СПОСОБ ТЕРАПИИ ТОКСИЧЕСКОГО ШОКА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧУМЕ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к особо опасным инфекционным заболеваниям, и может быть использовано, в частности, в решении проблемы коррекции токсического шока при чумной инфекции и интоксикации.

В настоящее время существует проблема лечения чумной инфекции, основной причиной которой является иммуносупрессия (Дмитровский A.M., Кугач И.В., 1994 г. - Опыт лечения чумы во Вьетнаме).

Известен способ регуляции функций иммунокомпетентных клеток с помощью нейтрофилакинов (см. Васильева Г.И., Козловский В.Н., Киселева А.К. и др. «Роль нейтрофилакинов в формировании гуморального противочумного иммунитета», журнал Иммунология №4, 2003 г., с.219-221), заключающийся в том, что при введении в условиях in vitro спленоциты интактных мышей отвечают на контакт с дезинтегратом бактериальной массы Y. pestis EV увеличением синтеза специфических антител, превышающим спонтанную продукцию иммуноглобулинов в 4 раза, имитируя первичный иммунный ответ, в то время как спленоциты иммунизированных животных, следуя сценарию развития вторичного иммунного ответа, увеличивают продукцию противочумных антител, в 16 раз превышающую спонтанную.

Однако очевидная роль нейтрофилокинов в формировании гуморального иммунитета подтолкнула авторов на исследование воздействия нейтрофилокинов на течение токсического шока, вызванного чумной инфекцией.

За прототип выбран способ терапии чумы (см. A.M.Дмитровский, И.В.Кугач. «Клинические аспекты современной чумы», книга «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», Госкомстат комитет санитарно-эпидемиологического надзора РФ, Ставрополь, 1994 г., с.31, 32), заключающийся в том, что на этапе терапии инфекционно-токсического шока осуществляют внутривенное введение глюкокортикоидов в виде короткого ударного курса до стабилизации гемодинамики, но не более 3-х суток.

Однако

- во-первых, за трехдневный срок лечения гидрокортизоном чаще всего гемодинамику (кровообращение, давление) восстановить не удается;

- во-вторых, терапия кортикостероидами без учета гормонального фона организма может вызвать усиление патологии, так как гормональные препараты обладают иммуносупрессивным (подавляющим иммунитет) действием, вплоть до апоптоза (разрушения иммунокомпетентных клеток).

Цель предлагаемого изобретения состояла в повышении эффективности терапии токсического шока путем применения новых средств, осуществляющих коррекцию гемодинамики и иммунной системы организма.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе терапии токсического шока у лабораторных животных при экспериментальной чуме, включающем использование препаратов, в качестве последних используют гомологичные хелперные фракции нейтрофилокинов, разведенные в изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 2ЕД₅₀, которые вводят биопробным животным подкожно в заднюю лапку в объеме 0,2 мл за 30-40 мин до гибели контрольной группы животных, находящихся в состоянии токсического шока.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно готовят гомологичные хелперные фракции нейтрофилокинов от разных видов животных, а именно белых мышей и морских свинок.

Для этого из супернатантов (монослой культуры нейтрофилов), стимулированных in vitro микробными клетками вакцинного штамма чумного микроба Y.pestis EV-76 методом гельфильтрации на сефадексе Г-75, получают фракции пептидов с различной молекулярной массой, часть из которых усиливает (хелперное действие) функциональную активность иммунокомпетентных клеток, а именно:

- повышает киллерную активность макрофагов в отношении чумного микроба;

- усиливает дифференцировку моноцитов в макрофаги;

- увеличивает экспрессию мембранных иммуноглобулинов на поверхности В-лимфоцитов.

После этого проводят терапию животных, для этого гомологичные хелперные фракции нейтрофилокинов, разведенные в изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 2ЕД₅₀, вводят подопытным животным подкожно в заднюю лапку в объеме 0,2 мл. Животные находятся в состоянии токсического чумного шока. Через 24 часа производят окончательный учет результатов. Контрольная группа животных, не получавшая лечения хелперными фракциями, погибала, а белые мыши и морские свинки, получавшие 2ЕД₅₀ гомологичных хелперных фракций нейтрофилокинов, выживали. При этом хелперные фракции вводили подопытным животным за 30-40 мин до гибели контрольной группы животных, находящихся в состоянии чумного токсического шока.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Терапия чумного эндотоксинового и септического шока на модели белых мышей.

Для создания инфекционно-токсической модели белых мышей заражали культурой вакцинного штамма чумного микроба ЕВ линии НИИЭГ, выращенной в течение 3 суток на агаре Хоттингера при 37°С. Мышей заражали взвесью культуры в 0,85% изотоническом растворе хлористого натрия внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. В предварительных экспериментах была вычислена смертельная доза 2ЛД₅₀ липополисахаридного токсина чумного микроба, полученного по методу Вестфаля и дефосфорилированного по оригинальной методике, разработанной в лаборатории иммунологии Рост. НИПЧИ (Беспалова И.А. и др., 1995). Для мышей смертельная доза токсина (2ЛД₅₀) составляла 870 мкг/мышь.

