СПОСОБ ПОСТАНОВКИ БИОПРОБЫ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ЧУМЫ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/04 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при бактериологической диагностике чумы.

Известен способ индикации возбудителя чумы, направленный на ускорение процесса (а.с. СССР 1707080), С 12 Q 1/04, 23.01.92, бюл. 3).

Способ включает введение белым мышам подкожно в область спины 0,51 мл исследуемого материала в одном шприце с таким же объемом смеси гепаринизированной крови морской свинки и желтка куриного яйца в соотношении 1:1:1-1: 7:3 и добавлением кортизона в дозе 5-7 мг на одно животное, а фиксацию мазков-отпечатков с места введения осуществляют в течение 10-20 мин в хлороформе.

Использование этого способа позволяет ускорить процесс индикации возбудителя чумы до 24-48 ч. Однако указанный способ не предусматривает выделение чистой культуры микроба и при высеве патологического материала с места введения на твердые питательные среды имеет место подавления специфического роста возбудителя сопутствующей микрофлорой.

Известен способ лабораторной диагностики чумы, направленный на ускорение выделения и идентификации чумного микроба (патент Р.Ф. 2077591 С 12 Q 1/04 33/569, опубликован 20.04.97 г., бюл. 11).

Способ включает введение биопробным животным (белым мышам) в область спины 0,5-1 мл суспензии в физиологическом растворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,002-0,005 мг натрия азида, 0,02-0,1 мг кадмия хлористого, патологический материал для исследования берут с места введения.

Использование этого способа позволяет обнаружить единичные клетки возбудителя чумы с помощью экспрессных методов спустя 24-48 ч от начала исследования, а выделить и идентифицировать чумной микроб через 36-72 ч.

Недостатками этого способа является необходимость применения ингибиторов (натрия азида, кадмия хлористого), которые не всегда обеспечивают полное подавление сопутствующей микрофлоры и несколько изменяют морфологию колоний чумного микроба на твердых питательных средах, что затрудняет диагностику.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ постановки биологический пробы для выделения чумного микроба, включающий втирание в скарифицированную кожу биопробного животного исследуемого материала, содержащего возбудителя чумы и обильно обсемененного посторонней микрофлорой (почва, трупный загнивший материал, мокрота, слизь из зева и др.). (Николаев Н.И. Чума (клиника, диагностика, лечение и профилактика), М., 1968., с.121).

Недостатками этого способа являются длительные сроки исследования (7-9 суток), а также отсутствие указаний на порог чувствительности.

Целью предлагаемого изобретения является выделение возбудителя чумы из материала, контаминированного посторонней микрофлорой.

Поставленная цель достигается тем, что у биопробных животных в области спины выщипывают или выбривают шерсть на площади 3-4 см², эпилированный участок скарифицируют и делают множественные накалывания из расчета 12-16 уколов на 1 см² кожи, после чего на него наносят исследуемый материал в количестве 0,05-1 мл, предварительно смешанный с желтком курином яйца в соотношении 1: 0,5-1:0,7, и досуха втирают в кожу боковой поверхностью скальпеля, бактериологическому исследованию подвергают внутренние органы экспериментальных животных и место введения заразного материала.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Дополнительные повреждения кожного покрова, помимо скарификации, в виде множественных накалываний облегчают чумному микробу преодолеть кожный барьер, что ускоряет развитие инфекционного процесса.

Предварительно добавляемый к исследуемой пробе желток куриного яйца предохраняет возбудителя чумы от действия фагоцитов и других факторов естественного иммунитета.

Способ осуществляется следующим образом:
На спине двух биопробных мышей выщипывают или выбривают шерсть на площади 3-4 см². Непосредственно перед заражением эпилированный участок протирают влажным тампоном, смоченным стерильной водой или физиологическим раствором. Применение для этой цели какого-либо дезинфицирующего средства категорически запрещается, чтобы не убить возбудителя в исследуемом материале. Свободное от шерсти пространство скарифицируют лезвием скальпеля (повреждают наружный слой кожи-эпидермис) и дополнительно копьем, применяемым в клинической лаборатории для взятия крови из пальца, делают множественные накалывания из расчета 12-16 уколов на 1 см² кожи, после чего наносят исследуемый материал, обильно обсемененный посторонней микрофлорой (почва, трупный загнивший материал, мокрота, слизь из зева и др.) в количестве 0,05-1 мл, который предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5-1: 0,7. Нанесенную смесь под прикрытием чашки. Петри или стеклянной воронки тщательно втирают боковой поверхностью скальпеля в продолжении 2-3 мин.

Биопробных животных умерщвляют хлороформированием на 1 и 2 сутки после заражения и вскрывают в соответствии с требованиями противоэпидемического режима. Из трупа извлекают внутренние органы и подвергают их бактериологическому, серологическому и иммунофлуоресцентному исследованиям. Применяют также генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материал из места заражения исследуют отдельно. Вначале проводят посев петлей на пластины агара Хоттингера, после чего изготавливают мазки-отпечатки для окраски по Граму и исследования методом флуоресцирующих антител. Затем кусочки органов переносят в стерильные фарфоровые ступки, в которые предварительно наливают 1 мл физиологического раствора, и тщательно растирают пестиком. По 0,2 мл полученной эмульсии вносят в чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по поверхности агаровых пластин. После впитывания эмульсии в агар одну из этих чашек используют для постановки пробы с фагом, другую - для определения антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом, третью - для изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков, по совокупности которых идентифицируют чумной микроб. Оставшиеся грубые частицы внутренних органов в фарфоровых ступках тщательно растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора, полученный гомогенизат переносят в пробирки, обеззараживают по общепринятой методике и используют для постановки серологических реакций и ПЦР-анализа. Бактериологические посевы выдерживают в термостате при 28^oС в течение 2 суток.

