СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР И ПЦР-ПДРФ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ Waxy-ГЕНОВ ПШЕНИЦЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N15/05 C12Q1/68 

Описание изобретения

Изобретение относится к области биохимии, а также селекции и семеноводства, в частности к молекулярной идентификации генотипов пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов для маркер-вспомогательной селекции сортов с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.

Одним из подходов к идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы является способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) с праймерами: 4F: 5^/-AAGAGCAACTACCAGT-3^/ и 4R: 5^/-TCGTACCCGTCG-ATGAAGTCGA-3^/, инициирующими амплификацию соответствующих аллель-специфичных продуктов Wx-Al-, Wx-Bl- и Wх-Dl-локусов. [1].

Существенным недостатком данного способа проведения ПЦР [1] является невозможность идентификации нуль-аллеля Wx-Blb от активного аллеля Wx-Ble, а также трудность дискриминации Wx-Ala от Wx-Alg.

Цель изобретения - разработка способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Нами разработан способ проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, схожий с прототипом [1], включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из dH₂O, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, с тем отличием, что на этапе ПЦР используется прямой праймер: 4F-c: 5^/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3^{/ /}(SEQ ID NO: 1), а процедура ПДРФ-анализа проводится с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI.

Условия проведения реакции

Выделение геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы осуществляли сорбционным способом («ДНК-сорб С», ЦНИИЭМ, Россия).

ПЦР и ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколам идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, представленным в табл.1-2.

Детекцию результатов ДНК-анализа проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере TBE (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Выравнивание частичных нуклеотидных последовательностей аллелей Waxy-генов пшеницы: CLUSTAL W (v.1.83).

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию предложенного способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, ввиду корректной интерпретации генерируемых ПЦР-продуктов (фиг.3) и ПЦР-ПДРФ-фрагментов (фиг.4), сопоставимых с расчетными данными (фиг.1-2).

Источники информации

1. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L.S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M. Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. - 2009. - V.12. - N.1. - P.1-9.

Табл.1 Протокол ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (прототип) Протокол ПЦР Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл) dH₂O     13,4 134 dNTPs 2,5 мМ 0,25 мМ 2 20 Буфер 10× 1× 2 20 Taq ДНК полимераза 5 ед 1 ед 0,2 2 4F 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2 4R 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2 Проба ДНК     2   ВСЕГО     20   Нуклеотидные последовательности праймеров: 4F: 5^/-AAGAGCAACTACCAGT-3^/ (16 н.) 4R: 5^/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3^/ (22 н.) Режим амплификации: ×1: 94°C - 4 мин ×40: 94°C - 30 сек, 58°C - 30 сек, 72°C - 30 сек ×1: 72°C - 7 мин ХРАНЕНИЕ +10°C Электрофорез в 3% агарозе Интерпретация ПЦР-продуктов: Наличие 257 (261) bp=Wx-Ala или Wx-Alg (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb Наличие 227 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble Наличие 299 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb

Табл.2 Протокол ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (предлагаемый способ) Протокол ПЦР Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл) dH₂O     13,4 134 dNTPs 2,5 мМ 0,25 мМ 2 20 Буфер 10× 1× 2 20 Taq ДНК полимераза 5 ед 1 ед 0,2 2 4F-c 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2 4R 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2 Проба ДНК     2   ВСЕГО     20   Нуклеотидные последовательности праймеров: 4F-c: 5^/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3^/ (21 н.) 4R: 5^/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3^/ (22 н.) Режим амплификации: ×1: 94°C - 4 мин ×40: 94°C - 30 сек, 64°C - 30 сек, 72°C - 30 сек ×1: 72°C - 7 мин ХРАНЕНИЕ +10°C Электрофорез в 3% агарозе Интерпретация ПЦР-продуктов: Наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg Наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble Наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb Протокол ПДРФ Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл) dH₂O     1,75 17,5 BSA 10 мг/мл 0,1 мг/мл 0,25 2,5 SE-буфер W 10× 1× 2,5 25 AcsI 20 U 10 U 0,5 5 ПЦР-проба     20   ВСЕГО     25   Инкубация при 50°C в течение 3 часов Электрофорез в 3% агарозе Интерпретация ПЦР-продуктов: Наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg Наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble Наличие 266 bp=Wx-Ble Наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг.1.

Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Пояснение к фиг.2.

Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F-c+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Пояснение к фиг.3.

Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР и прототипа для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Обозначения: A) прототип (праймеры 4F+4R). B) предложенный способ проведения ПЦР (праймеры 4F-c+4R). M) ДНК-маркеры 100-1500 bp (СибЭнзим). 1-9) генотипы пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 1-4) Wx-Ala/Bla/Dla; 5-7) Wx-Alg/Bla/Dla. 8-9) Wx-Ala/Blb/Dla.

Пояснение к фиг.4.

Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Обозначения: M) ДНК-маркеры 50-100 bp (СибЭнзим). 1) ПЦР-профиль генотипа пшеницы с комбинацией аллелей Wx-Ala/Bla/Dla (304/262/232 bp). 2-7) AcsI-ПЦР-ПДРФ-профили генотипов пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 2) Wx-Ala/Bla/Dla (156/148/114/84 bp); 3-5) Wx-Alg/Bla/Dla (156/148/84 bp); 6-7) Wx-Ala/Blb/Dla (156/148/114 bp).

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ проведения ПЦР для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники использованием прямого праймера 4F-c: 5'-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3'. Также описан способ ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI. Цель изобретения - разработка способов проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

1. Способ проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из деионизированной воды, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, отличающийся тем, что используется прямой праймер 4F-c: 5^/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3^{/ /}(SEQ ID NO: 1) со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-продуктов:
наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,
наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,
наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.

2. Способ проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий п.1, отличающийся тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI, со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-ПДРФ-фрагментов:
наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,
наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,
наличие 266 bp=Wx-Ble,
наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.