СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СПОСОБНОСТИ К БИОСИНТЕЗУ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/569 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике чумной инфекции.

Традиционная лабораторная диагностика чумы включает выявление продукции капсульного антигена (фракция I) у штаммов чумного микроба (Руководство по профилактике чумы. Саратов, 1992). При длительном хранении, многочисленных пересевах и по другим причинам отдельно взятые штаммы чумного микроба в результате фенотипической изменчивости перестают продуцировать фракцию I (ФI). Отсутствие этого важного таксономического признака затрудняет обнаружение и дифференциальную диагностику чумы серологическим методом, а поэтому необходимо восстановление биосинтеза капсульного антигена.

Известен способ подготовки штаммов чумного микроба для определения капсульного антигена, выбранный прототипом, который включает засев штаммов на агар Хоттингера pH 7,2 с 1% гемолизированной крови и выращивание в течение 2-х суток при температуре (37±0,5)^oC. Из выращенных штаммов готовят взвеси концентрацией 10⁹ м.к./мл по ОСО мутности 42.28-59-85, инактивируют добавлением формалина до 2%-ной концентрации и исследуют в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) (Инструкция по применению диагностикума чумного иммуноглобулинового сухого и жидкого, М., 1987).

Недостатком этого способа является то, что при таком выращивании штаммов чумного микроба и культур, подозрительных на чуму, фенотипически утративших этот признак, отсутствует биосинтез фракции I в количестве, необходимом для обнаружения в РНГА. Поэтому возникает необходимость в предварительной подготовке штаммов перед определением капсульного антигена, направленной на восстановление биосинтеза этого антигена.

Естественной средой обитания чумного микроба является кровь животных, но добавление ее в твердые и жидкие питательные среды оказывается недостаточным для проявления типичных свойств указанного возбудителя. Для этого необходимо присутствие других факторов, находящихся в организме животного. Поэтому необходима постановка биологической пробы и выделение культуры от животных, павших в результате сепсиса. Но штаммы чумного микроба, не продуцирующие фракцию I, чаще всего теряют вирулентность и не способны вызвать сепсис.

Известен способ, позволяющий, не вызывая сепсиса, локально накапливать большое количество клеток чумного микроба в биопробе с образованием фракции I. Он включает введение биопробным животным (белые мыши) подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,002-0,005 мг натрия азида и 0,02-0,1 мг кадмия хлористого. Патологический материал берут с места введения через 24-48 ч, инактивируют и исследуют в РНГА (Патент РФ N 2077591, МПК⁶ C 12 Q 1/04, G 01 N 33/569, от 20.04.97 г., Бюл. N 11).

Способ направлен на обнаружение единичных клеток чумного микроба в пробах, загрязненных посторонней микрофлорой, за счет создания оптимальных условий для их размножения и селекции, но они недостаточно надежны, согласно проведенным исследованиям, для восстановления биосинтеза фракции I у штаммов, фенотипически утративших этот признак (табл. 1), невозможность количественного определения содержания капсульного антигена по отношению к количеству микробных клеток в суспензиях из места введения; использование ингибиторов роста посторонней микрофлоры, что связано с загрязненностью пробы, а при исследовании чистых культур в этом нет никакой необходимости, тем более, что ингибиторы сами могут частично подавлять рост чумного микроба, и проявление типичных фенотипических свойств.

Указанные недостатки затрудняют определение капсульного антигена (ФI) у отдельных штаммов чумного микроба.

Целью предлагаемого изобретения является повышение надежности восстановления продукции капсульного антигена (ФI) у штаммов чумного микроба, утративших его биосинтез в результате фенотипической изменчивости, с последующим определением количества фракции I в взвесях микробных клеток.

Поставленная цель достигается тем, что биопробным животным (белые мыши) подкожно в область спины вводят 0,5-0,7 мл суспензии в физрастворе исследуемой культуры в концентрации 10³-10⁵ м.к./мл, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 1,5-2,0 мл цитратной крови барана и 5-7 мг циклофосфана, а патологический материал с места введения забирают через 46-48 ч для подращивания на агаре Хоттингера pH 7,2 с 1%-ной гемолизированной кровью при 37^oC в течение 48 ч. Капсульный антиген (ФI) обнаруживается в РНГА при исследовании материала непосредственно из места введения и во взвесях микробных клеток, полученных путем подращивания материала из места введения, на искусственных питательных средах.

Существенным отличительным признаком заявляемого способа является предварительная подготовка исследуемого материала путем его введения биопробному животному в смеси с предлагаемыми ингредиентами в определенной пропорции с целью создания оптимальных условий для восстановления продукции капсульного антигена (ФI) у чумного микроба.

Добавление к исследуемой культуре цитратной крови барана в концентрации, троекратно превышающей таковую в Патенте РФ N 2077591, создает наиболее оптимальные условия для восстановления биосинтеза капсульного антигена и селективного накопления клеток с продукцией фракции I. Но это происходит только в организме животного (белая мышь), из которого чумной микроб получает все необходимые факторы для роста и продукции фракции I.

