СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕПТИДОВ Российский патент 2008 года по МПК C07K5/83 A61K38/06 A61P7/04 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в хирургической практике. Разработка средств борьбы с геморрагиями - актуальная задача современной медицины. Кровотечения могут явиться причиной летального исхода и тяжелых осложнений при родах, в условиях боевых действий, при совершении террористических актов, во время массовых катастроф, при различных отравлениях и др.

Известно и получило широкое распространение в США и Европе средство, обладающее способностью останавливать кровотечение - ε-аминокапроновая кислота. Е-аминокапроновая кислота имеет структурное сходство с лизином, аргинином и конкурентно взаимодействует с активным центром активатора профибринолизина, препятствуя переходу профибринолизина в активный фибринолизин (Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. М.: Медицина, 1988).

Ghosh и др. [К. Ghosh, S. Shetty, F. Jijina, D. Mohanty, Haemophilia, 1, 58-62 (2004)] показали возможность успешного местного применения препаратов ε-аминокапроновой кислоты у пациентов с гемофилией. Учитывая низкую гемостатическую активность используемой в медицинской практике ε-аминокапроновой кислоты, требовалось создание более эффективных кровоостанавливающих средств.

Большинство известных низкомолекулярных ингибиторов плазмина представляют собой производные аминокислот и их аналоги. Однако лишь немногие соединения обладают низкой токсичностью, что является основным требованием, предъявляемым к синтетическим фармакологическим препаратам. С этой точки зрения весьма перспективными являются пептидные ингибиторы, которые легко усваиваются в организме, превращаясь в нетоксичные производные. Однако для плазмина подобные пептидные ингибиторы неизвестны.

Поскольку ранее показано, что пептидная последовательность -Ala-Phe-Lys- эффективно связывается с активным центром плазмина [Степанов В.М., Воюшина Т.Л., Терентьева Е.Ю., Мильготина Е.И., Неведрова О.Е., Макаров В.А., Коган А.Е. Патент РФ 2121690], именно она послужила нам основой для синтеза пептидных ингибиторов этого фермента.

Возникает задача синтеза пептидных ингибиторов плазмина, имеющих в структуре плазмин-специфичную последовательность аминокислот.

Задача решена путем создания и последующего применения новых синтетических пептидных производных формулы 1,

где PG представляет собой водород или формильную группу, a R₁ и R₂ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикл, выбранный из пиперидина или морфолина и их фармацевтически приемлемых солей, обладающих более эффективной гемостатической активностью и действующих непосредственно на активный плазмин.

Конкретные примеры проявления гемостатической активности соединений.

Пример 1

Пептид For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl (For- формил, Mf - морфолин-4-ил) получают последовательным наращиванием пептидной цепи, начиная с формилаланина.

Формилаланин (For-Ala) получают из свободного аланина и муравьиной кислоты в присутствии уксусного ангидрида аналогично методу получения формиласпарагиновой кислоты ("Химия природных соединений" 1991, 4, стр.588).

Метиловый эфир фенилаланина (Phe-ОСН₃·HCl) получают из фенилаланина и метилового спирта в присутствии хлористого тионила следующим образом.

К 500 мл абсолютного метанола в круглодонной колбе при охлаждении до (-7°С) при перемешивании в течение часа медленно прикапывают 50 мл свежеперегнанного хлористого тионила. После добавления всего количества хлористого тионила температуру реакционной смеси доводят до комнатной. Затем вносят в колбу 75 г фенилаланина, смесь энергично перемешивают до его полного растворения и выдерживают при комнатной температуре в течение 24 часов. Полноту реакции определяют при помощи тонкослойной хроматографии и аминокислотного анализатора. Содержание свободного фенилаланина не превышает 2% от общего количества продукта. Далее раствор упаривают досуха под вакуумом при температуре водяной бани 40°С. Для полного удаления следов хлористого тионила к сухому остатку добавляют абсолютный метанол (60 мл) и вновь выпаривают смесь до получения сухого остатка; такую обработку повторяют 5 раз. Полученный белый кристаллический осадок хлоргидрата метилового эфира фенилаланина переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают абсолютным диэтиловым эфиром, после чего осадок переносят в чашку Петри и сушат в вакуум-эксикаторе над едким натром. Выход продукта составляет 98%.

