СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ МЕТОТРЕКСАТА Российский патент 2011 года по МПК A61K31/56 A61K31/04 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к химиотерапии онкологических больных, и может найти применение при разработке подходов повышения эффективности противоопухолевых препаратов (группы антиметаболитов).

Химиотерапия злокачественных опухолей является одним из основных методов лечения онкологических больных, однако применение противоопухолевых препаратов сопровождается выраженными побочными эффектами из-за их низкой избирательности действия (Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю., Гольдберг В.Е., 1997; Кинзирская Ю.А., Богуш Т.А., Остапчук Н.В. и др., 2003; Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г. и др., 2006). Химиопрепараты оказывают повреждающее действие как на опухолевые клетки, так и на нормальные клетки и ткани организма - костный мозг, лимфоидные органы, эпителий полости рта и желудочно-кишечного тракта, печень, волосяные фолликулы, репродуктивные органы. Как следствие указанных особенностей действия химиопрепаратов на организм к их побочным эффектам следует отнести миелодепрессию, диспептические расстройства, подавление реакций гуморального и клеточного иммунитета, функций репродуктивных органов, печени, аллопецию. В связи с этим разработка подходов, направленных на повышение эффективности противоопухолевых препаратов и уменьшение побочных эффектов химиотерапии, является актуальной задачей. К настоящему времени показана перспективность использования с этой целью биологически активных веществ растительного происхождения, обладающих гепатопротекторным действием и минимальными побочными эффектами (А.А.Саратиков, А.И.Венгеровский, 1995). Среди последних определенного внимания заслуживают тритерпеноиды как вещества с выраженной гепатотропной активностью (J. Liu et al, 1994; S. Martin-Aragon et al, 2001; J. Gao et al, 2004; Kinoshita et al, 2007). Такая активность установлена, в частности, у милиацина - пентациклического тритерпеноида, выделенного из просяного масла (Л.Е.Олифсон с соавт., 1991). В ранее выполненных исследованиях было показано, что в условиях острой интоксикации организма четыреххлористым углеродом, милиацин обусловливал уменьшение некротических и дистрофических изменений в печени, а также способствовал ускорению в ней регенераторных процессов (М.М.Павлова, 1976). В последующем была продемонстрирована способность милиацина оказывать мембраностабилизирующее действие (А.Н.Чернов, М.М.Павлова, Л.Е.Олифсон, 1983; А.В.Кириллова, 2004) и снижать процессы липопероксидации - ПОЛ (Т.В.Панфилова, А.А.Штиль, Б.А.Фролов, 2006). Вместе с тем уменьшение риска побочных эффектов химиотерапии может представлять практический интерес лишь в случае, если тритерпеноид не снижает противоопухолевого действия химиопрепарата. Сведения по данному вопросу, приводимые в литературе, свидетельствуют о том, что некоторые производные тритерпеноидов, а именно бетулоновой и глицирризиновой кислоты, обладают таким эффектом (Т.Г.Разина, Е.П.Зуева, Е.Н.Амосова и др., 1999; И.В.Сорокина, Т.Г.Толстикова, Н.А.Жукова и др., 2006; Гольдберг Е.Д., Амосова Е.Н., Зуева Е.П. и др., 2008). Более того, имеются данные о их стимулирующем влиянии на эффективность химиотерапии опухоли, которое, в частности, было обнаружено при сочетанном использовании циклофосфана и глицерама - монозамещенной аммонийной соли глицирризиновой кислоты, выделенной из корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) (Т.Г.Разина, Е.П.Зуева, Е.Н.Амосова и др., 1999; Е.Д.Гольдберг, Е.Н.Амосова, Е.П.Зуева и др., 2008). Вместе с тем для милиацина подобная активность не описана.

Новизной предлагаемого изобретения является выявленное свойство тритерпеноида милиацина повышать терапевтическую активность противоопухолевых препаратов, в частности метотрексата.

Существенным отличием является использование милиацина в качестве средства, повышающего противоопухолевый эффект метотрексата.

На основании масс-, ЯМР- и ИК-спектров, хроматографической однородности и качественного состава препарат отнесен к группе пентациклических тритерпенов, имеющих структуру 3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена. Милиацин представляет собой вещество белого цвета с температурой плавления 285-286°C. Он оптически активен, нерастворим в воде, слабо растворим в этиловом спирте, диэтиловом эфире, ацетоне, хорошо растворим в хлороформе. Милиацин обладает хорошей переносимостью в диапазоне доз от 2 до 1000 мг/кг. ЛД₅₀ этого соединения больше 1000 мг/кг, что свидетельствует об отсутствии у него токсических свойств (Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др., 1991).

