ТРОМБОЛИТИКИ ДЛЯ ВНУТРИСОСУДИСТЫХ ТРОМБОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N9/50 A61K38/48 A61P7/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к тромболитику для «внутрисосудистого тромба», и более конкретно, к тромболитику, имеющему распознающий тромб домен и тромболитический домен. Настоящее изобретение также относится к полипептиду для тромболизиса внутрисосудистого тромба, гену этого полипептида и содержащей их фармацевтической композиции.

Уровень техники

При повреждении ткани кровеносного сосуда кровь вытекает из кровеносного сосуда. Для предотвращения кровотечения в ткани кровеносного сосуда вокруг раны образуется сгусток крови. Этот тромб в ткани, ограниченный местом раны и предотвращающий кровотечение, является нормальным процессом заживления ран и важным процессом для выживания животных, в том числе людей. С другой стороны, аномальный сгусток крови в кровеносном сосуде называется «внутрисосудистым тромбом». Если сгусток крови не удалить, кровоток блокируется, вызывая возникновение тромбоза. Блокирование кровотока вызывает смертельные, связанные с тромбообразованием заболевания, такие как инсульт, инфаркт легкого и инфаркт миокарда, которые являются причиной некроза тканей из-за гипоксии. Следовательно, если возникает тромбоз, срочно необходимо немедленное лечение.

Были разработаны различные терапевтические средства для лечения тромбоза, который является очень серьезным заболеванием и с высоким коэффициентом заболеваемости. Тромболитики являются прямыми терапевтическими средствами, растворяющими тромб, такими как активатор плазминогена тканевого типа (tPA) (US 4766075, US 5185259, US 5587159, US 5869314, US 6274335), урокиназа (US 4259447, US 4851345, US 5055295, US 6759042) и стрептокиназа (US 3855065, US 5011686, US 7105327). Все эти тромболитики, т.е. tPA (алтеплаза, ретеплаза), урокиназа и стрептокиназа, связываются с плазминогеном в организме и активируют его путем превращения в плазмин, активированный фермент, который расщепляет тромб, приводя к тромболизису. Однако активированный тромболитический плазмин также расщепляет гемостатические сгустки крови, которые образовались для предотвращения кровотечения из поврежденных кровеносных сосудов, вызывая сильное кровотечение из места раны. Это обусловлено тем, что плазмин является неспецифическим тромболитиком, не обладающим специфичностью в отношении «внутрисосудистого тромба». Из-за серьезных побочных эффектов плазмина в виде кровотечений, все тромболитики, которые вызывают образование плазмина, такие как tPA, урокиназа и стрептокиназа, используются только в ограниченных случаях.

Из-за смертельных побочных эффектов этих тромболитиков, в клинической практике используются антикоагулянты, такие как гепарин, варфарин, давигатран и т.д., или антиагреганты, такие как аспирин, вместо тромболитиков для пациентов с тромбозом. Антикоагулянты и антиагреганты не могут растворить уже образовавшиеся тромбы, но предотвращают дополнительное образование тромбов в кровеносных сосудах. Таким образом, они не оказывают значительное влияние на лечение тромбоза, хотя и не вызывают смертельных системных кровотечений, в отличие от плазмин-активирующих тромболитиков. Кроме того, антикоагулянты и антитромбоцитарные средства препятствуют образованию нормальных гемостатических сгустков крови и, таким образом, препятствуют заживлению ран, что приводит к тяжелому кровотечению из поврежденных сосудов без заживления ран.

Следовательно, для лечения тромбоза крайне необходима разработка специфичного для «внутрисосудистого тромба» тромболитика, который точно распознает и расщепляет только «внутрисосудистый тромб», но не гемостатический тромб, и сводит к минимуму побочные эффекты в виде кровотечений, не мешая нормальному заживлению ран.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что идеальным средством для лечения тромбоза будет специфичный для «внутрисосудистого тромба» тромболитик, который растворяет только «внутрисосудистый тромб», не мешая нормальному процессу свертывания крови и заживлению ран, происходящему в сосудистой ткани. Были предприняты попытки разработать специфичный для «внутрисосудистого тромба» тромболитик. Следовательно, одной целью настоящего изобретения является предоставление инновационного тромболитика для «внутрисосудистого тромба» в качестве средства для лечения тромбоза, который не имеет каких-либо серьезных побочных эффектов в виде кровотечений, таких как смертельное системное кровотечение, благодаря специфическому растворению с его помощью «внутрисосудистого тромба», вызывающего тромбоз.

Техническое решение

Для достижения вышеуказанной цели настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему тромболитический домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и распознающий тромб домен, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, тем самым предоставляя полипептид для распознавания и растворения «внутрисосудистых тромбов».

Настоящее изобретение также относится к гену тромболитического домена, характеризующемуся тем, что он имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, которая кодирует тромболитический домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Настоящее изобретение также относится к гену распознающего тромб домена, кодирующему распознающий тромб домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, характеризующемуся тем, что он имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения или предотвращения тромбоза и связанных с ним заболеваний, характеризующаяся тем, что она содержит полипептид или кодирующий его ген в качестве активного ингредиента путем распознавания «внутрисосудистого тромба» и растворения «внутрисосудистого тромба».

Эффект

В соответствии с настоящим изобретением полипептид для растворения тромба путем распознавания «внутрисосудистого тромба» растворяет тромб в крови млекопитающего без серьезных побочных эффектов в виде кровотечений, тем самым обладая профилактической и терапевтической эффективностью против тромбоза.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой результат в виде подтверждения тромболитической способности после обработки тромболитическим ферментом SK или HtrA1 в случае тромба ex vivo в соответствии с экспериментальным примером 1 настоящего изобретения (а; изображение, на котором тромб представляет собой растворенную (HA1) и нерастворенную массу тромба (SK), b; растворимость тромба, представленная в % до обработки, c; продукты расщепления фибрина (FDP) в результате растворения тромба, d; количество D-димера в результате растворения тромба (Ctrl: контроль, SK: стрептокиназа, HA1: полипептид HtrA1 распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб)).