Терапию проводили по 2-м направлениям.

I. Каждую из моделей пролечивали гидрокортизоном, для этого двукратные разведения последнего в 0,85% изотоническом растворе хлористого натрия вводили зараженным мышам подкожно в объеме 0,2 мл через 2 часа после заражения.

Для вычисления 2ЕД₅₀ гидрокортизона по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П., Воробьева А.А. (1962) заражали 4 группы мышей по 6 мышей в группе. Контрольные группы (также по 6 мышей в группе) были заражены 2ЛД₅₀ культуры без лечения гидрокортизоном или наивысшей испытанной дозой гидрокортизона без заражения культурой. В таблице 1 представлены результаты терапии инфекционно-токсического и эндотоксинового шока у белых мышей с помощью гидрокортизона.

Вывод: таким образом, при заражении мышей Y.pestis и возникновении инфекционно-токсического шока для лечения достаточно 65 мкг гидрокортизона, а при эндотоксиновом шоке - 67 мкг.

Следовательно, для белых мышей, чувствительных к гидрокортизону, можно подобрать дозу, защищающую их от инфекционного и эндотоксинового шока.

II. Новую терапию осуществляли на тех же моделях (инфекционно-токсической и эндотоксиновой), но с помощью хелперных фракций гомологичных (мышиных) нейтрофилокинов. Двукратные разведения фракций вводили подкожно в объеме 0,2 мл во внутреннюю часть бедра задней лапы. Каждая группа состояла из 6 мышей и сопровождалась теми же контролями, которые были взяты при лечении гидрокортизоном. ЕД₅₀ фракций нейтрофилокинов определяли по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П., Воробьева А.А. (1962).

Результаты коррекции токсического шока хелперными фракциями нейтрофилокинов на модели белых мышей представлены в таблице 2, где наблюдаем, что для коррекции токсического шока природный препарат, полученный из иммунокомпетентных клеток животных, дает результат не хуже, чем при использовании гидрокортизона.

Следовательно, гибель мышей от шока можно предотвратить посредством хелперных фракций нейтрофилокинов, взятых в количестве 2ЕД₅₀.

Пример 2. Терапия чумного эндотоксинового и септического шока на модели морских свинок.

Для создания инфекционно-токсической модели морских свинок заражали культурой вакцинного штамма чумного микроба ЕВ линии НИИЭГ, выращенной в течение 3 суток на агаре Хоттингера при 28°С. Свинок заражали взвесью культуры в 0,85% изотоническом растворе хлористого натрия внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Доза заражения составляла 2ЛД₅₀ (738 млрд.м.кл. на свинку).

Модель эндотоксинового шока на морских свинках воспроизводили с помощью внутрибрюшинной инъекции 2ЛД₅₀ (смертельной дозы) липополисахаридного токсина чумного микроба, полученного по методу Вестфаля и дефосфорилированного по оригинальной методике, разработанной в лаборатории иммунологии Рост. НИПЧИ (Беспалова И.А. и др., 1995). Для свинок смертельная доза токсина (2ЛД₅₀) составляла 1500 мкг/свинку.

Терапию так же, как и в первом примере проводили гидрокортизоном, к которому морские свинки резистентны, и хелперными фракциями нейтрофилокинов.

Двукратные разведения гидрокортизона в 0,85% изотоническом растворе хлористого натрия вводили зараженным свинкам подкожно в объеме 0,2 мл через 2,5 часа после заражения. Для установления величины ЕД₅₀ гидрокортизона по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П., Воробьева А.А. (1962) заражали 4 группы свинок по 6 свинок в каждой. Контрольные группы (также состоявшие из 6 животных) были заражены 2ЛД₅₀ культуры без лечения гидрокортизоном или наивысшей испытанной дозой гидрокортизона без заражения культурой. В таблице 3 представлены результаты терапии гидрокортизоном инфекционно-токсического и эндотоксинового шока у морских свинок.

Вывод: коррекция гидрокортизоном токсического шока большими дозами (до 30 мг) дает эффект, близкий к сенсибилизации.

В таблице 4 представлены результаты терапии инфекционно-токсического и эндотоксинового шока у морских свинок хелперными фракциями гомологичных нейтрофилокинов, полученных из нейтрофилов морских свинок. Двукратные разведения фракций вводили подкожно в объеме 0,2 мл во внутреннюю часть бедра задней лапы. Испытаны 4 доза нейтрофилокинов. Каждая группа состояла из 6 свинок и сопровождалась теми же контролями, которые были взяты при лечении гидрокортизоном. ЕД₅₀ фракций нейтрофилокинов определяли по методу Кербера в модификации Ашмарина И.П., Воробьева А.А. (1962).