Защищенный дипептид For-Ala-Phe-ОСН₃ получают путем присоединения For-Ala к Phe-ОСН₃·HCl в щелочной среде в присутствии термолизина (металлопротеиназы из В. thermoproteolyticus) (Биоорганическая химия, 1986, т.12, №10, стр.1301-1305). Для омыления эфирной группы в полученном For-Ala- Phe-ОСН₃ 1,5 ммоля пептида растворяют в 5 мл метанола, добавляют 0,9 мл 1н. водного раствора едкого натра и смесь 2 часа перемешивают на магнитной мешалке, затем подкисляют соляной кислотой до рН 2. Выпавший осадок отделяют и перекристаллизовывают из изопропанола. Выход For-Ala-Phe-OH составляет 80%.

Замещенный амид лизина Boc-Lys(Z)-Mf получают из Boc-Lys(Z) и морфолина с использованием сукцинимидных эфиров (Maxim E. Sergeev, Tatiana L. Voyushina. «Convenient synthesis of novel natural amino acid cyclic amides for use as building blocks for proteinase inhibitors». Letters in Organic Chemistry, 2006, №3, 857).

Вос-защитную группу с Boc-Lys(Z)-Mf удаляют стандартным методом путем обработки насыщенным раствором хлористого водорода в уксусной кислоте (А.А.Гершкович, В.К.Кибирев. «Синтез пептидов. Реагенты и методы». Киев, Наукова Думка, 1987, стр.123).

Синтез целевого пептидного производного For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl осуществляют следующим образом.

К раствору 2,5 ммоль Lys(Z)Mf·HCl в 4 мл ДМФ добавляют последовательно 1 эквивалент триэтиламина, 1,5-кратный избыток For-Ala-Phe-OH, 1 эквивалент 1-гидроксибензотриазола и при охлаждении льдом 2-кратный избыток дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают в течение ночи, затем растворитель удаляют в вакууме, к остатку добавляют 150 мл хлороформа, смесь фильтруют через стеклянный пористый фильтр, осадок отбрасывают. Органический слой промывают последовательно 3×40 мл каждого из растворов: 5% гидрокарбоната натрия, водой, 5% лимонной кислотой, затем водой до нейтральной реакции. Органический раствор сушат сульфатом натрия, упаривают в вакууме. Остаток растворяют в минимальном объеме метанола, содержащего 5-6 капель уксусной кислоты, и гидрируют в присутствии палладиевой черни по известной методике (Дж. Гринштейн, М.Винниц, Мир, 1965, стр.695). После окончания реакции смесь фильтруют через бумажный фильтр, растворитель удаляют в вакууме, остаток растворяют в воде и лиофильно высушивают. Выход продукта составляет 70%.

Остальные производные пептидов, имеющие структуру, заявленную в формуле изобретения, получают аналогично, используя вместо Lys(Z)Mf·HCl пиперидид лизина, синтез которого известен (Maxim E. Sergeev, Tatiana L. Voyushina. «Convenient synthesis of novel natural amino acid cyclic amides for use as building blocks for proteinase inhibitors». Letters in Organic Chemistry, 2006, №3, 587).

Пример 2

Эксперименты по изучению влияния пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl на каолин-активированный лизис сгустка проводили в лабораторных условиях. Перед началом эксперимента пептид For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl растворяли в 1 мл дистиллированной воды в концентрации 5 мг/мл (0,01 М). Полученный раствор переносили в пластиковую пробирку и последовательно добавляли 0,5 мл плазмы, 6,5 мл дистиллированной воды, 0,25 мл суспензии каолина и 0,18 мл 1% уксусной кислоты. Смесь инкубировали на водяной бане при температуре 37°С в течение 30 мин. Затем реакционную смесь центрифугировали в течение 6 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, пробирку опрокидывали на фильтровальную бумагу и осушали в течение 1 минуты. Оставшийся на дне пробирки эуглобулиновый осадок разводили в 0,5 мл рабочего раствора 0,01 М трис-HCl буфера, рН 7,4. Далее к 0,5 мл раствора эуглобулинов с пептидом For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl в пробирке добавляли 0,5 мл 0,277% раствора CaCl₂, осторожно перемешивали покачиванием пробирки и инкубировали на водяной бане при температуре 37°С. Регистрировали время с момента добавления CaCl₂ до полного растворения сгустка. В качестве контроля использовали дистиллированную воду и ε-аминокапроновую кислоту. Исследуемый пептид For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl по сравнению с контролем (7,0 мин) заметно замедлял XIIa-зависимый эуглобулиновый лизис, что привело к удлинению времени растворения сгустка до 22,6 мин. По времени действия данный результат сравним с действием ε-аминокапроновой кислоты (30,0 мин).

