением кинетического турбидиметрического LAL анализа при длине волны 650 нм или 660 нм, с использованием оптического фильтра;

e) считывание полученных концентраций эндотоксина со стандартной кривой, полученной для кинетического турбидиметрического LAL анализа.