СПОСОБ ОЦЕНКИ ГИПОПЛАСТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ КОСТНОЙ ТКАНИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам диагностики заболеваний, используемым при исследовании костной ткани, а именно применяется для дифференциальной диагностики гипопластических заболеваний.

Известен способ исследования пространственной организации лакунарно-канальцевой системы в компактном и губчатом веществе различных костей человека с помощью сканирующей электронной микроскопии, в котором образцы компактного и губчатого вещества кости обрабатывают 5% раствором гипохлорита натрия для удаления клеток костного мозга, эндоста и остеоида, затем образцы промывают, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и заливают в метилметакрилат, после чего блоки с образцами вновь помещают в 5% раствор гипохлорита натрия для окончательного удаления органических компонентов кости, проводят деминерализацию в 3% растворе азотной кислоты, приготовленные препараты замораживают в переохлажденном жидком азоте, высушивают, напыляют медью и исследуют в сканирующем электронном микроскопе (А.А.Докторов Морфофункциональная характеристика эндоста в развивающейся, зрелой и стареющей кости / Автореф. дисс. на соискание ученой степени д.м.н. - Москва, 1992 - 46 с.).

Однако данный способ предназначен для исследования микрокоррозионных препаратов и визуальной оценки рельефа поверхности и не может быть использован для оценки метаболической активности костной ткани. Процесс изготовления препаратов трудоемок и требует наличия дорогостоящих реактивов.

Известен способ исследования структурно-функционального состояния остеоцитов в кортикальной кости, в различных зонах трабекулярной, а также эндостальной кости 1-10-дневных кроликов и крыс, заключающийся в изготовлении ультратонких срезов из недекальцинированной кости, кусочки которой фиксируют в глютаральдегиде на фосфатном буфере, проводят дофиксацию в осмиевом фиксаторе Миллонига, обезвоживают в спиртах и заключают в аралдит, на ультрамикротоме изготавливают ульратонкие срезы, контрастируют их в цитратом свинца или уранилацетатом и исследуют в трансмиссионном электронном микроскопе (Функциональная морфология клеток в остеогенезе / Родионова Н.В.; отв. ред. Мажуга П.Н.; АН УССР. Ин-т зоологии им. И.И.Шмальгаузена. - Киев: Наук. думка, 1989. - 192 с.).

Однако использование данного способа ограничено из-за отсутствия в лечебных учреждениях дорогостоящей аппаратуры (трансмиссионного электронного микроскопа), трудоемкости процесса изготовления препаратов, необходимости приобретения дорогостоящих реактивов.

Известен способ определения активности остеогенеза путем забора фрагментов костей от трупов людей, их фиксации в растворе формалина, изготовлении гистологических препаратов, подсчете плотности костных клеток при помощи квадратной решетки с двойным интервалом С и 5 С по формуле Р=1,01 Х/4,41 на гистологических препаратах срезов костей различных возрастных групп, отличающийся тем, что увеличение плотности костных клеток на 30% свидетельствует об активности остеогенеза, а уменьшение плотности костных клеток на 30% свидетельствует о снижении интенсивности остеогенеза (Заявка № 2000104246, РФ. Опубл. 27.10.2001).

Однако известный способ не может быть использован при исследовании биопсийного материала для оценки метаболической активности костной ткани из-за отсутствия возрастных норм, с которыми можно было бы сравнить полученные результаты.

Известен способ исследования распределения клеток по размерам и форме с помощью лазерной дифракции для диагностики и мониторинга заболеваний, отличающийся тем, что для исследования действия токсикантов (ионы тяжелых металлов) и возбудителей инфекционных заболеваний (микобактерий туберкулеза) на клеточные культуры с помощью лазерного дифракционного определителя размера частиц «Malvern 3600 Ес» определяют размер и форму клеток, проводят статистическое морфометрическое исследование, строят гистограммы численного и объемного распределения частиц, по которым определяют эффект токсикантов и возбудителей инфекционных заболеваний на рост клеточных культур (А.В.Сыроешкин, Т.В.Гребенникова, В.Н.Байкова, А.А.Ковалева, И.М.Лебедев, С.Ф.Бикетов, Т.В.Плетенева, В.А.Фролов / Новый подход к исследованию патофизиологии клетки: изучение распределения клеток по размерам и форме как метод диагностики и мониторинга заболеваний / Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №5. - С.35-40).

