СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАПСУЛ С ЖИДКИМ ЯДРОМ ДЛЯ ЖИДКОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Российский патент 2008 года по МПК C12N11/04 C12N11/14 

Изобретение относится к производству капсул с иммобилизованными микроорганизмами, в частности к технологии создания капсул с жидким ядром, предназначенных для процессов жидкофазного культивирования, содержащих иммобилизованные культуры микроорганизмов.

Для подобного рода капсул важнейшим критерием качества является способность защитить иммобилизованные микроорганизмы от воздействия стрессовых факторов (механическое воздействие при перемешивании, загрязнения культуральной жидкости и т.д.), не влияя при этом на связь клеток с внешней средой. В достаточно высокой степени этим требованиям отвечают капсулы из альгината кальция.

Известен способ получения капсул из альгината кальция с иммобилизованными микроорганизмами Lactococcus lactis subsp. lactis DPC 3147 - продуцентами низина. Клетки микроорганизма диспергировали в 2,0% растворе альгината натрия. Полученную смесь по каплям подавали в 2,0% раствор хлорида кальция. Образовавшиеся в результате ионообменной реакции капсулы из альгината кальция выдерживали в этом растворе в течение 1 ч, до полного затвердевания (Scannell A.G.M., Hill С., Ross R.P., Marx S., Hartmeier W., Arendt Е.К. Continuous production of lacticin 3147 and nisin using cells immobilized in calcium alginate. Journal of Applied Microbiology, No. 89, pp.573-579, 2000).

В следующем способе (Wang H., Seki M., Furusaki S. Mathematical model for analysis of mass transfer for immobilized cells in lactic acid fermentation. Biotechnol. Prog., No. 11, pp.558-564, 1995) для иммобилизации Lactobacillus delbrueckii IFO 3534 использовали 4,0% исходный раствор альгината натрия, 1,5% раствор хлорида кальция, а время выдержки капсул в растворе составляло от 20 до 40 минут.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения капсул с клетками дрожжей для жидкофазного культивирования (Nedovic V., Bezbradica D., Leskosek-Cukalovic I., Obradovic В., Stancovic Z., Korac A., Bugarski B. Main beer fermentation in a gas-lift bioreactor by yeast cells immobilized in porous matrices. Proceedings of XII International workshop on bioencapsulation. Vitoria, Spain, pp.125-128, 2004). Клетки микроорганизмов (Saccharomyces uvarum) диспергировали в 2,0% растворе альгината натрия. Полученную смесь по каплям подавали в 2,0% раствор хлорида кальция. Образовавшиеся капсулы выдерживали в этом растворе в течение 30 минут до полного затвердевания.

Главным недостатком всех описанных выше способов получения кальций-альгинатных капсул является невысокая скорость обменных процессов между иммобилизованной клеткой и внешней средой, обусловленная внутридиффузионным торможением. Это происходит по причине сравнительно высокой концентрации исходного раствора альгината натрия, а также за счет того, что при выдержке в растворе хлорида кальция более 20÷25 минут капсула затвердевает полностью. На практике эти обстоятельства приводят к значительному увеличению времени ферментации.

В основу настоящего изобретения положена задача создания технологического процесса, реализация которого позволит получить капсулы с жидким ядром, характеризующиеся малым внутридиффузионным сопротивлением.

Техническим результатом является создание способа получения капсул с проницаемой оболочкой для жидкофазного культивирования, которые характеризуются малым внутридиффузионным торможением.

Поставленная задача и технический результат достигаются тем, что в способе получения капсул с жидким ядром для жидкофазного культивирования путем диспергирования клеток микроорганизмов в альгинате натрия и внесения полученной смеси по каплям в раствор хлорида кальция согласно изобретению использовали раствор альгината натрия концентрацией 1,0÷1,5%, а время выдержки образовавшихся капсул в растворе хлорида кальция составило 4÷5 минут. Концентрация раствора хлорида кальция должна составлять 2,0÷2,5%.

Использование раствора альгината натрия с низкой концентрацией (1,0÷1,5%) приводит к повышенной проницаемости кальций-альгинатной оболочки. В качестве критерия, по которому оценивали проницаемость кальций-альгинатных капсул, использовали коэффициент эффективной диффузии модельного вещества - метронидазола. Оптимальным значением концентрации раствора альгината натрия, используемого для получения капсул, было признано значение в пределах 1,0÷1,5%. Меньшая концентрация не обеспечивает необходимую прочность оболочки. Использование растворов с концентрацией выше 1,5% приводит к уменьшению значения коэффициента диффузии метронидазола, а следовательно, к снижению скорости обменных процессов при ферментации. Сокращение времени выдержки капсул в растворе хлорида кальция в течение 4÷5 минут приводит к образованию внутри капсулы жидкого ядра, так как за это время реакция гелеобразования успевает произойти только на поверхности капсул, образуется оболочка толщиной 0,5÷0,9 мм. За меньшее время выдержки образовавшаяся оболочка не успевает набрать необходимую прочность. Увеличение времени выдержки приводит к утолщению оболочки, а за 30 минут нахождения в растворе хлорида кальция капсулы затвердевают полностью. Оптимальная концентрация раствора хлорида кальция составляет 2,0÷2,5%. Использование растворов меньшей концентрации увеличивает время образования оболочки, а дальнейшее увеличение концентрации не влияет на скорость процесса.