Фиг. 2 представляет собой результат в виде подтверждения тромболитической способности после обработки тромболитическим ферментом SK или HtrA2 в случае тромба ex vivo в соответствии с экспериментальным примером 1 настоящего изобретения (a; изображение, на котором тромб представляет собой растворенную (HA2) и нерастворенную массу тромба (SK), b; растворимость тромба, представленная в % до обработки, c; продукты расщепления фибрина (FDP) в результате растворения тромба, d; количество D-димера в результате растворения тромба, (Ctrl: контроль, SK: стрептокиназа, HA2: полипептид HtrA2, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб)).

Фиг. 3 представляет собой результат в виде подтверждения действия в виде активации плазминогена путем превращения его в плазмин «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида HtrA1 в соответствии с экспериментальным примером 2 настоящего изобретения (а; измерение интенсивности флуоресценции субстрата, растворенного плазмином, образованным при активации плазминогена; b; изображение SDS-ПААГ, подтверждающее полосу, соответствующую плазмину, образованному при активации плазминогена (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, HA1: полипептид HtrA1, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб)).

Фиг. 4 представляет собой результат в виде подтверждения действия в виде активации плазминогена путем его превращения в плазмин «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида HtrA1 в соответствии с экспериментальным примером 2 настоящего изобретения (а; измерение интенсивности флуоресценции субстрата, растворенного плазмином, образованным при активации плазминогена; b; изображение SDS-ПААГ, подтверждающее полосу, соответствующую плазмину, образованному при активации плазминогена (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, HA2: полипептид HtrA2, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб)).

Фиг. 5 представляет собой результат в виде подтверждения действия осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба полипептида по настоящему изобретению на компоненты фибринолиза процесса заживления ран с целью оценки того, обладает ли тромболитический полипептид тромбоспецифичностью, в соответствии с экспериментальным примером 3 настоящего изобретения (а; изображение SDS-ПААГ для подтверждения расщепления фибриногена с превращением его в фибрин при обработке каждым тестируемым тромболитическим ферментом, b; изображение иммуноблота для подтверждения расщепления клеточного фибронектина при обработке каждым тестируемым тромболитическим ферментом, c; изображение иммуноблота для подтверждения расщепления фибронектина плазмы при обработке каждым тестируемым тромболитическим ферментом (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, HA1: полипептид HtrA1, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб)).

Фиг. 6 представляет собой результат в виде изображения хвоста с тромбозом, подтверждающий терапевтическую эффективность «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида по настоящему изобретению в отношении тромбоза у мышей с тромбозом хвоста с использованием модели на животном в соответствии с примером 1 настоящего изобретения (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, tPA: тканевой активатор плазминогена, HA1: полипептид HtrA1, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий тромб, HA2: полипептид HtrA2, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб).

Фиг. 7 представляет собой результат в виде окрашивания гематоксилином и эозином тромботической ткани хвоста, подтверждающий терапевтическую эффективность «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида по настоящему изобретению в отношении тромбоза у мышей с тромбозом хвоста с использованием модели на животном в соответствии с примером 1 настоящего изобретения (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, tPA: тканевой активатор плазминогена, HA1: полипептид HtrA1, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий тромб, HA2: полипептид HtrA2, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб).

Фиг. 8 представляет собой результат в виде изображения результат в виде изображения кровотечения, подтверждающий эффект «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида по настоящему изобретению на заживление ран с использованием модели раны на животном в соответствии с примером 3 настоящего изобретения (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, tPA: тканевой активатор плазминогена, HA1: полипептид HtrA1, который распознает «внутрисосудистый тромб» и растворяет тромб, HA2: полипептид HtrA2, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб).

Фиг. 9 представляет собой результат теста на кровотечение, подтверждающий эффект «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида HtrA1 по настоящему изобретению на заживление ран с использованием модели раны на животном в соответствии с примером 3 настоящего изобретения. (а; измерение времени кровотечения, b; измерение кровоизлияния, c; измерение содержания гемоглобина в жидкости в виде истекающей крови, d; измерение времени, необходимого для заживления раны и свертывания крови (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, HA1: полипептид HtrA1, распознающий «внутрисосудистый тромб» и этот тромб)).

Фиг. 10 представляет собой результат теста на кровотечение, подтверждающий эффект «осуществляющего лизис внутрисосудистого тромба» полипептида HtrA1 по настоящему изобретению на заживление ран с использованием модели раны на животном в соответствии с примером 3 настоящего изобретения. (а; измерение времени кровотечения, b; измерение кровоизлияния, c; измерение содержания гемоглобина в жидкости в виде истекающей крови, d; измерение времени, необходимого для заживления раны и свертывания крови (Ctrl: контроль, PL: плазмин, SK: стрептокиназа, UK: урокиназа, HA2: полипептид HtrA2, распознающий «внутрисосудистый тромб» и растворяющий этот тромб)).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Были разработаны различные средства для растворения тромба, внутрисосудистого сгустка крови, но все обычные тромболитики оказывают серьезные побочные эффекты в виде кровотечений, что затрудняет эффективное лечение тромбоза и связанных с ним заболеваний. Кроме того, эти средства для лечения не могут эффективно предотвращать тромбоз.

Авторы настоящего изобретения сосредоточили внимание на том факте, что «внутрисосудистый тромб» представляет собой своего рода белковый агрегат, и что белки контроля качества, которые расщепляют агрегированные белки, необходимы для выживания организмов. Были проведены эксперименты во всех отношениях для идентификации эндогенной протеиназы, имеющей домен, который распознает неправильно свернутый/агрегированный белок и растворяет неправильно свернутый/агрегированный белок в организме, и для подтверждения того, что эта эндогенная протеиназа может растворять агрегированные сгустки крови в кровеносных сосудах.