Однако данный способ предназначен для цитологического исследования суспензии клеток крови и различных клеточных культур (дрожжей и т.д.) и не может быть использован для изучения костной ткани.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, позволяющего по результатам морфометрического исследования оценить метаболическую активность костной ткани.

Поставленная задача решается тем, что в способе оценки гипопластических состояний костной ткани, характеризующемся морфометрическим исследованием остеоцитарных лакун костной ткани на гистотограммах, в качестве объекта используют биоптаты гребня подвздошной кости, взятые у больных в условиях операционной, затем изготавливают парафиновые срезы и окрашивают их по методу Шморля, на оцифрованных изображениях полей зрения полученных гистологических препаратов, используя программное обеспечение, в автоматическом или ручном режиме оконтуривают границы остеоцитарных лакун и измеряют их площадь, фактор формы круга и удлиненность, полученные цифровые данные обрабатывают в программе Microsoft Excel - 97, вычисляя статистические характеристики каждого параметра: среднее арифметическое значение (М), стандартное отклонение (SD), моду (Мо), минимальное (min) и максимальное (max) значения, используя которые, оценивают метаболическое состояние костной ткани, для наглядного представления результатов строят гистограммы.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, таблицей, гистограммами, на которых:

Фиг.1 - статистические характеристики параметров костных лакун у пациентов с несовершенным остеогенезом (НО) и фосфат-диабетом (ФД);

Фиг.2 - гистограмма распределения значений фактора формы остеоцитарных лакун у больных фосфат-диабетом (ФД) и несовершенным остеогенезом (НО);

Фиг.3 - гистограмма распределения показателя удлиненности остеоцитарных лакун у больных фосфат-диабетом (ФД) и несовершенным остеогенезом (НО).

Способ осуществляют следующим образом.

Для прогнозирования течения заболевания и оценки эффективности лечения у больных в условиях операционной, под местным обезболиванием, из гребня подвздошной кости трепаном получают образец костной ткани.

Биоптат фиксируют в нейтральном 10% формалине, обезвоживают в спиртах восходящей концентрации, пропитывают и заливают в парафин, на микротоме изготавливают срезы толщиной 5-6 мкм, проводят депарафинирование срезов и окрашивают их тионином с пикриновой кислотой по Шморлю.

Оцифровку полей зрения гистологических препаратов осуществляют на аппаратно-программном комплексе "ДиаМорф" (регистрационный МЗ РФ № 98/219-137). Морфометрическое исследование оцифрованных изображений выполняют с помощью программного обеспечения "ВидеоТесТ 4,0 - Мастер" (регистрационный № 29/20010702/6102-04). На изображениях полей зрения с помощью "мыши" оконтуривают границы остеоцитарных лакун и измеряют их площадь, фактор формы круга и удлиненность. Полученные цифровые данные обрабатывают в программе Microsoft Excel - 97. Вычисляют статистические характеристики каждого параметра: среднее арифметическое значение (М), стандартное отклонение (SD), моду (Мо), минимальное (min) и максимальное (max) значения, используя которые, оценивают метаболическое состояние костной ткани. Для наглядного представления результатов строят гистограммы.

Размер и форма остеоцитарных лакун зависят от биосинтетической активности клетки и, следовательно, от организации межклеточного вещества. В свою очередь, одним из факторов, оказывающим влияние на биосинтетическую активность остеоцитов, является величина и направленность вектора нагрузки. В межклеточном веществе грубоволокнистой (незрелой) костной ткани, где коллагеновые волокна расположены в разных направлениях, остеоцитарные лакуны имеют округлую или овальную форму. В пластинчатой (зрелой) костной ткани коллагеновые (оссеиновые) волокна расположены параллельно друг другу. Биосинтетическая активность остеоцитов менее выражена по сравнению с активными зонами роста, поэтому остеоцитарные лакуны обычно имеют удлиненную форму.