Возможность использования предлагаемого способа иллюстрируется примерами практического его выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1
У двух биопробных животных (белые мыши) на спине выщипывают или выбривают шерсть так, чтобы получилось свободное от шерсти пространство размером 3 см². Затем, не дезинфицируя место заражения, лезвием скальпеля скарифицируют кожу и копьем, применяемым в клинической лаборатории для взятия крови из пальца, делают множественные накалывания из расчета 12 уколов на 1 см².

Исследуемый материал в количестве 0,05 мл на одно животное смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5 и наносят на поверхность кожи, подготовленную, как указано выше, и под прикрытием чашки Петри или стеклянной воронки досуха втирают боковой поверхностью скальпеля. Мышей умерщвляют и вскрывают на 1 и 2 сутки после заражения и исследуют внутренние органы, а также отдельно материал из места заражения с помощью бактериологического, серологического, иммунофлуоресцентного методов и ПЦР-анализа, которые позволяют из материала, обильно контаминированного гнилостной и сопутствующей микрофлорой, выделить и идентифицировать чумной микроб при его концентрации 10⁸-10⁶ КОЕ/мл через 2-3 суток от начала исследования.

Пример 2.

У двух биопробных животных (белые мыши) на спине выщипывают или выбривают шерсть так, чтобы получилось свободное от шерсти пространство размером 3,5 см². Затем, не дезинфицируя место заражения, лезвием скальпеля скарифицируют кожу и копьем, применяемым в клинической лаборатории для взятия крови из пальца, делают множественные накаливания из расчета 14 уколов на 1 см². Исследуемый материал в количестве 0,075 мл на одно животное смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,6 и наносят на поверхность кожи, подготовленную, как указано выше, и под прикрытием чашки Петри или стеклянной воронки досуха втирают боковой поверхностью скальпеля. Мышей умерщвляют и вскрывают на 1 и 2 сутки после заражения и исследуют внутренние органы, а также отдельно материал из места заражения с помощью бактериологического, серологического, иммунофлуоресцентного методов и ПЦР-анализа, которые позволяют из материала, обильно контаминированного гнилостной и сопутствующей микрофлорой, выделить и идентифицировать чумной микроб при его концентрации 10⁸-10⁶ КОЕ/мл через 2-3 суток от начала исследования.

Пример 3
У двух биопробных животных (белые мыши) на спине выщипывают или выбривают шерсть так, чтобы получилось свободное от шерсти пространство размером 4 см². Затем, не дезинфицируя место заражения, лезвием скальпеля скарифицируют кожу и копьем, применяемым в клинической лаборатории для взятия крови из пальца, делают множественные накалывания из расчета 16 уколов на 1 см². Исследуемый материал в количестве 0,1 мл на одно животное смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,7 и наносят на поверхность кожи, подготовленную, как указано выше, и под прикрытием чашки Петри или стеклянной воронки досуха втирают боковой поверхностью скальпеля. Мышей умерщвляют и вскрывают на 1 и 2 сутки после заражения и исследуют внутренние органы, а также отдельно материал из места заражения с помощью бактериологического, серологического, иммунофлуоресцентного методов и ПЦР-анализа, которые позволяют из материала, обильно контаминированного гнилостной и сопутствующей микрофлорой, выделить и идентифицировать чумной микроб при его концентрации 10⁸-10⁶ КОЕ/мл через 2-3 суток от начала исследования.

Как показали экспериментальные исследования, заявляемые пределы величины зараженной кожной поверхности белых мышей, числа кожных накалываний и количества желтка куриного яйца, добавляемого к исследуемому материалу, являются оптимальными для достижения поставленной цели, так как при уменьшении указанных показателей менее заявляемых пределов чумной микроб не преодолевает кожный барьер и не вызывает развитие инфекционного процесса, а при их увеличении более заявляемых пределов имеет место ингибиция роста возбудителя чумы размножающейся гнилостной и сопутствующей микрофлорой.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в бактериологических исследованиях позволит в кратчайшие сроки обнаружить и выделить чумной микроб из материала, обильно загрязненного гнилостной и посторонней микрофлорой (трупный материал, почва, субстрат нор грызунов, мокрота и др.) с последующим ускоренным проведением дифференциации возбудителя и определением антибиотикочувствительности.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Способ включает эпиляцию и скарификацию участка кожи размером 3-4 см² в области спины биопробного животного, после чего на этот участок наносят дополнительные повреждения в виде множественных накаливаний из расчета 12-16 уколов на 1 см², а исследуемую пробу в количестве 0,05-0,1 мл предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, бактериологическому исследованию подвергают внутренние органы экспериментальных животных и место введения заразного материала. Способ позволяет в кратчайшие сроки выделить возбудителя чумы из материала, обильно загрязненного посторонней микрофлорой.

Способ постановки биопробы при диагностике чумы, включающий эпиляцию и скарификацию участка кожи в области спины биопробного животного с последующим нанесением и втиранием исследуемого материала, отличающийся тем, что на скарифицированной коже копьем, применяемым в клинической лаборатории для взятия крови из пальца, делают множественные накалывания из расчета 12-16 уколов на 1 см², после чего наносят исследуемый материал в количестве 0,05-0,1 мл, предварительно смешанный с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, бактериологическому исследованию подвергают внутренние органы биопробных животных и место введения заразного материала.