Соответственно, в настоящем изобретении был проведен обширный поиск доменов, которые распознают неправильно свернутые/агрегированные белки, доменов, которые растворяют неправильно свернутые/агрегированные белки, и белков контроля качества, включающих эти домены. В результате было подтверждено, что полипептид, имеющий распознающий тромб домен и тромболитический домен, может осуществлять лечение тромбоза без серьезных побочных эффектов в виде кровотечений, путем специфического распознавания «внутрисосудистого тромба» и специфического растворения «внутрисосудистого тромба».

В настоящем изобретении было подтверждено, что полипептид, который распознает и растворяет «внутрисосудистый тромб» с помощью распознающего внутрисосудистый тромб домена и тромболитического домена и растворяет этот тромб, (1) обладает превосходной тромболитической активностью, (2) в отличие от обычных тромболитиков, отсутствовал риск кровотечения из-за образования плазмина, поскольку он не активирует плазминоген путем его превращения в плазмин, (3) в отличие от обычных тромболитиков, он не расщеплял белки, важные для заживления ран, такие как фибриноген, с-фибронектин и p-фибронектин, так что он не мешает заживлению ран, (4) он эффективно лечил тромбоз в модели на животном in vivo, (5) полностью излечивал тромбоэмболию с коэффициентом выживаемости, составляющим 100%, в модели на животном in vivo, в отличие от обычных тромболитиков, (6) отсутствовали побочные эффекты в виде кровотечений, поскольку он не мешал свертыванию крови и заживлению ран в экспериментах на животных с кровотечением in vivo, в отличие от обычных тромболитиков.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения было подтверждено, что, с терапевтической эффективностью в случае модели тромбоза в хвосте мыши, полипептид, который распознает и растворяет «внутрисосудистый тромб» по настоящему изобретению, излечивает тромбоз, в отличие от обычных тромболиков.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения было подтверждено, что полипептид, который распознает и растворяет «внутрисосудистый тромб» по настоящему изобретению, излечивает смертельную тромбоэмболию с коэффициентом выживаемости, составляющим 100%, в то время как обычные тромболитики не лечат, но приводят к гибели мышей.

Кроме того, в эксперименте с кровотечением из хвоста мышей было подтверждено, что полипептид, который распознает и растворяет «внутрисосудистый тромб» по настоящему изобретению, обладает идеальной эффективностью в заживлении ран без каких-либо побочных эффектов в виде кровотечений, при этом эти мыши неотличимым от необработанной контрольной группы по таким показателям, как время кровотечения в месте раны, объем кровотечения, количество потерянного гемоглобина и необходимое для свертывания крови время.

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, который распознает «внутрисосудистый тромб» и растворяет этот тромб, причем указанный полипептид характеризуется тем, что он состоит из тромболитического домена, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и распознающего тромб домена, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

В настоящем изобретении указанный полипептид состоит из тромболитического домена, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и распознающего тромб домена, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или указанный полипептид состоит из тромболитического домена, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и распознающего тромб домена, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.

В настоящем изобретении указанный полипептид, который распознает «внутрисосудистый тромб» и растворяет этот тромб, характеризуется тем, что он относится к сериновой протеазе, которая представляет собой трипсиноподобный полипептид, предпочтительно из семейства с необходимым условием термостойкости (Htr). Более того он характеризуется тем, что содержит HtrA1 и HtrA2.

Указанный тромболитический домен может представлять собой домен, гомологичный на 50% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, причем тромболитический домен характеризуется в качестве придающего активность сериновой протеазы домена, включающего пептид GNSGGPL или схожий пептид.

Указанный распознающий тромб домен может быть доменом, гомологичным на 50% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, и характеризуется тем, что он имеет топологическую структуру, состоящую из множества комбинаций бета-цепи и альфа-спирали. Таким образом, указанный распознающий тромб домен может представлять собой PDZ-домен или PDZ-подобный домен, обладающий функцией распознавания «внутрисосудистого тромба» и регулирования активности тромболитического фермента.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гену тромболитического домена, включающему нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6, которая кодирует тромболитический домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Указанный ген тромболитического домена характеризуется тем, что он на 50% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более гомологичен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к гену распознающего тромб домена, включающему нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO:4, которая кодирует распознающий тромб домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.

Указанный ген распознающего тромб домена характеризуется тем, что он на 50% или более, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более гомологичен нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или предотвращения тромбоза и связанных с ним заболеваний, характеризующаяся тем, что она содержит полипептид или кодирующий его ген в качестве активного ингредиента для распознавания «внутрисосудистого тромба» и растворения этого тромба.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемый носитель, обычно используемый в рецептуре, примерами которого могут служить лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, аравийская камедь, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, вода, сироп, метилцеллюлоза, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.д. Настоящее изобретение не ограничивается ими.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может, кроме того, включать лубрикант, смачивающий агент, подсластитель, корригент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант и т.п. в дополнение к вышеуказанным компонентам. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и агенты подробно описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (19-е изд., 1995).

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально, предпочтительно парентерально, а в случае парентерального введения - с помощью внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, местного введения, чрескожного введения и т.д.

Подходящая доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению назначается по-разному в зависимости от таких факторов, как способ приготовления, способ введения, возраст, вес тела, пол, патологическое состояние, питание, время введения, путь введения, скорость выделения и чувствительность к воздействию у пациента. При этом предпочтительная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению составляет 0,0001-1000 мкг/день.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению готовят в стандартной лекарственной форме путем составления рецептуры с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя в соответствии со способом, который может легко осуществить специалист со средним уровнем компетентности в области, к которой относится настоящее изобретение. Или ее можно приготовить путем внесения в многодозовый контейнер. В этом случае препарат может быть в виде раствора, суспензии или эмульсии в масляной или водной среде, либо в виде экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы и может дополнительно включать диспергатор или стабилизатор.

Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения тромбоза и связанных с ним заболеваний в соответствии с настоящим изобретением обладает эффектом растворения «внутрисосудистого тромба» при минимизации побочных эффектов в виде кровотечений при введении млекопитающему.

В настоящем изобретении тромбоз и связанные с ним заболевания могут быть выбраны из группы, которая включает, но без ограничения этим, тромбоз, эмболию, тромбоэмболию, артериальную тромбоэмболию, венозную тромбоэмболию (VTE), сердечнососудистое заболевание, цереброваскулярное заболевание, ишемическую болезнь и т.д. В частности, они могут быть выбран из группы, которая включает, но без ограничения этим, тромбоз глубоких вен (DVT), эмболию легочной артерии (PE), ишемический инсульт, инсульт, кровоизлияние в мозг, инфаркт головного мозга, инфаркт миокарда, сердечный приступ и стенокардию (нестабильную стенокардию).

Примеры

Далее настоящее изобретение будет подробнее описано на конкретных примерах. Однако эти примеры предназначены только для более подробного описания настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Эксперимент 1: Оценка тромболитической эффективности ex vivo

Полипептиды HtrA1 и HtrA2, которые распознают «внутрисосудистый тромб» и растворяют этот тромб, получали в виде рекомбинантных белков. кДНК, соответствующую положениям 157-480 в аминокислотной последовательности HtrA1 (SEQ ID NO: 9), содержащей как распознающий внутрисосудистый тромб домен, так и тромболитический домен, использовали вместе с прямым праймером (5'-AATTCATATGCAAGGGCAGGAAGATCCCA-3') (SEQ ID NO:11) и обратным праймером (5'-TATCTCGAGCTATGGGTCAATTTCTTCGGG-3') (SEQ ID NO:12) для амплификации методом ПЦР. Для условий ПЦР после первоначальной денатурации при 95°С в течение 5 минут амплификацию (в течение 30 секунд при 95°С, 1 минуты при 63°С, 2 минут при 72°С) повторяли 34 раза, а затем 10 минут при 72°С. Амплифицированный продукт субклонировали в сайт NdeI/XhoI экспрессионного вектора pET28a+ (Novagen, США). Полученную рекомбинантную плазмиду, кодирующую HtrA1, подвергали электропорации в E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene, США) и культивировали с добавлением IPTG для экспрессии HtrA1. Культуральную среду после экспрессии обрабатывали ультразвуком для получения клеточного лизата, пропускали через хроматографическую колонку econo-pac (Bio-Rad) и затем очищали на колонке PD-10 (Amersham, США) для получения рекомбинантного белка HtrA1. В случае HtrA2 кДНК, соответствующую положениям 134-458 в аминокислотной последовательности HtrA2 (SEQ ID NO:10), использовали вместе с прямым праймером (5'-GTCCTCGCCCATATGGCCGTCCCTAGCC-3') (SEQ ID NO:13) и обратным праймером (5'-GGCTCTCGAGTCATTCTGTGACCTCAGGG-3') (SEQ ID NO:14) для амплификации методом ПЦР. Для ПЦР после первоначальной денатурации при 95°С в течение 5 минут амплификацию (в течение 30 секунд при 95°С, 45 секунд при 65°С, 1 минуты при 72°С) повторяли 34 раза, а затем 10 минут при 72°С. После этого был получен рекомбинантный белок HtrA2 путем субклонирования и экспрессии с экспрессионного вектора pET28a+ (Novagen, США) таким же образом, как и в случае HtrA1.

Тромболитическую активность рекомбинантных белков HtrA1 и HtrA2 подтверждали с использованием тромба ex vivo. Тромб готовили с использованием крови, богатой тромбоцитами, и тромб обрабатывали либо 50 мМ Tris-HCl в качестве контроля, либо каждым тромболитическим ферментом (2 мг/мл) при 37°С в течение 24 часов. После обработки измеряли вес тромба и представляли в процентах до обработки. Кроме того, была проведена количественная оценка продуктов расщепления фибрина (FDP) и D-димера, образующегося при расщеплении полимера фибрина, составляющего тромб.

На фиг. 1, тромболитическая способность HtrA1 (фиг. 1а, b) и способность к расщеплению фибрина (фиг. 1c, d) были намного выше таковых у обычных тромболитических ферментов. На фиг. 2, HtrA2 также продемонстрировал более высокую тромболитическую активность (а, b на фиг. 2) и способность к расщеплению фибрина (c, d на фиг. 2), чем обычные тромболитические ферменты.

Эксперимент 2: Оценка образования плазмина (тромболитический механизм)

Данный тромболитический механизм тромболитика представляет собой плазмин-зависимый фибринолиз при активации плазмининогена путем его превращения в плазмин. Для подтверждения механизма действия по сравнению с обычными тромболитическими ферментами каждый тромболитический фермент (0,1 мг/мл) добавляли к плазминогену (1,23 мкМ) и специфичному для плазмина флуоресцентному субстрату Boc-Glu-Lys-Lys-MCA (100 мкМ). После инкубации активацию плазминогена путем его превращения в плазмин подтверждали измерением интенсивности флуоресценции субстрата, растворенного плазмином. Полосы, соответствующие плазмину, образованному в результате фактической активации плазминогена путем его превращения в плазмин, подтверждали с помощью электрофореза в SDS-ПААГ после добавления каждого фермента (0,15 мг/мл) к плазминогену (5,14 мкМ).

По сравнению с обычным тромболитическим ферментом HtrA1 не активировал плазминоген (фиг. 3а), и, соответственно, не происходило образование плазмина (фиг. 3b). Аналогично, HtrA2 также не оказывал эффект на плазминоген (фиг. 4а), и, как результат, HtrA2 не приводил к образованию плазмина (фиг. 4b).