Химическая структура пентациклического тритерпеноида-милиацина (3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена)

Описание эксперимента

Эксперименты проведены на 63 мышах - самцах гибридов I поколения BDF₁ (C₅₇B1/6×DBA/2), полученных из питомника РАМН «Столбовая», массой 20-22 г. В качестве модели использовали перевиваемую эпидермоидную карциному легких Льюис (LLC). Штамм карциномы Льюис получен из лаборатории экспериментальной терапии метастазов НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и поддерживался путем внутримышечных перевивок на мышах-самцах линии C₅₇B1/6. Для проведения эксперимента опухолевую ткань измельчали до гомогенной консистенции, добавляли среду 199 (1:10) и по 0,5 мл полученной суспензии (≈50 мг опухолевой массы) вводили подкожно в область правой подмышечной впадины мышам-самцам BDF₁. В работе использован штамм LLC третьего пассажа (Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др., 2005). После трансплантации опухолевых клеток LLC животные были разделены на четыре группы:

I - мыши (18 животных) нелеченные; II - мыши (15 животных), получавшие через 48 часов после инокуляции опухоли внутрибрюшинно однократно МТХ; III - мыши (15 животных), получавшие через 48 часов после перевивки опухоли МТХ с последующим 3-кратным введением растворителя милиацина - твина-21 в 0,9% растворе хлорида натрия (1,6×10^-7 моль/кг); IV - мыши (15 животных), получавшие через 48 часов после перевивки опухоли МТХ с последующим 3-кратным введением милиацина.

МТХ использовали австрийской фирмы-производителя «Эбеве» (серия 700045; срок годности до 12.09). Препарат вводили в дозе 10 мг/кг массы тела. Для оценки влияния милиацина на противоопухолевый эффект МТХ тритерпеноид вводили трехкратно внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг массы тела: через 1 час после введения МТ и в последующие два дня. Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили (Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др., 2005):

Торможение роста опухоли (ТРО, %).

Измеряли три максимальных взаимно перпендикулярных размера опухоли: длина (L), ширина (S), высота (H) у каждого животного и вычисляли объем (V), а затем средний объем опухоли в группе. Измерение объема опухоли проводили на 5, 7, 12, 17 и 19 сутки после введения МТХ.

V (мм³)=L×S×H

Торможение роста опухоли вычисляли по формуле

ТРО(%)=(Vк-Vo)/Vк×100,

где Vк - средний объем (мм) опухолей в нелеченной группе (I),

Vo - средний объем опухолей (мм³) в сравниваемых леченных группах (II, III, IV).

Увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %)

Сравнительную оценку противоопухолевого эффекта по продолжительности жизни нелеченных животных и животных сравниваемых леченных групп (II, III, IV) проводили после гибели всех животных от опухолевого процесса, вычисляя среднюю продолжительность жизни (СПЖ) (дни).

Увеличение продолжительности жизни рассчитывали по формуле:

УПЖ(%) = (СПЖо-СПЖк)/СПЖк×100,

где СПЖк - средняя продолжительность жизни животных в нелеченной группе, СПЖо - средняя продолжительность жизни животных в сравниваемых леченных группах. Минимальные критерии активности: торможение роста опухоли ≥50%; увеличение продолжительности жизни ≥25%.

Результаты обрабатывали с использованием непараметрического критерия X² и критерия Стьюдента (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973). Различия считали статистически достоверными при p<0,05.

Анализ динамики роста LLC (фиг.1) свидетельствует о том, что во всех группах у животных, получавших МТХ (II, III, IV), препарат вызывал замедление роста опухолей. Однако, если у животных, получавших только МТХ (группа II) или МТХ с растворителем (группа III), значимое ТРО наблюдали лишь на протяжении 7 суток после введения МТХ (ТРО=77%, 54% и 83%, 59% соответственно) (фиг.2), то у мышей IV группы, которым вводили МТХ + милиацин, значимое ТРО отмечали в течение всего периода наблюдения (ТРО=91%, 89%, 84%, 63%, 60% соответственно срокам измерения опухоли). Следует отметить, что даже на 19 сутки после лечения ТРО у мышей IV группы сохранялось высоким и соответствовало таковому у животных II и III групп на 7 сутки после введения МТХ.

Применение милиацина позволило получить высокий противоопухолевый эффект у мышей (IV группа), леченных МТХ с последующим трехкратным введением тритерпеноида. Действие МТХ в комбинации с милиацином увеличило продолжительность жизни мышей, в среднем, на 36% по сравнению с нелеченными животными (фиг.3), при этом значение УПЖ в этой группе мышей (фиг.2) было выше минимального статистически значимого критерия (25%). В то же время у мышей II и III групп не выявлено увеличения продолжительности жизни мышей с LLC: 9% и 0% соответственно.