Полученные результаты оценивают следующим образом:

1) при значениях фактора формы костных лакун 0,99-1,0 и показателя удлиненности меньше 1,4 считали, что метаболическая активность клеток находится в пределах нормы - метаболическое состояние костной ткани в пределах нормы;

2) при значениях фактора формы костных лакун от 0,95 до 0,98 и показателя удлиненности от 1,41 до 1,60 считали, что снижение функции клеток, расположенных в лакунах, имеет диспластический характер - гипопластическое состояние костной ткани обусловлено диспластическими процессами;

3) при значениях фактора формы костных лакун меньше 0,95 и показателя удлиненности больше 1,60 считали, что снижение функции клеток, расположенных в лакунах, имеет дистрофический характер - гипопластическое состояние костной ткани обусловлено дистрофическими процессами.

Примеры выполнения способа.

Пример 1

Пациент Б. Медицинская карта № 1036 Возраст 6 лет. Диагноз: несовершенный остеогенез.

Больному Б. в условиях операционной, под местным обезболиванием, произведена трепан-биопсия крыла подвздошной кости.

Биоптат фиксировали в нейтральном 10% формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, пропитывали и заливали в парафин, на микротоме изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм, проводили депарафинирование срезов и окрашивали их тионином с пикриновой кислотой по Шморлю.

Оцифровку полей зрения гистологических препаратов осуществляли на аппаратно-программном комплексе "ДиаМорф" (регистрационный МЗ РФ № 98/219-137). Морфометрическое исследование оцифрованных изображений выполняли с помощью программного обеспечения "ВидеоТесТ 4,0 - Мастер" (регистрационный № 29/20010702/6102-04). На изображениях полей зрения с помощью "мыши" оконтуривали границы остеоцитарных лакун и измеряли их площадь, фактор формы круга и удлиненность. Полученный цифровой материал обрабатывали в программе Microsoft Excel - 97 и вычисляли статистические характеристики параметров.

статистические характеристикиплощадь (мкм)фактор формы кругаудлиненностьМ90,240,971,53SD27,350,060,35Мо54,941,001,45min20,620,651,02max185,731,003,28

Из таблицы видно, что площадь остеоцитарных лакун изменялась от 20,62 до 185,73 мкм и составляла в среднем 90,24±27,35 мкм. Наиболее часто встречались лакуны с площадью 54,94 мкм². Средние значения фактора формы круга остеоцитарных лакун (0,97±0,06) и показателя удлиненности (1,53±0,02) указывали на то, что состояние костной ткани обусловлено диспластическими процессами, характерными для данного заболевания.

Пример 2

Пациентка Б. Медицинская карта № 4536, Возраст 5 лет. Диагноз: фосфат-диабет. Многоплоскостные деформации конечности.

Больной Б. в условиях операционной, под местным обезболиванием, произведена трепан-биопсия крыла подвздошной кости.

Биоптат фиксировали в нейтральном 10% формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, пропитывали и заливали в парафин, на микротоме изготавливали срезы толщиной 5-6 мкм, проводили депарафинирование срезов и окрашивали их тионином с пикриновой кислотой по Шморлю.

Оцифровку полей зрения гистологических препаратов осуществляли на аппаратно-программном комплексе "ДиаМорф" (регистрационный МЗ РФ № 98/219-137). Морфометрическое исследование оцифрованных изображений выполняли с помощью программного обеспечения "ВидеоТесТ 4,0 - Мастер" (регистрационный № 29/20010702/6102-04). На изображениях полей зрения с помощью "мыши" оконтуривали границы остеоцитарных лакун и измеряли их площадь, фактор формы круга и удлиненность. Полученный цифровой материал обрабатывали в программе Microsoft Excel - 97 и вычисляли статистические характеристики параметров.