Эксперимент 3: Оценка тромбоспецифичности

Для оценки тромбоспецифичности HtrA1 исследовали фибринолитическую активность компонентов, участвующих в процессе заживления ран. Фибриновый сгусток, полученный в результате реакции фибриногена с тромбином, инкубировали с 50 мМ Tris-HCl в качестве контроля или тромболитическим ферментом (2 мг/мл) при 37°С в течение 24 часов. Растворение фибринового сгустка измеряли при длине волны 415 нм, используя спектрофотометр. Для обнаружения действия HtrA1 на фибриноген, 5 мкМ фибриногена инкубировали с 50 мМ Трис-HCl в качестве контроля или каждым тромболитическим ферментом (0,15 мг/мл) в течение 3 часов при 37°С. Электрофорез в SDS-ПААГ проводили для подтверждения фибринолитической активности HtrA1 в отношении фибриногена. Для обнаружения действия HtrA1 на фибронектин, 1,5 мкМ фибронектина инкубировали с 50 мМ Трис-HCl в качестве контроля или каждым тромболитическим ферментом (0,15 мг/мл) в течение 3 часов при 37°С и разделяли в 4-12% SDS-геле для иммуноокрашивания с использованием cFN или антитела против pFN.

Как показано в таблице 1, HtrA1 и HtrA2 не только продемонстрировали статистически значимое различие в оптической плотности по сравнению с необработанной контрольной группой, но также продемонстрировали статистически значимое отличие по оптической плотности от обычного тромболитического фермента стрептокиназы. Для растворения фибринового сгустка наилучшим оказался HtrA1, за ним следует HtrA2.

Таблица 1 Группы ОП₄₁₅ Контроль 1,870±0,05 Стрептокиназа 1,335±0,07^a Урокиназа 1,047±0,06^a HtrA1 1,055±0,10^{a, b} HtrA2 1,002±0,09^{a, b}

a; р<0,05 значимое отличие от контрольной группы.

b; p<0,01, значимое отличие от группы обработки стрептокиназой.

В отличие от обычных тромболитических ферментов, HtrA1 не расщепляет фибриноген, критический компонент для гемостаза в месте раны (фиг. 5a). Кроме того, HtrA1 не расщепляет ни клеточный фибронектин (фиг. 5b), ни фибронектин плазмы (фиг. 5c).

Наконец, для изучения активности HtrA1 в процессе заживления ран, исходя из кожи хвоста мышей BALB/c делали наружную резаную рану (~30 мм²). Иссеченные кусочки раневой ткани инкубировали с 50 мМ Tris-HCl в качестве контроля или с каждым тромболитическим ферментом (2 мг/мл) при 37°С в течение 72 часов. Заживление ран определяли путем наблюдения за жидкостью, содержащей кусочки раны, и измерения оптической плотности при 550 нм. В этом эксперименте с раневой тканью in vivo с использованием животных обработка обычным тромболитическим ферментом приводила к продолжающемуся кровотечению из-за прерывания процесса заживления ран, тогда как в группе обработки HtrA1 или HtrA2 происходило нормальное заживление ран (таблица 2).

Таблица 2 Группы ОП₅₅₀ Контроль 0,235±0,031 Стрептокиназа 0,471±0,018^a Урокиназа 0,404±0,037^a HtrA1 0,203±0,028^{a, b} HtrA2 0,247±0,033^{a, b}

a; р<0,05 значимое отличие от контрольной группы.

b; p<0,01, значимое отличие от группы обработки стрептокиназой.

Пример 1: Терапевтическая эффективность для лечения тромбоза

Эксперимент на животных с использованием модели тромбоза в хвосте проводили для оценки эффективности лечения тромбоза тромболитиками по настоящему изобретению. Модель индуцированного κ-каррагенином тромбоза в хвосте была создана на 15-недельных самках мышей BALB/c. Каждой группе мышей (n=8) с тромбозом в хвосте внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (контроль) или каждый тромболитический фермент, и через 24 часа измеряли длину и долю участка тромбоза, и результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3 Группы Доза (мг/кг) Длина хвоста (см) Длина участка тромбоза (см) Коэффициент тромбоза (%) Контроль - 9,21±0,08 9,07±0,11^a 98,50±0,80^a Плазмин 40 9,02±0,07 3,37±0,45^b 37,39±5,10^b Стрептокиназа 40 9,10±0,10 5,11±1,22^a 56,16±13,4^a Урокиназа 40 9,07±0,10 4,27±0,60^a 47,08±6,51^a HtrA1 (10 мг/кг) 10 9,18±0,16 4,72±1,06 51,33±10,9 HtrA1 (20 мг/кг) 20 9,12±0,10 3,41±0,57 37,41±6,43 HtrA1 (40 мг/кг) 40 9,17±0,12 1,61±0,49 17,56±5,47

а; p<0,001 значимое отличие от группы, получавшей HtrA1 (40 мг/кг).

b; p<0,01 значимое отличие от группы, получавшей HtrA1 (40 мг/кг).

Как показано в таблице 3, длина и частота тромбоза в хвостах в группе, получавшей HtrA1, были значительно уменьшенными по сравнению с группами, получавшими обычные тромболитические ферменты, в модели тромбоза в хвосте мыши. Было установлено, что тромболитический эффект возрастал пропорционально дозе. Это подтверждает, что HtrA1 обладает статистически значимым уровнем эффективности лечения тромбоза по сравнению с обычными тромболитическими ферментами.

Таблица 4 Группы Доза (мг/кг) Длина хвоста (см) Длина участка тромбоза (см) Коэффициент тромбоза (%) Контроль - 9,19±0,09 9,03±0,14^a 98,25±1,16^a Плазмин 40 9,03±0,06 3,40±0,41^b 37,65±4,62^b Стрептокиназа 40 9,09±0,09 4,97±1,16^a 54,66±12,7^a tPA 40 9,06±0,08 3,49±0,53^b 38,53±6,06^b HtrA2 (10 мг/кг) 10 9,15±0,12 4,55±1,11 49,62±11,5 HtrA2 (20 мг/кг) 20 9,11±0,11 4,01±0,83 44,01±9,18 HtrA2 (40 мг/кг) 40 9,14±0,08 2,19±0,75 23,93±8,20

а; p<0,001 значимое отличие от группы, получавшей HtrA2 (40 мг/кг).

b; p<0,01 значимое отличие от группы, получавшей HtrA2 (40 мг/кг).

