СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭНДОТОКСИНА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2001 года по МПК G01N33/48 G01N33/487 G01N33/49 G01N33/579 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармации и клинической лабораторной диагностике.

Известен способ определения количества эндотоксина (патент N 7015474 B4 Япония, G 01 N 33/579), в котором при проведении исследования в раствор, где протекает реакция между эндотоксином и лизатом амебоцитов японского мечехвоста, добавляют водорастворимый полисахарид, структурным компонентом которого является β - 1,3-гликан и/или водорастворимое производное этого полисахарида, в количестве 100 нг/мл - 100 мг/мл. Таким образом определяют следовое количество эндотоксина в образце.

Известен способ измерения концентрации эндотоксина (патент N 0350273 B1 ЕПВ, G 01 N 33/579), в котором измерение производят по изменению оптической плотности вследствие реакции AL-раствора с эндотоксином.

Известен способ определения количества эндотоксина (Ситников А.Г., Травина Л. А. , Багирова В.П. ЛАЛ-Тест. Современные подходы к определению пирогенности. - М., 1997, 96 стр.) путем смешивания лимулюс лизата и разведения испытуемого образца с последующей регистрацией результата анализа по образованию полимера коагулогена в последнем разведении. Причем приготовленные пробы отрицательного контроля, стандартных разведений эндотоксина и разведений препарата вносятся в пробирки для постановки гельтромб теста по 0,1 мл в каждую. Получившую реакционную смесь (в объеме 0,2 мл) надо аккуратно перемешать в течение 2 - 3 с, и пробирку поместить в водяную баню или суховоздушный инкубатор. Время инкубации составляет (60 ± 2) мин при температуре 37^oC ± 1^oC. Каждую пробирку медленно и аккуратно переворачивают вверх дном и по наличию геля на дне пробирки, не разрушающегося при переворачивании пробирки, определяют концентрацию эндотоксина в данной пробе, которая считается равной или больше чувствительности LAL-реактива.

Этот способ характеризуется недостаточной чувствительностью (не более 0,001 EU/мл), большим расходом реагентов на проведение реакции.

Задачей данного изобретения является повышение чувствительности способа и уменьшение расхода реагентов на проведение реакции.

Это достигается тем, что согласно способу определения активности эндотоксина путем смешивания лимулюс лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси.

Также это достигается тем, что согласно способу определения активности эндотоксина путем смешивания лимулюс лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении смешивание лимулюс лизата и разведения исследуемого образца производят нанесением на пластиковую поверхность 2 - 8 мкл растворов лимулюс лизата и разведения испытуемого раствора, пластиковую поверхность с нанесенными реагентами закрывают крышкой и инкубируют в течение 30 мин при 37^oC, после чего открывают и выдерживают в термостате до высыхания капель смеси реагентов, при этом регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов, причем при наличии эндотоксина наблюдают фракталы - специфические кристалловидные структуры, а при отсутствии эндотоксина или в отрицательном контроле наблюдают ровное поле с редкими вкраплениями по краям поля ромбических кристаллов солей.

Кроме того, в способе определения активности эндотоксина смешивание производят на апирогенной пластиковой поверхности.

На фиг. 1 - 3 показаны изображения белковых фракталов при наличии эндотоксина.

На фиг. 4 показано изображение белковых фракталов при отсутствии эндотоксина.

Способ осуществляют следующим образом.

По варианту 1. На апирогенную пластиковую поверхность (чашка Петри, планшет для ИФА) наносят микроколичество (капля 6 мкл) растворов лимулюс лизата и разведения испытуемого раствора с использованием варипипеток с апирогенными наконечниками. Пластик с нанесенными реагентами инкубируют 30 мин при 37^oC, после чего чашку Петри (или планшет для ИФА) открывают и выдерживают в термостате до высыхания капель смеси реагентов. Затем при наличии эндотоксина образуются фракталы - специфические кристалловидные структуры (фиг. 1, 2, 3), а при отсутствии эндотоксина или в отрицательном контроле (апирогенная вода) капля высыхает в виде ровного поля с редкими вкраплениями по краям поля ромбических кристаллов солей, иногда присутствующих в испытуемых образцах (фиг. 4). Необходимо использовать для исследований поверхность для смешения из материала, у которого снижена до минимума вероятность адсорбции эндотоксинов, что также относится и к варипипеткам. Рабочее разведение лимус лизата готовят согласно рекомендациям фирмы изготовителя (Sigma Technical Bulletin N 210. Previous Revision November 1993. Revised January 1994). Стандартные разведения эндотоксина готовят согласно рекомендациям, приведенным в сборнике Ситников А.Г., Травина Л.А., Багирова В. П. ЛАЛ-Тест. Современные подходы к определению пирогенности.

Осуществление способа по варианту 2 описывается следующим примером. Определение активности эндотоксина в сыворотке (плазме) крови по образованию фракталов.

Подготовка образцов сыворотки. Забор крови у пациента осуществляется апирогенным шприцом, переносится в апирогенную (стеклянную или пластиковую) пробирку, выдерживается в термостате 30 мин при 37^oC для полного свертывания крови и ретракции сгустка. 10 мкл сыворотки переносится в пробирку с 90 мкл дистиллированной воды, свободной от эндотоксина, и прогревается в течение 2-3 мин при 100^oC для денатурации сывороточных белков и высвобождения связанного с белками и липопротеидами эндотоксина (Ситников А.Г., Травина Л.А., Багирова В.П. ЛАЛ-Тест. Современные подходы к определению пирогенности). Все операции проводятся в условиях, препятствующих попаданию эндотоксина из внешней среды в испытуемые образцы и используемые реагенты.