Из таблицы видно, что хелперные фракции нейтрофилокинов морских свинок в дозах ЕД₅₀ от 10-30 мкг белка/мл работают значительно эффективнее, чем дозы стероидных препаратов, имеющие свои недостатки и снижающие иммунитет животных.

Таким образом, результаты примеров подтверждают, что использованные в качестве терапевтического препарата при чумном токсическом шоке хелперные фракции нейтрофилокинов предотвращают гибель биопробных животных, корректируя гемодинамику и активируя иммунную систему последних.

Использование гомологичных фракций нового вида цитокинов, полученных из нейтрофилов, - нейтрофилокинов, которые обладают хелперным действием в отношении иммунокомпетентных клеток, как средства терапии чумного токсического шока подтверждено на моделях животных, чувствительных и резистентных к терапии кортикостероидными гормонами.

В виду того, что чума является особо опасной высококонтагиозной инфекцией, совершенствование способов эффективной терапии чумного токсического шока имеет немаловажное значение для разработки правильной стратегии лечения больных, имеющих иммунные расстройства и нарушения в работе иммунной системы.

Таблица 1Коррекция гидрокортизоном токсического шока у мышейY.pestis EV (37°С) (2LD₅₀)ЛПС чумного микроба (2LD₅₀)Доза гидрокортизона (мкг)Летальность*ЕД₅₀Доза гидрокортизона (мкг)Летальность*ЕД₅₀ гидрокортизона0 контроль культуры6/6*650 контроль культуры6/667626/61006/61253/62005/62504/64004/65000/68004/65002/68000/6* - в числителе указано количество павших животных, в знаменателе - количество животных в группе.

Таблица 2Коррекция токсического шока с помощью фракций нейтрофилокинов на модели белых мышейY.pestis EV (37°С) (2LD₅₀)ЛПС чумного микроба (2LD₅₀)Доза нейтрофилокинов (мкг)Летальность*ЕД₅₀ (мкг белка/мл)Доза нейтрофилокинов (мкг)Летальность*ЕД₅₀ (мкг белка/мл)0 контроль культуры6/6* 0 контроль культуры6/6 2,32/6 0,256/6 4,54/6 0,55/6 92/6 13/6 182/6 23/6* 18 (контроль нейтрофилокинов без введения культуры)0/67,32 (контроль нейтрофилокинов без введения токсина)0/61,3* - в числителе указано количество павших животных, в знаменателе - количество животных в группе.

Таблица 3Коррекция гидрокортизоном токсического шока на модели морских свинокY.pestis EV (28°С) (2LD₅₀)ЛПС чумного микроба (2LD₅₀)Доза гидрокортизона (мкг)Летальность*ЕД₅₀ (мг)Доза гидрокортизона (мкг)Летальность*ЕД₅₀ (мг)0 контроль культуры6/6*3,240 контроль культуры6/615,713/61,254/621/62,55/642/656/680/6104/680/6100/6* - в числителе указано количество павших животных, в знаменателе - количество животных в группе.

Таблица 4Коррекция токсического шока с помощью фракций нейтрофилокинов на модели морских свинокY.pestis EV (37°С) (2LD₅₀)ЛПС чумного микроба (2LD₅₀)Доза нейтрофилокинов (мкг)Летальность*ЕД₅₀ (мкг белка/мл)Доза нейтрофилокинов (мкг)Летальность*ЕД₅₀ (мкг белка/мл)0 (контроль культуры)6/6* 0 (контроль культуры)6/6 3,85/6 5,15/6 7,52/6 10,25/6 155/6 20,54/6 300/6 410/6 30 (контроль нейтрофилокинов без введения культуры)0/67,341 (контроль нейтрофилокинов без введения токсина)0/61,3* - в числителе указано количество павших животных, в знаменателе - количество животных в группе.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Гомологичные хелперные фракции нейтрофилокинов, разведенные в изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 2ЕД₅₀, вводят биопробным животным подкожно в заднюю лапку в объеме 0,2 мл за 30-40 мин до гибели контрольной группы животных, находящихся в состоянии токсического шока. Хелперные фракции нейтрофилокинов предотвращают гибель биопробных животных, корректируют гемодинамику и активируют иммунную систему. 4 табл.

Способ терапии токсического шока у лабораторных животных при экспериментальной чуме, включающий использование препаратов, отличающийся тем, что в качестве препарата используют гомологичные хелперные фракции нейтрофилокинов, разведенные в изотоническом растворе хлорида натрия в дозе 2ЕД₅₀, которые вводят биопробным животным подкожно в заднюю лапку в объеме 0,2 мл за 30-40 мин до гибели контрольной группы животных, находящихся в состоянии токсического шока.