Как показано в Таблице 4, длина и частота тромбоза в хвостах в группе, получавшей HtrA2, также были значительно уменьшенными по сравнению с группами, получавшими обычные тромболитические ферменты, в модели тромбоза в хвосте мыши. Было установлено, что тромболитический эффект возрастал пропорционально дозе. Это подтверждает, что HtrA2 обладает статистически значимым уровнем эффективности лечения тромбоза по сравнению с обычными тромболитическими ферментами.

На фиг. 7, наблюдение за тканью хвоста с тромбозом после окрашивания гематоксилином и эозином выявило тромботическую массу и растворение тромба в образцах из группы, получавшей обычные тромболитические ферменты, тогда как в группах, получавших HtrA1 и HtrA2, тромботическая масса отсутствовала, что подтверждает превосходную тромболитическую эффективность HtrA1 и HtrA2.

Пример 2: Терапевтическая эффективность для лечения тромбоэмболии легочной артерии

Затем проводили эксперимент на животных с использованием модели тромбоэмболии легочной артерии для оценки эффективности предотвращения и лечения тромбоэмболии. Модель тромбоэмболии легочной артерии, индуцированной аденозин-5'-дифосфатом (ADP), была создана на 15-недельных самках мышей C57BL/6. Каждая группа (n=8) мышей с тромбоэмболией легочной артерии голодала в течение 12 часов и дольше, а затем внутривенно вводили физиологический раствор (контроль) или тромболитический фермент в дозе, составляющей 40 мг/кг. Через 30 минут мышам вводили ADP (150 мг/кг) для индукции тромбоэмболии легочной артерии, а затем подтверждали смерть, и результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5 Группы Доза (мг/кг) Число смертей/общее число Степень защиты (%) Контроль - 6/6 0 Плазмин 40 3/6 50 Стрептокиназа 40 4/6 33 Урокиназа 40 2/6 67 HtrA1 40 0/6 100

Из таблицы 5 видно, что в модели тромбоэмболии легочной артерии на мыши коэффициенты выживаемости в группах лечения плазмином, стрептокиназой и урокиназой составляли 50%, 33% и 66%, соответственно, но коэффициент выживаемости в группе лечения HtrA1 составил 100%. Это подтверждает, что HtrA1 в настоящем изобретении обладает прекрасным терапевтическим и профилактическим эффектом на смертельную тромбоэмболию легочной артерии.

Таблица 6 Группы Доза (мг/кг) Число смертей/общее число Степень защиты (%) Контроль - 5/5 0 Плазмин 40 2/5 60 Стрептокиназа 40 4/5 20 tPA 40 3/5 40 HtrA2 40 0/5 100

Из таблицы 6 видно, что в модели тромбоэмболии легочной артерии на мыши коэффициенты выживаемости в группах лечения плазмином, стрептокиназой и tPA составляли 60%, 20% и 40%, соответственно, но коэффициент выживаемости в группе лечения HtrA2 составил 100%. Это также подтверждает, что HtrA2 обладает прекрасным терапевтическим и профилактическим эффектом на тромбоэмболию легочной артерии.

Пример 3: Эффект на устранение риска внутреннего кровотечения

Тест на кровотечение из хвоста был проведен с использованием 15-недельных самок мышей C57BL/6 для определения того, существует ли риск внутреннего кровотечения во время процесса заживления раны при введении тромболитического белка HtrA1. Физиологический раствор (контроль) или каждый тромболитический фермент вводили внутривенно группе мышей (n=5) в дозе, составляющей 40 мг/кг. Через 30 минут на хвост анестезированной мыши наносили резаную рану, и регистрировали время кровотечения и объем крови при сборе крови до остановки кровотечения, а также измеряли содержание гемоглобина в собранной крови. Кроме того, регистрировали время, необходимое для свертывания крови в перерезанной хвостовой вене мыши.

Как показано на фиг. 8, было подтверждено, что кровотечение в случае введения HtrA1 и HtrA2 было значительно меньше, чем кровотечение в случае введения других тромболитических ферментов в эксперименте с кровотечением из хвоста мыши. В случае группы, получавшей HtrA1, измеряли фактическое время кровотечения (фиг. 9а), объем кровотечения (фиг. 9b), количество потерянного гемоглобина (фиг. 9с) и время, необходимое для гемостаза (фиг. 9d). Было подтверждено, что побочный эффект в виде кровотечения был уменьшен до уровня, схожего с таковым в контрольной группе, несравнимо отличаясь от таковых в случае обычных тромболитических ферментов.

В случае группы, получавшей HtrA2, измеряли время кровотечения (фиг. 10а), объем кровотечения (фиг. 10b), количество потерянного гемоглобина (фиг. 10с) и время, необходимое для гемостаза (фиг. 10d). Было подтверждено, что побочные эффекты в виде кровотечений были уменьшены до уровня как в контрольной группе, несравнимо отличаясь от таковых в случае обычных тромболитических ферментов. HtrA1 и HtrA2 не мешают процессу гемостаза, который является частью процесса заживления ран, и, соответственно, полностью снижают риск кровотечения.

Возможность коммерческого применения

В соответствии с настоящим изобретением полипептид для растворения тромба путем распознавания «внутрисосудистого тромба» растворяет тромб в крови млекопитающего без серьезных побочных эффектов в виде кровотечений и оказывает профилактический и терапевтический эффект на тромбоз, таким образом предотвращая тромбоз и связанные с ним заболевания, или он может широко использоваться в качестве терапевтического средства.

--->

<110> JINIS CO., LTD.

