Способ определения генетический вариантов каппа-казеина у сельскохозяйственных животных Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетике, к способам определения генотипов животных посредством молекул я рно-генетических маркеров.

Цель изобретения - упрощение и повышение чувствительности способа.

Для упрощения способа определения генетических вариантов каппа-казеина сельскохозяйственных животных по сравнению с известным способом ряд этапов упро- щены, а отдельные исключены. Для выявления генетических вариантов применяется амплификация участка гена каппака- зеина с помощью известной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы из бактериального штамма Thermus Thermophilus и двух праймеров. комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих участок ДНК, содержащий полиморфные сайты для рестриктаз Hind III и Tag i, определяющий генетические варианты каппа-казеина с последующим расщеплением амплифициро- ванного участка ДНК длиной 228 п.н. рестриктазой Hind HI или Tag I. Появление

О

ел ю

ь.

00 00

ополнительных полос ДНК длиной 128 и 100 п.н. после расщепления по Hind II Tag ) амплифицированного участка ДНК казывает на существование двух генетиеских вариантов каппа-казеина типа А и В в геноме животного, В качестве прай- еров используются химически интезированные олигонуклеотиды: GE23TATCATTTAT GGCCATTGGACLA и SG024TTGAGATTCCTGTGTAGTTTGTTC, труктура которых была подобрана на основе анализа известной первичной структуры гена каппа-казеина коровы и вариантами ПДРФ по рестриктазам Hind Ии Tag I, охарактеризованными в прототипе. Выделение ДНК в прототипе обычно проводится по методу Маниатис а и др,, рекомендующем получение препаратов ДНК в больших количествах, порядка 10-15 мг, в предлагаемом способе используется метод выдел ения микроколичеств хромосомной ДНК, описанному Сигнер и др, Рестрикция и электрофорез ДНК проводится общепринятыми методами, а последующие этапы в предложенном способе исключены, что позволяет сократить время анализа в 6-7 раз, а также снизить стоимость анализа в 3,5 раза.

Пример 1. Для проведения ПЦР, основанной на свойстве термофильной ДНК-полимеразы сохранять ферментативную активность после прогревания до 95- 97°С, синтезируют два праймера химическим способом следующей структуры: SGE23 5 -TATCATTTATGGCATTGGACCA и SGO 24 З -TTGAGATTCCTCTGTAGTTTGTTC, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих участок ДНК гена каппа-казеина в районе 5-го экзона. Для амплификации составляют инкубационную смесь состава: 100 мкл инкубационной смеси содержат 10 мМ трис-HCI, рН 8,4; 2,5 мМ MgCte; 50 мМ KCI, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, четыре dNTP по 200 мкМ каждого, два праймера, SGE 23 и SGO 24, по 0,3 мкг каждого и 0,5-1,0 мкг хромосомной ДНК животного из клеток крови. Денатурацию ДНК проводят при 95- 97°С в течение 7-10 мин, отжиг праймеров 2-3 мин при 55-58°С, затем добавляют 2,0- 2,5 ед.акт. ДНК-полимеразы из Thermus thermophills и проводят синтез участка ДНК при 68-72°С в течение 4 ммн. Последующие циклы включат 1 мин при 95-97°С (денатурация), 1 мин при 55-58°С (отжиг) и 2 мин при 68-72°С (синтез). Для преотвращения конденсации воды добавляют к инкубационной смеси 80-100 мкл вазелинового масла. После 30 циклов амплификации образец инкубируют дополнительно 5-10 ммн при 68-72°С для полного завершения ПЦР. Амплификацию в заданном режиме проводят на программируемом термостате (Perkln Elmer-Cetustnslruments). ДНК из инкубационной среды осаждают эталоном (1/20 объема 5 М ацетата аммония и 2,5 объема холодного 96%-ного этанола), осадок подсушивают и растворяют в 50 мкл буфера ТЕ, рН 7,5 (10 мМ трис-HCI, 1 мМ ЭДТА). Для анализа амплифицированного участка ДНК проводят рестрикцию по Hind III. Для этого отбирают 20 мкл амплифицированного раствора ДНК и добавляют в инкубационную среду с 3 мкл 10-кратного буфера для Hind III (50 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 7,5: 10 мМ MgCte; 1 мМ дитиотрейтола и 5 ед. акт. Hind III и 7 мкл деионизированной воды, инкубируют 1,0-1,5 часа при 37°С и продукты рестрикции анализируют на 8-10% поли- акриламидном электрофорезе (2-3 ч, 15-20 в/см) относительно непорезанного по Hind III амплифицированного участка ДНК. В качестве маркера молекулярной массы берут смесь BSp Rl (Hind III) - фрагментов ДНК плазмиды рВК 322.

Прокрашивание ДНК в геле проводят бромистым этидием и фотографируют. Действие рестриктазы Hind HI приводит к появлению дополнительных полос ДНК или исчезновению полосы, соответствующей амплифицированному участку ДНК.

1)появление двух дополнительных полос длиной 128 и 100 п.н. указывает на наличие в геноме животного генетических вариантов каппа-казеина типа А и В;

2)появление двух дополнительных полос длиной 128 и 100 п.н. и исчезновение исходной полосы длиной 228 п.н. указывает на наличие в геноме животного генетического варианта каппа-казеина типа В;

3)дополнительные полосы не ся, а наличие исходной полосы, соответствующей амплифицированному участку ДНК указывает на наличие в геноме животного генетического варианта каппа-казеина типа А.

Использование заявляемого изобретения позволит определять генетические ва- риантыкаппа-казеинаv

сельскохозяйственных животных независимо от пола и возраста, в том числе у сам цов и эмбрионов, без применение изотопных методов анализа, исключающее блот-гибридизацию, снизить стоимость ан§ лиза в 3,5 раза, сократить время анализа 6-7 раз и повысить чувствительность знали за на порядок.

Формулаизобретения Способ определения генетических вз риантов каппа-казеина у сельскохозяйст венных животных, включающий обработку ДНК гена каппа-казеина эндонуклеазами

5 16594886

Hind III и Tag I, с последующим анализомред обработкой-ДНК эндонуклеазами пропродуктов рестрикции электрофорезом вводят амплификацию участка того же гена с

полиакриламидном геле для выявления до-использованием химически синтезирован

полнительных полос ДНК в геле, указываю-ных праймеров: SGE 23 ТАТСАТТщих на наличие различных генетических5 TATGGCCATTGGACCA и SGO 24

вариантов гена каппа-казеина, отличаю-TTGAGA7TCCTCTGTAGTTTGTTC и цепной

щ и и с я тем, что, с целью упрощения иполимеразной реакции, осуществляемой

повышения чувствительности способа, пе-термофильной ДНК полимеразой.

Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетики - к способам определения генетипов животных посредством молекулярно генетических маркеров. Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа. Разработан способ определения генетических вариантов каппа-казеина у с/х животных с помощью полимеразной цепкой реакции, включающий в себя выделение хромосомной ДНК в количестве 0,5-1,0 мкг из клеток крови и использование двух праймеров длиной 23 и 24 нуклеотида, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих исследуемый участок гена, содержащий полиморфный сайт рестрикции для Hind III и Taq I, проведение амплификации исследуемого участка гена посредством полимеразной цепной реакции с использованием ДНК-полимеразы Thermus thermophilus, обработку ампифицированно- го участка ДНК рестриктазой Hind III или Tag I и анализ продуктов рестрикции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. По сравнению с известным способом обеспечивается его упрощение 6-7-кратное сокращение длительности и 3,5-кратное снижение стоимости определения генетических вариантов каппа-казеина. у Ё