Введение животному не единичных микробных клеток, а в концентрации 10³-10⁵ м.к./мл в объеме 0,5-0,7 мл, обеспечивает не только надежное накопление микробных клеток через 46-48 ч в месте введения, но и селективное накопление клеток с активным биосинтезом фракции 1. При увеличении концентрации клеток, вводимых животному, снижается вероятность накопления микробов в процессе селекции с высокой продукцией капсульного антигена.

Использование циклофосфана в качестве иммунодепрессанта в смеси с желтком куриного яйца создает наиболее оптимальные условия для локального размножения чумного микроба и защиты от иммунной системы, не оказывая влияния на биосинтез фракции I.

Увеличение времени нахождения исследуемого материала в биопробном животном до 46-48 ч обеспечивает оптимальные условия для селективного накопления клеток, продуцирующих капсульный антиген и накопления самого антигена.

Исключение ингибиторов роста в виде добавок устраняет возможность какого-либо токсического влияния их на клетки возбудителя чумы.

Возможность практического использования заявляемого способа подтверждается примерами экспериментальных исследований.

Пример 1. Из расчета на одно животное берут 0,5-0,7 мл суспензии в физрастворе исследуемой культуры (штамм чумного микроба N 659) в концентрации 10³ м. к./мл смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 1,5 мл цитратной крови барана и 5-7 мг циклофосфана. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 3 белым мышам, которых вскрывают через 46, 47 и 48 часов после заражения. Материал с места введения исследуют серологически и подращивают на агаре Хоттингера pH 7,2 с 1% гемолизированной крови при 37^oC в течение 48 ч. У штаммов чумного микроба, утративших способность к продукции капсульного антигена в результате фенотипической изменчивости (штамм чумного микроба N 659), происходит возобновление биосинтеза фракции I. Капсульный антиген (ФI) обнаруживается в материале из места введения и во взвесях клеток после подращивания на твердых питательных средах.

Пример 2. Из расчета на одно животное берут 0,5-0,7 мл суспензии в физрастворе исследуемой культуры (штамм чумного микроба N 671) в концентрации 10 м.к./мл, смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 2,0 мл цитратной крови барана и 5-7 мг циклофосфана. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 3 белым мышам, которых вскрывают через 40, 47 и 48 ч. Материал с места введения подращивают на arape Хоттингера pH 7,2 с 1% гемолизированной крови при 37^oC в течение 48 ч. У штаммов чумного микроба, утративших в результате фенотипической изменчивости способность к продукции капсульного антигена (штамм чумного микроба N 671), происходит возобновление биосинтеза фракции I. Капсульный антиген обнаруживается в материале из места введения и во взвесях клеток после подращивания на твердых питательных средах.

Пример 3. Из расчета на одно животное берут 0,5-0,7 мл суспензии в физрастворе исследуемой культуры (штамм чумного микроба N 672) в концентрации 10⁵ м.к./мл, смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 2,0 мл цитратной крови барана и 5-7 мг циклофосфана. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 3 белым мышам, которых вскрывают через 46, 47 и 48 ч после заражения. Материал с места введения подращивают на arape Хоттингера pH 7,2 с 1% гемолизированной крови при 37^oC в течение 48 ч. У штаммов чумного микроба, утративших способность к продукции капсульного антигена в результате фенотипической изменчивости (штамм чумного микроба N 672), происходит возобновление продукции фракции I. Капсульный антиген (ФI) обнаруживается из места введения и во взвесях клеток после подращивания на твердых питательных средах.

В табл. 1 приведены сопоставительные результаты восстановления биосинтеза фракции I у штаммов чумного микроба в результате фенотипической изменчивости.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, использование его в микробиологической практике обеспечит надежность диагностики чумного микроба.

Изобретение предназначено для диагностики чумной инфекции. Биопробным животным (белые мыши) подкожно в область спины вводят 0,5-0,7 мл суспензии в физрастворе исследуемой культуры в концентрации 10³-10⁵ м.к./мл. Культуру предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1 : 0,5 - 1 : 0,7. К полученной смеси добавляют 1,5-2,0 мл цитратной крови барана и 5-7 мг циклофосфана. Через 46-48 ч берут патологический материал с места введения исследуемой культуры. Подращивают его на агаре Хоттингера рН 7,2 с 1%-ной гемолизированной кровью при 37°С в течение 48 ч. Далее определяют биосинтез капсульного антигена в серологических реакциях. Изобретение позволяет создать оптимальные условия для восстановления продукции капсульного антигена (Ф1) у штаммов чумного микроба, утративших его биосинтез в результате фенотипической изменчивости. 1 табл.

Способ восстановления способности к биосинтезу капсульного антигена чумного микроба, включающий выращивание исследуемой культуры на агаре Хоттингера рН 7,2 с добавлением 1% гемолизированной крови при 37^oC в течение 48 ч с последующей количественной оценкой результатов биосинтеза фракции 1 в серологических реакциях, отличающийся тем, что биопробным животным подкожно в область спины вводят 0,5 - 0,7 мл суспензии в физрастворе исследуемой культуры в концентрации 10³ - 10⁵ м.к. в 1 мл, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1 : 0,5 - 1 : 0,7, к полученной смеси добавляют 1,5 - 2,0 мл цитратной крови барана и 5 - 7 мг циклофосфана, а на выращивание на питательных средах материал направляют с места введения через 46 - 48 ч.