<120> Тромболитики для внутрисосудистых тромбов

<130> OPP20020-PCT

<150> KR 2019-0131585

<151> 2019-10-22

<160> 14

<170> Корейский патент в версии 3.0

<210> 1

<211> 161

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность тромболитического

домена HtrA1 (as1 HtrA1)

<400> 1

Gly Ser Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala

1 5 10 15

His Val Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly

20 25 30

Ala Thr Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile

35 40 45

Ala Leu Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu

50 55 60

Gly Arg Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly

65 70 75 80

Ser Pro Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr

85 90 95

Thr Gln Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp

100 105 110

Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro

115 120 125

Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val

130 135 140

Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe

145 150 155 160

Leu

<210> 2

<211> 177

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность тромболитического

домена HtrA2 (as1 HtrA2)

<400> 2

Ile Leu Asp Arg His Pro Phe Leu Gly Arg Glu Val Pro Ile Ser Asn

1 5 10 15

Gly Ser Gly Phe Val Val Ala Ala Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala

20 25 30

His Val Val Ala Asp Arg Arg Arg Val Arg Val Arg Leu Leu Ser Gly

35 40 45

Asp Thr Tyr Glu Ala Val Val Thr Ala Val Asp Pro Val Ala Asp Ile

50 55 60

Ala Thr Leu Arg Ile Gln Thr Lys Glu Pro Leu Pro Thr Leu Pro Leu

65 70 75 80

Gly Arg Ser Ala Asp Val Arg Gln Gly Glu Phe Val Val Ala Met Gly

85 90 95

Ser Pro Phe Ala Leu Gln Asn Thr Ile Thr Ser Gly Ile Val Ser Ser

100 105 110

Ala Gln Arg Pro Ala Arg Asp Leu Gly Leu Pro Gln Thr Asn Val Glu

115 120 125

Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asp Phe Gly Asn Ser Gly Gly Pro

130 135 140

Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Val Asn Thr Met Lys Val

145 150 155 160

Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Arg Leu Arg Glu Phe

165 170 175

Leu

<210> 3

<211> 103

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность распознающего тромб

домена HtrA1 (as2 HtrA1)

<400> 3

Thr Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys

1 5 10 15

Lys Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys

20 25 30

Glu Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala

35 40 45

Tyr Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu

50 55 60

Lys Glu Asn Asp Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser

65 70 75 80

Ala Asn Asp Val Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met

85 90 95

Val Val Arg Arg Gly Asn Glu

100

<210> 4

<211> 82

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность распознающего тромб

домена HtrA2 (as2 HtrA2)

<400> 4

Val Met Met Leu Thr Leu Ser Pro Ser Ile Leu Ala Glu Leu Gln Leu

1 5 10 15

Arg Glu Pro Ser Phe Pro Asp Val Gln His Gly Val Leu Ile His Lys

20 25 30

Val Ile Leu Gly Ser Pro Ala His Arg Ala Gly Leu Arg Pro Gly Asp

35 40 45

Val Ile Leu Ala Ile Gly Glu Gln Met Val Gln Asn Ala Glu Asp Val

50 55 60

Tyr Glu Ala Val Arg Thr Gln Ser Gln Leu Ala Val Gln Ile Arg Arg

65 70 75 80

Gly Arg

<210> 5

<211> 483

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность оснований тромболитического

домена HtrA1 (bs1 HtrA1)

<400> 5

gggtctgggt ttattgtgtc ggaagatgga ctgatcgtga caaatgccca cgtggtgacc 60

aacaagcacc gggtcaaagt tgagctgaag aacggtgcca cttacgaagc caaaatcaag 120

gatgtggatg agaaagcaga catcgcactc atcaaaattg accaccaggg caagctgcct 180

gtcctgctgc ttggccgctc ctcagagctg cggccgggag agttcgtggt cgccatcgga 240

agcccgtttt cccttcaaaa cacagtcacc accgggatcg tgagcaccac ccagcgaggc 300

ggcaaagagc tggggctccg caactcagac atggactaca tccagaccga cgccatcatc 360

aactatggaa actcgggagg cccgttagta aacctggacg gtgaagtgat tggaattaac 420

actttgaaag tgacagctgg aatctccttt gcaatcccat ctgataagat taaaaagttc 480

ctc 483

<210> 6

<211> 531

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность оснований тромболитического

домена HtrA2 (bs1 HtrA2)

<400> 6

atcctggacc ggcacccttt cttgggccgc gaggtcccta tctcgaacgg ctcaggattc 60

gtggtggctg ccgatgggct cattgtcacc aacgcccatg tggtggctga tcggcgcaga 120

gtccgtgtga gactgctaag cggcgacacg tatgaggccg tggtcacagc tgtggatccc 180

gtggcagaca tcgcaacgct gaggattcag actaaggagc ctctccccac gctgcctctg 240

ggacgctcag ctgatgtccg gcaaggggag tttgttgttg ccatgggaag tccctttgca 300

ctgcagaaca cgatcacatc cggcattgtt agctctgctc agcgtccagc cagagacctg 360

ggactccccc aaaccaatgt ggaatacatt caaactgatg cagctattga ttttggaaac 420

tctggaggtc ccctggttaa cctggatggg gaggtgattg gagtgaacac catgaaggtc 480

acagctggaa tctcctttgc catcccttct gatcgtcttc gagagtttct g 531

<210> 7

<211> 309

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность оснований распознающего тромб

домена HtrA1 (bs2 HtrA1)

<400> 7

acggagtccc atgaccgaca ggccaaagga aaagccatca ccaagaagaa gtatattggt 60

atccgaatga tgtcactcac gtccagcaaa gccaaagagc tgaaggaccg gcaccgggac 120

ttcccagacg tgatctcagg agcgtatata attgaagtaa ttcctgatac cccagcagaa 180

gctggtggtc tcaaggaaaa cgacgtcata atcagcatca atggacagtc cgtggtctcc 240

gccaatgatg tcagcgacgt cattaaaagg gaaagcaccc tgaacatggt ggtccgcagg 300

ggtaatgaa 309

<210> 8

<211> 246

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность оснований распознающего тромб