Подготовка стандартных разведений эндотоксина. На апирогенную полистироловую поверхность на расстоянии 1 см друг от друга наносят варипипеткой 6 мкл рабочего разведения лимус-лизата по числу исследуемых образцов и стандартных разведений эндотоксина. Рабочее разведение лимус-лизата готовят согласно рекомендациям фирмы изготовителя (Sigma Technical Bulletin N 210. Previous Revision November 1993. Revised January 1994.). Сверху на капли лизата наносят 6 мкл разведений образцов, закрывают крышкой для предотвращения высыхания и помещают в стерильный термостат 37^oC на 30 мин.

Учет результата. Через 30 мин инкубации пластиковую поверхность открывают и оставляют в том же термостате на срок до высыхания смеси реагентов, что в среднем составляет 25-35 мин. Результат учитывают визуально под увеличением х10 - х20. При положительной реакции высушенные пятна смеси реагентов имеют вид "зимнего стекла", "еловой ветви", "снежинки". Учитывают последнее разведение, где еще встречается подобная реакция.

В таблице приведены результаты проведения реакции с вышеуказанными разведениями эндотоксина и по 3 образца сывороток от здоровых доноров и пациентов с вирусным гепатитом C.

По результатам, приведенным в таблице, использованная партия лимулюс лизата в предлагаемой постановке теста имеет чувствительность 0,0001 EU/мл. Соответствующие образцы исследованных проб имели следующие активности эндотоксина:
Гепатит 1 - 0,0001 • 80 = 0,008 EU/мл.

Гепатит 2 - 0,0001 • 800 = 0,08 EU/мл.

Гепатит 3 - 0,0001 • 10 = 0,001 EU/мл.

Донор 1 - 0,0001 • 10 = < 0,0005 EU/мл.

Донор 2 - 0,0001 • 10 = 0,001 EU/мл.

Донор 3 - 0,0001 • 20 = 0,002 EU/мл.

В приведенном примере были использованы объемы лимулюс лизата и разведения исследуемого образца по 6 мкл. Аналогичные результаты были получены для объемов 2 - 8 мкл.

В приведенном примере предлагаемый способ обеспечивает чувствительность 0,0001 EU/мл, сокращает время постановки и оценки результата до одного часа, сокращает потребление лимус лизата в 50-100 раз (в зависимости от количества необходимых разведений), не требует дополнительных реагентов и специального оборудования и доступен для любой клинической и аналитической фармацевтической лаборатории.

Таким образом, предлагаемый способ определения активности эндотоксина повышает чувствительность определения активности и уменьшает расход реагентов на проведение реакции. Кроме того, доступен для любой клинической и аналитической фармацевтической лаборатории, так как не требует специального дорогостоящего оборудования и дополнительных реагентов.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармации и клинической лабораторной диагностике. Согласно способу определения активности эндотоксина путем смешивания лимулюс лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов после высушивания смеси, а также согласно способу смешивание лимулюс лизата и разведения исследуемого образца производят нанесением на пластиковую поверхность 2 - 8 мкл растворов лимулюс лизата и разведения испытуемого раствора, пластиковую поверхность с нанесенными реагентами закрывают крышкой и инкубируют в течение 30 мин при 37°C, после чего открывают и выдерживают в термостате до высыхания капель смеси реагентов, при этом регистрацию образования полимера коагулогена производят по структуре образующихся белковых фракталов, причем при наличии эндотоксина наблюдают фракталы - специфические кристалловидные структуры, а при отсутствии эндотоксина или в отрицательном контроле наблюдают ровное поле с редкими вкраплениями по краям поля ромбических кристаллов солей. Изобретение позволяет повысить чувствительность определения активности эндотоксина, доступен для любой клинической лаборатории. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

1. Способ определения активности эндотоксина путем смешивания лимулюс лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении, отличающийся тем, что регистрацию образования полимера коагулогена производят под увеличением по образующимся белковым фракталам после высушивания смеси и при наличии фракталов определяют активность эндотоксина в последнем разведении. 2. Способ определения активности эндотоксина по п.1, отличающийся тем, что смешивание производят на апирогенной пластиковой поверхности. 3. Способ определения активности эндотоксина путем смешивания лимулюс лизата и разведения исследуемого образца с последующей регистрацией образования полимера коагулогена в последнем разведении, отличающийся тем, что смешивание лимулюс лизата и разведения исследуемого образца производят нанесением на пластиковую поверхность 2 - 8 мкл растворов лимулюс лизата и разведения испытуемого раствора, пластиковую поверхность с нанесенными реагентами закрывают крышкой и инкубируют в течение 30 мин при 37^oC, после чего открывают и выдерживают в термостате до высыхания капель смеси реагентов, при этом регистрацию образования полимера коагулогена производят под увеличением образующимся белковым фракталам и при наличии фракталов определяют активность эндотоксина в последнем разведении. 4. Способ определения активности эндотоксина по п.4, отличающийся тем, что смешивание проводят на апирогенной пластиковой поверхности.