Пример 3

Эксперименты по изучению влияния пептида For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl (Pip - пиперидин-1-ил) на каолин-активированный лизис сгустка проводили в лабораторных условиях. Перед началом эксперимента пептид For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl растворяли в 1 мл дистиллированной воды в концентрации 5 мг/мл (0,01 М). Полученный раствор переносили в пластиковую пробирку и последовательно добавляли 0,5 мл плазмы, 6,5 мл дистиллированной воды, 0,25 мл суспензии каолина и 0,18 мл 1% уксусной кислоты. Смесь инкубировали на водяной бане при температуре 37°С в течение 30 мин. Затем реакционную смесь центрифугировали в течение 6 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, пробирку опрокидывали на фильтровальную бумагу и осушали в течение 1 минуты. Оставшийся на дне пробирки эуглобулиновый осадок разводили в 0,5 мл рабочего раствора 0,01 М трис-HCl буфера, рН 7,4. Далее к 0,5 мл раствора эуглобулинов с пептидом For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl в пробирке добавляли 0,5 мл 0,277% раствора CaCl₂, осторожно перемешивали покачиванием пробирки и инкубировали на водяной бане при температуре 37°С. Регистрировали время с момента добавления CaCl₂ до полного растворения сгустка. В качестве контроля использовали дистиллированную воду и ε-аминокапроновую кислоту. Исследуемый пептид For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl по сравнению с контролем (7,0 мин) заметно замедлял XIIa-зависимый эуглобулиновый лизис, что привело к удлинению времени растворения сгустка до 21,9 мин. По времени действия данный результат сравним с действием ε-аминокапроновой кислоты (30,0 мин).

Пример 4

Эксперименты по определению кинетических параметров синтезированных пептидов For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl и For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl проводили в лабораторных условиях на спектрофотометре СФ 101 фирмы «Аквилон». Для измерения константы Михаэлиса (Km) для плазмина использовали амидолитический метод на основе плазминового хромогенного субстрата. Концентрация плазмина в данном эксперименте составила 30 мг белка в 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Для построения кинетической кривой и расчета Km измерения проводили на спектрофотометре с длиной волны 410 нм в 10 мм кювете. Для этого в кювете смешивали 10 мкл плазмина и рассчитанное количество 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Последним добавляли рассчитанное количество плазминового субстрата. Объем субстрата варьировали: 0,03 - 0,30 мл (концентрация субстрата в кювете составляла 2,65·10^-4-2,65·10^-5), объем буфера варьировали соответственно от 0,810 до 1,08 мл. Скорость гидролиза регистрировали по накоплению п-нитроанилина. Km вычисляли по уравнению Михаэлиса-Ментен. Эксперименты по определению константы ингибирования (Ki) оригинальных пептидов For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl и For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl проводили в лабораторных условиях на спектрофотометре СФ 101 фирмы «Аквилон». Для измерения использовали амидолитический метод на основе плазминового хромогенного субстрата. Концентрация плазмина в данном эксперименте составила 30 мг белка в 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Исходные концентрации синтезированных пептидов использовались идентичные и составили 4 мкМ (20 мг/мл). Для вычисления Ki измерения проводили на спектрофотометре с длиной волны 410 нм в 10 мм кювете. Для этого в кювете смешивали 10 мкл плазмина, 10 мкл или 20 мкл соответствующего синтезированного пептида и рассчитанное количество 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl (концентрации пептидов в кювете составили 0,3 и 0,6 мМ соответственно). Последним добавляли рассчитанное количество плазминового хромогенного субстрата. Объем субстрата варьировали: 0,03 - 0,30 мл (концентрация субстрата в кювете составляла 2,65·10^-4-2,65·10^-5), объем буфера варьировали соответственно от 0,800 до 1,07 мл. Скорость гидролиза регистрировали по накоплению п-нитроанилина. Ki вычисляли по следующему уравнению:

где [I₅₀] - концентрация ингибитора, при которой скорость реакции равна половине от максимальной и составляет для данных синтезированных пептидов 66 мкм, [S] - концентрация хромогенного субстрата.

Константа Михаэлиса составила 1,33·10^-3 М и константа ингибирования 19,08·10^-6 М для пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl и 19,20·10^-6 М для пептида For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl.

