Способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в. ветеринарии, медицине, биологической промышленности для определения биологически активных соединений.

Целью изобретения является ускорение способа за счет одновременного определения двух антигенов в одной пробе.

Способ осуществля ют следующим образом.

Для анализа пробы, содержащей одновременно два антигена, используют комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум определяемым антигенам. В лунках панелей происходит связывание антигенов с сенсибилизированными антителами. Отмывка лунок панелей позволяет

удалить из смеси непрореагировавшие компоненты. Внесение смеси двух антител, меченных двумя разными металлорпорфи- ринами, последующее инкубирование и отмывка сорбента позволяют получить следующие цепочки твердая фаза - анти- генспецифические антитела - антиген-конъ- югат антигенспецифических антител с металлопорфиринами. Концентрация данного металлопорфирина на твердой фазе пропорциональна концентрации того антигена, к которому специфичен данный конь- югат антител с металлопорфирином.

Для измерения интенсивности фосфоресценции металлопорфиринов осуществляют десорбцию специфически связанных с сорбентом коньюгатов в обьем щелочным раствором или измеряют фосфоресценцию

с

vj О СО 00 hO

раствором или измеряют фосфоресценцию с поверхности лунок после добавления бисульфита (удаление растворенного кислорода). Интенсивность фосфоресценции каждого металлопорфирина измеряют путем смены длин волновозбуждения и (или) регистрации (с помощью монохроматоров ион наборов фильтров с полушириной пропускания 10-50 нм),

Учет результатов реакции проводят по величинам интенсивности фосфоресценции на соответствующих длинах волн.

В табл. 1 приведены спектральные характеристики различных Pd-порфиринов.

Пример 1. На поверхность лунок полистирольного микропланшета адсорбировали смесь антител кролика к вирусу ящура типов А и 0 по 10 мкг/мл из 0,1 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,2 в течение 3 ч при 37°С. Затем раствор выливали и промывали лунки 3 раза фосфатно-солевым буфером с Тритоном Х-100 (0,01 М К-фосфат, рН 7,4, 0,15 М NaCI, 0,05% ТХ-100; ФСБТ).

Конъюгаты анти-А-антител с Pd-копро- порфирином и анти-0-антител с Pd-тетра- кис(п-карбоксифенил)порфином получали по методике, описанной в прототипе.

В лунки с адсорбированными антителами наливали по 0,1 мл станрастворов коммерческого антигена вируса ящера типа А (производства ВНИЯИ, Владимир) в ФСБТ и инкубировали 1 ч при 37°С. После этого растворы выливали, промывали лунки 3 раза ФСБТ, заливали в них по 0,1 мл ФСБТ, содержащего по 10 мкг/мл обоих конъюга- тов антител с Pd-порфиринами (концентрации обоих конъюгатов подбирались в предварительных опытах по параметру максимального соотношения сигнала в опыте и в контроле без антигена). Инкубировали еще 1 ч, после чего снова отмывали лунки 3 раза ФСБТ.

Десорбцию меченных соединений проводили 0,01 М раствором КОН, содержащим 0,2% ТХ-100, после чего (через 20 мин) добавляли бисульфит натрия в конечной концентрации 5 мг/мл.

Регистрацию фосфоресценции, (возбуждение) проводили азотным лазером (337 нм) с частотой 100 Гц и полушириной вспышки 10 не. Регистрацию осуществляли последовательно с использованием интерференционных фильтров с максимумами пропускания 670 и 710 нм.

Время задержки 0,3 мс, счета 0,7 мс. Время накопления сигнала 10с. Результаты представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 определяется типовая принадлежность вируса ящура: сигнал при 670 нм в 3,2 раза выше, чем при 700 нм. В десорбируюицем растворе находится только Pd-копропорфирин I. Это свидетельствует о принадлежности вируса ящура к

типу А. По калибровочной кривой при 670 нм (2-й столбец, табл. 2) определяется концентрация вируса ящура типа А (в единицах разведения).

Пример 2. Способ осуществляется

аналогично примеру 1, но исследуемый образец содержит оба типа антигена вируса ящура. Измеряют интенсивности фосфоресценции при 670 и 700 нм. Затем, решая систему уравнений:

ббо X + Ау, Вч + у,

где А 1 оо/1660 для Pd-копропорфирина, а В 1ббо/1 оо для Pd-тeтpa(п-кapбoкcифe- нил)порфина, коэффициенты, определяемые из табл. 2 и 3, равные соответственно 0,26 и 0,31), определяют интенсивность свечения Pd-копропорфирина t (X) и Рй-тетра(п- карбоксифенил)порфина (V). Затем по калибровочным кривым из примеров 1 и 2

по интенсивности свечения определяют концентрации антигенов типа А и типа О вируса ящура.

Способ позволяет одновременно определить 2 антигена в случае ограниченного

количества исследуемого образца.

Формула изобретения Способ твердофазного фосфоресцент- ного иммуноанализа, включающий получение антител, ковалентно меченных металлопорфиринами, десорбцию меченного соединения после проведения иммуной реакции на сорбенте, и определение интенсивности фосфоресценции раствора, о т л ичающийся тем,, что, с целью ускорения способа за счет определения двух антигенов в одном образце одновременно, используют комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум антигенам, ме0 ченные двумя различными металлопорфиринами, а определение антигенов ведут последовательно по интенсивности фосфоресценции соответствующего металлопорфирина.

Таблица 1

Изобретение относится к методам проведения иммуноанализа и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, промышленности для определения биологически активных соединений. Целью изобретения является ускорение способа за счет одновременного определения двух антигенов. Цель достигается тем, что в анализе используется иммуносорбент с антителами к двум определяемым антигенам, а проявление антигенов осуществляют смесью двух антител к ним, которые мечены двумя различными металлопорфиринами. Спектральные свойства используемых пор- фиринов позволяют селективно определять каждый из них в смеси и по ним определять два антигена Регистрацию проводят из объема после десорбции или непосредственно с поверхности твердой фазы, В качестве двух антигенов могут выступать два эпитопа одного макромолекулярного антигена. (Л

Таблица 2