Таким образом, трехкратное применение милиацина после введения МТХ повышает противоопухолевую эффективность МТХ в отношении карциномы легких LLC. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин повышает терапевтическую эффективность МТХ, и их сочетанное применение вызывет высокое торможение роста эпидермоидной карциномы легких LLC в течение 12 дней после введения цитостатика - ТРО=91-84%, при этом статистически значимое ТРО сохраняется в течение длительного периода наблюдения (на 19 сутки ТРО=60%). МТХ в сочетании с милиацином увеличивают продолжительность жизни мышей с LLC на 36%, в то время как МТХ в монотерапии - на 9%.

Таким образом, данная работа служит основанием для предложения об использовании пентациклического тритерпеноида растительного происхождения - милиацина для повышения терапевтической эффективности метотрексата.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Динамика роста опухоли LLC в исследуемых группах животных.

* p<0,05 достоверность по отношению к I группе

Фигура 2. Влияние милиацина на противоопухолевый эффект метотрексата у мышей с карциномой легких Льюис.

* p<0,05 - достоверные отличия относительно нелеченной группы (I)

^○ p<0,05 - достоверные отличия относительно IV группы

^Δ p<0,05 - достоверные отличия относительно IV группы

Фигура 3. Динамика гибели мышей BDF₁ в исследуемых группах животных с карциномой легкого LLC в интервале с 23 по 41 сутки после трансплантации опухоли.

* p<0,05 достоверность по отношению к I группе

Литература

1. Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю., Гольдберг В.Е. Ранние и отдаленные последствия токсического действия на печень противоопухолевого препарата платины // Экспериментальная и клиническая фармакология - 1997. - Т.60. - №4, - С.57-59.

2. Гольдберг Е.Д., Амосова Е.Н., Зуева Е.П. и др. Повышение эффективности химиотерапевтического и хирургического методов лечения перевиваемых опухолей препаратами солодки // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2008. - Т.145. - №2. - С.213-217.

3. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. - Л.: Медицина, 1973, - 141 с.

4. Кинзирская Ю.А., Богуш Т.А., Остапчук Н.В. и др. Гепатотоксическое действие лекарственных препаратов некоторых фармакологических групп // Клиническая медицина. - 2003. - №10. - С.11-16.

5. Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г. и др. Структурная реорганизация печени крыс при цитотоксическом действии доксорубицина // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. - Т.141. - №5 - С.579-585.

6. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина // Вопросы питания. - 1991. - №2. - С.57-59.

7. Разина Т.Г., Зуева Е.П., Амосова Е.Н. и др. Глицам как средство повышения эффективности химиотерапии и хирургического метода лечения экспериментальных опухолей // Вопросы онкологии. - 1999. - Т.45. №5. - С.554-556.

8. Саратиков А.А., Венгеровский А.И. Новые гепатопротекторы природного происхождения // Эксперим. и клин. фармакол. Вопросы питания. - 1995. - Т.58. - №1. - С.8-10.

9. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А. и др. Оценка противоопухолевого и антиметастатического эффектов амидов бетулоновой кислоты на мышах с перевиваемой карциномой Льюис // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2006. - Т.142. - №7. - С.78-81.

10. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К.и др. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Под ред. чл. - корр. РАМН проф. Р.У.Хабриева. - М.: Медицина, 2005. - С.637-674.

11. Gao J., Tang X., Dou H. et al. Hepatoprotective activity of Terminalia catappa L. leaves and its two triterpenoids // J. Pharm Pharmacol. - 2004. - V.56. - №11. - p.1449-55.

12. Kinoshita S., Inoue Y., Nakama S. et al. Antioxidant and epatoprotective actions of medicinal herb, Terminalia catappa L. from Okinawa Island and its tannin corilagin // Phytomedicine. - 2007. - V.14. - №11. - P.755-62.

13. Liu J., Liu Y., Mao Q. et al. The effects of 10 triterpenoid compounds on experimental liver injury in mice // Fundam Appl Toxicol. - 1994. - V.22. - №1. - P.34-40.

14. Martin-Aragon S., de las Heras В., Sanchez - Reus M.I. et al. Pharmacological modification of endogenous antioxidant enzymes by ursolic acid on tetrachloride - induced liver damage in rats and primary cultures of rat hepatocytes // Exp. Toxicol. Pathol. - 2001. - V.53. - №2-3. - P.199-206.

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается применения милиацина в качестве средства, повышающего противоопухолевый эффект метотрексата. Изобретение направлено на расширение арсенала средств, повышающих противоопухолевый эффект метотрексата. 3 ил.

Применение милиацина в качестве средства, повышающего противоопухолевый эффект метотрексата.