статистические характеристикиплощадь (мкм²)фактор формы кругаудлиненностьМ72,970,852,15SD16,310,140,77Мо90,001,002,55min18,120,501,07max258,201,004,85

Средняя площадь остеоцитарных лакун составляла 72,97±16,31 мкм². Значения показателя колебались в пределах от 18,12 до 258,20 мкм². Наиболее часто встречались лакуны с площадью 90,00 мкм². Средние значения фактора формы круга остеоцитарных лакун (0,85±0,01) и показателя удлиненности (2,15±0,06) указывают на то, что состояние костной ткани обусловлено дистрофическими процессами, характерными для данного заболевания.

У больных с различными заболеваниями для сравнения размеров лакун в качестве дополнительного показателя определяли их площадь.

Предлагаемый способ позволяет с помощью статистических характеристик параметров, характеризующих форму и размер остеоцитарных лакун, оценить гипопластическое состояние костной ткани и, следовательно, прогнозировать течение заболевания и оценивать эффективность лечения. Установленные значимые различия между значениями параметров остеоцитарных лакун, характеризующих их форму и размер, у пациентов с несовершенным костеобразованием и фосфат-диабетом, указывают на то, что способ может быть использован для дифференциальной диагностики. Себестоимость анализа с помощью данного метода минимальна, так как обусловлена только стоимостью расходных материалов, применяемых в любой гистологической лаборатории для изготовления препаратов по стандартным методикам.

Предлагаемый способ разработан и применяется в научном экспериментально-клиническом отделе морфологических исследований ФГУН «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова Росздрава».

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки гипопластических состояний костной ткани. Сущность способа: осуществляют морфометрическое исследование клеток биоптатов гребня подвздошной кости. Затем изготавливают парафиновые срезы и окрашивают их по методу Шморля. Выполняют оцифровку изображений полей зрения полученных гистологических препаратов на аппаратно-программном комплексе, используя программное обеспечение. На изображениях гистологических препаратов в автоматическом или ручном режиме оконтуривают границы остеоцитарных лакун и определяют их фактор формы круга, удлиненность, рассчитывают статистические характеристики параметров. При значениях фактора формы костных лакун 0,99-1,0 и показателя удлиненности меньше 1,4 определяют, что метаболическое состояние костной ткани в пределах нормы. При значениях фактора формы костных лакун от 0,95 до 0,98 и показателя удлиненности от 1,41 до 1,60 определяют, что гипопластическое состояние костной ткани обусловлено диспластическими процессами. При значениях фактора формы костных лакун меньше 0,95 и показателя удлиненности больше 1,60 определяют, что гипопластическое состояние костной ткани обусловлено дистрофическими процессами. Использование способа позволяет оценить метаболическую активность костной ткани. 3 ил., 1 табл.

Способ оценки гипопластических состояний костной ткани, характеризующийся тем, что осуществляют морфометрическое исследование клеток костной ткани с помощью гистотопограмм, при этом в качестве объекта исследования используют биоптаты гребня подвздошной кости, взятые у больных в условиях операционной, затем изготавливают парафиновые срезы и окрашивают их по методу Шморля, выполняют оцифровку изображений полей зрения полученных гистологических препаратов на аппаратно-программном комплексе, используя программное обеспечение, на изображениях гистологических препаратов в автоматическом или ручном режиме оконтуривают границы остеоцитарных лакун и определяют их фактор формы круга, удлиненность, рассчитывают статистические характеристики параметров и при значениях фактора формы костных лакун 0,99-1,0 и показателя удлиненности меньше 1,4 определяют, что метаболическое состояние костной ткани в пределах нормы; при значениях фактора формы костных лакун от 0,95 до 0,98 и показателя удлиненности от 1,41 до 1,60 определяют, что гипопластическое состояние костной ткани обусловлено диспластическими процессами; при значениях фактора формы костных лакун меньше 0,95 и показателя удлиненности больше 1,60 определяют, что гипопластическое состояние костной ткани обусловлено дистрофическими процессами.