Изобретение поясняется графиками, где на фиг.1 показана зависимость коэффициента эффективной диффузии метронидазола от концентрации исходного раствора альгината натрия; на фиг.2 - зависимость толщины оболочки из альгината кальция от времени выдержки капсул в 2,0% растворе CaCl₂; на фиг.3 - график изменения массы сахарозы в процессе спиртового брожения.

Способ получения капсул с жидким ядром для жидкофазного культивирования осуществляют следующим образом.

Клетки микроорганизмов диспергируют в 1,0% растворе альгината натрия. Полученную дисперсию по каплям подают в 2,0% раствор хлорида кальция. В результате ионообменной реакции между альгинатом натрия и хлоридом кальция на поверхности капель образуется оболочка из нерастворимого альгината кальция. Таким образом, формируются капсулы с жидким ядром из непрореагировавшего альгината натрия, ограниченного кальций-альгинатной оболочкой. Для образования оболочки капсулы выдерживают в растворе в течение 5 минут. Капсулы отделяют от раствора на сетке, промывают дистиллированной водой и используют в дальнейших исследованиях.

Пример 1.

В качестве модельных микроорганизмов для отработки методики получения капсул с жидким ядром были выбраны дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae, отличающиеся малым временем инкубационного периода и высокой скоростью биокатализа.

Состав питательной среды, используемой в экспериментах:

- дистиллированная вода: 100 мл;

- сахароза: 3 г (содержание влаги: 8,3%);

- К₂HPO₄: 0,5 г;

- MgSO₄: 0,3 г;

- дрожжи, иммобилизованные в матрице: 3 г.

Температура среды: 32°С.

Для устранения влияния внешнедиффузионного торможения при массообмене иммобилизованных клеток с внешней средой осуществляли перемешивание среды биореактора со скоростью 100÷150 об./мин.

Концентрация исходного раствора альгината натрия, использованного для получения капсул, 1,0%. Капсулы выдерживали в 2,0% растворе CaCl₂ в течение 5 минут, что приводит к образованию оболочки из альгината кальция толщиной в среднем 0,8 мм. Диаметр полученных капсул в среднем составил: 3,5 мм.

Капсулы с иммобилизованными клетками вносили в предварительно нагретую до температуры 32°С среду, после чего включали перемешивание. Кинетику процесса контролировали по объему выделившегося углекислого газа, через который рассчитывалась масса сброженной сахарозы.

Длительность процесса сбраживания 3 г сахарозы клетками дрожжей, иммобилизованных в капсулах с жидким ядром, составила 80 минут. Данный пример поясняется графическим материалом, где на фиг.3 показан график зависимости времени сбраживания сахарозы от наличия в капсуле жидкого ядра. Капсулы с жидким ядром обладают малым внутридиффузионным сопротивлением, что приводит к ускорению процесса спиртового брожения.

Пример 2.

Опыт проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что капсулы выдерживали в 2,0% растворе хлорида кальция в течение 30 минут, что приводило к их полному затвердеванию. Длительность процесса сбраживания 3 г сахарозы клетками дрожжей, иммобилизованных в капсулах с жидким ядром, составила 120 минут.

Использование исходного раствора альгината натрия концентрацией 1,0÷1,5% и выдержка капсул в 2,0÷2,5% растворе хлорида кальция в течение 4÷5 минут позволила получить капсулы с жидким ядром, которые характеризуются достаточной механической прочностью и малым внутридиффузионным торможением. Использование таких капсул с иммобилизованными дрожжами ускоряет процесс сбраживания сахарозы в 1,5 раза по сравнению с полностью затвердевшими капсулами.

Данный способ получения оболочки капсул пригоден для реализации в лабораторных и полупромышленных условиях на существующем оборудовании для производства капсул с иммобилизованными клетками микроорганизмов, предназначенных для жидкофазного культивирования. В настоящее время способ находится на стадии лабораторных экспериментов.

Изобретение относится к биотехнологии. Капсулы с жидким ядром получают путем внесения по каплям раствора альгината натрия концентрацией 1,0÷1,5% с клетками микроорганизма в раствор хлорида кальция концентрации 2,0÷2,5%. Время выдержки образовавшихся капсул в растворе хлорида кальция устанавливают равным 4-5 мин. Изобретение позволяет получить капсулы с жидким ядром, характеризующиеся малым внутридиффузионным сопротивлением, что обеспечивает ускорение обменных процессов между иммобилизованной клеткой и внешней средой при жидкофазном культивировании. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения капсул с жидким ядром для жидкофазного культивирования путем диспергирования клеток микроорганизмов в альгинате натрия и внесения полученной смеси по каплям в раствор хлорида кальция, отличающийся тем, что концентрация раствора альгината натрия составляет 1,0÷1,5%, а выдержку капсул в растворе хлорида кальция ведут 4÷5 мин.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация раствора хлорида кальция составляет 2,0÷2,5%.