Пример 5

Эксперименты по изучению влияния пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl на функцию гемостаза проводили в лабораторных условиях на кроликах породы "Шиншилла" обоего пола массой 2-4 кг. Эксперименты по оценке гемостатического эффекта проводили под тиопенталовым наркозом (4-8 мл 1% раствора внутривенно, а затем до 6-10 мл 1,5% раствора внутрибрюшинно). Выполняли лапаротомию, используя продольный разрез по белой линии живота. В рану выводили кишечник, ограничивая его салфетками, смоченными теплым физиологическим раствором, и переднюю поверхность печени. С помощью специального приспособления-ограничителя острой бритвой наносили поверхностную рану печени около 1,5 см квадратных и глубиной около 0,1 см. Остановку развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения проводили путем нанесения 1 мл раствора пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl в дозе 1 мг/см² на всю площадь кровоточащей раны. Пептид останавливал кровотечение через 122 секунды. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки и ε-аминокапроновой кислоты. При этом кровотечение останавливалось за 258 секунд при использовании марлевой салфетки и за 186 секунд при использовании ε-аминокапроновой кислоты.

Пример 6

Эксперименты по изучению влияния пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl на функцию гемостаза проводили в лабораторных условиях на кроликах породы "Шиншилла" обоего пола массой 2-4 кг. Эксперименты по оценке гемостатического эффекта вещества проводили под тиопенталовым наркозом (4-8 мл 1% раствора внутривенно, а затем до 6-10 мл 1,5% раствора внутрибрюшинно). Выполняли лапаротомию, используя продольный разрез по белой линии живота. В рану выводили кишечник, ограничивая его салфетками, смоченными теплым физиологическим раствором, и переднюю поверхность печени. С помощью специального приспособления-ограничителя острой бритвой наносили поверхностную рану печени около 1,5 см квадратных и глубиной около 0,1 см. Остановку развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполняли путем нанесения раствора пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl в дозе 5 мг/см² на всю площадь кровоточащей раны. Исследуемый пептид останавливал кровотечение через 90 секунд. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки и ε-аминокапроновой кислоты. При этом кровотечение останавливалось за 258 секунд при использовании марлевой салфетки и за 186 секунд при использовании ε-аминокапроновой кислоты.

Пример 7

Эксперименты по изучению влияния пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl на функцию гемостаза проводили в лабораторных условиях на кроликах породы "Шиншилла" обоего пола массой 2-4 кг. Эксперименты по оценке гемостатического эффекта проводили под тиопенталовым наркозом (4-8 мл 1% раствора внутривенно, а затем до 6-10 мл 1,5% раствора внутрибрюшинно). Выполняли лапаротомию, используя продольный разрез по белой линии живота. В рану выводили кишечник, ограничивая его салфетками, смоченными теплым физиологическим раствором, и переднюю поверхность печени. С помощью специального приспособления-ограничителя острой бритвой наносили поверхностную рану печени около 1,5 см квадратных и глубиной около 0,1 см. Остановку развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполняли путем нанесения раствора пептида For-Ala-Phe-Lys-Mf·HCl в дозе 10 мг/см² на всю площадь кровоточащей раны. Пептид останавливал кровотечение через 77 сек. В качестве контроля использовали остановку кровотечения путем плотного прижатия к раневой поверхности тампона из марлевой салфетки и ε-аминокапроновой кислоты. При этом кровотечение останавливалось за 258 секунд при использовании марлевой салфетки и за 186 секунд при использовании ε-аминокапроновой кислоты.

Пример 8

Влияние пептида For-Ala-Phe-Lys-Pip·HCl на функцию гемостаза проводили аналогично примерам 5-7. При этом кровотечение останавливалось через 105±9 сек, 60±5 сек и 83±7 сек при концентрациях пептида 1 мг/см², 5 мг/см² и 10 мг/см² соответственно.

Таким образом, применение синтезированных нами пептидных производных, представляющих собой соединения формулы 1, позволяет в 2-4 раза сократить время остановки кровотечения по сравнению с немедикаментозными средствами, а также в ряде случаев превосходит гемостатическую активность ε-аминокапроновой кислоты.

Изобретение относится к производным пептидов, обладающих высокой гемостатической активностью. Предложены соединения формулы 1, где PG представляет собой водород или формильную группу, a R₁ и R₂ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикл, выбранный из пиперидина или морфолина, и их фармацевтически приемлемые соли.

Синтетические производные пептидов формулы 1

где PG представляет собой водород или формильную группу,

a R₁ и R₂ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероцикл, выбранный из пиперидина или морфолина,

и их фармацевтически приемлемые соли.