домена HtrA2 (bs2 HtrA2)

<400> 8

gtgatgatgc tgaccctgag tcccagcatc cttgctgaac tacagcttcg agaaccaagc 60

tttcccgatg ttcagcatgg tgtactcatc cataaagtca tcctgggctc ccctgcacac 120

cgggctggtc tgcggcctgg tgatgtgatt ttggccattg gggagcagat ggtacaaaat 180

gctgaagatg tttatgaagc tgttcgaacc caatcccagt tggcagtgca gatccggcgg 240

ggacga 246

<210> 9

<211> 480

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность HtrA1 (HtrA1)

<400> 9

Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro

20 25 30

Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro

35 40 45

Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys

50 55 60

Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu

65 70 75 80

Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro

85 90 95

Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys

100 105 110

Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn

115 120 125

Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg

130 135 140

Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu

145 150 155 160

Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val

165 170 175

Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu

180 185 190

Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile

195 200 205

Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn

210 215 220

Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala

225 230 235 240

Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile

245 250 255

Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu

260 265 270

Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu

275 280 285

Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly

290 295 300

Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp

305 310 315 320

Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp

325 330 335

Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser

340 345 350

Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His

355 360 365

Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly

370 375 380

Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp

385 390 395 400

Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu

405 410 415

Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp

420 425 430

Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val

435 440 445

Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg

450 455 460

Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro

465 470 475 480

<210> 10

<211> 458

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность HtrA2 (HtrA2)

<400> 10

Met Ala Ala Pro Arg Ala Gly Arg Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Ala

1 5 10 15

Trp Arg Ala Leu Gly Gly Ile Arg Trp Gly Arg Arg Pro Arg Leu Thr

20 25 30

Pro Asp Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ser Gly Thr Ser Asp Pro Arg Ala

35 40 45

Arg Val Thr Tyr Gly Thr Pro Ser Leu Trp Ala Arg Leu Ser Val Gly

50 55 60

Val Thr Glu Pro Arg Ala Cys Leu Thr Ser Gly Thr Pro Gly Pro Arg

65 70 75 80

Ala Gln Leu Thr Ala Val Thr Pro Asp Thr Arg Thr Arg Glu Ala Ser

85 90 95

Glu Asn Ser Gly Thr Arg Ser Arg Ala Trp Leu Ala Val Ala Leu Gly

100 105 110

Ala Gly Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Trp Gly Gly Gly Arg Gly Pro

115 120 125

Pro Ala Val Leu Ala Ala Val Pro Ser Pro Pro Pro Ala Ser Pro Arg

130 135 140

Ser Gln Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val Glu Lys Thr Ala Pro Ala

145 150 155 160

Val Val Tyr Ile Glu Ile Leu Asp Arg His Pro Phe Leu Gly Arg Glu

165 170 175

Val Pro Ile Ser Asn Gly Ser Gly Phe Val Val Ala Ala Asp Gly Leu

180 185 190

Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Ala Asp Arg Arg Arg Val Arg Val

195 200 205

Arg Leu Leu Ser Gly Asp Thr Tyr Glu Ala Val Val Thr Ala Val Asp

210 215 220

Pro Val Ala Asp Ile Ala Thr Leu Arg Ile Gln Thr Lys Glu Pro Leu

225 230 235 240

Pro Thr Leu Pro Leu Gly Arg Ser Ala Asp Val Arg Gln Gly Glu Phe

245 250 255

Val Val Ala Met Gly Ser Pro Phe Ala Leu Gln Asn Thr Ile Thr Ser

260 265 270

Gly Ile Val Ser Ser Ala Gln Arg Pro Ala Arg Asp Leu Gly Leu Pro

275 280 285

Gln Thr Asn Val Glu Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asp Phe Gly

290 295 300

Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Val

305 310 315 320

Asn Thr Met Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp

325 330 335

Arg Leu Arg Glu Phe Leu His Arg Gly Glu Lys Lys Asn Ser Ser Ser

340 345 350

Gly Ile Ser Gly Ser Gln Arg Arg Tyr Ile Gly Val Met Met Leu Thr

355 360 365

Leu Ser Pro Ser Ile Leu Ala Glu Leu Gln Leu Arg Glu Pro Ser Phe

370 375 380

Pro Asp Val Gln His Gly Val Leu Ile His Lys Val Ile Leu Gly Ser

385 390 395 400

Pro Ala His Arg Ala Gly Leu Arg Pro Gly Asp Val Ile Leu Ala Ile

405 410 415

Gly Glu Gln Met Val Gln Asn Ala Glu Asp Val Tyr Glu Ala Val Arg

420 425 430

Thr Gln Ser Gln Leu Ala Val Gln Ile Arg Arg Gly Arg Glu Thr Leu

435 440 445

Thr Leu Tyr Val Thr Pro Glu Val Thr Glu

450 455

<210> 11

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для HtrA1

<400> 11

aattcatatg caagggcagg aagatccca 29

<210> 12

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для HtrA1

<400> 12

tatctcgagc tatgggtcaa tttcttcggg 30

<210> 13

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер для HtrA2

<400> 13

gtcctcgccc atatggccgt ccctagcc 28

<210> 14

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер для HtrA2

<400> 14

ggctctcgag tcattctgtg acctcaggg 29

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидным тромболитикам, и может быть использовано в медицине в лечении тромбозов. Предложено применение полипептида с SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 в качестве средства, которое распознает внутрисосудистый тромб и растворяет внутрисосудистый тромб. Изобретение обеспечивает растворение тромба в крови млекопитающего без серьезных побочных эффектов в виде кровотечений, тем самым обладая профилактической и терапевтической эффективностью против тромбоза. 10 ил., 6 табл., 3 пр.

Применение полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, в качестве средства, которое распознает внутрисосудистый тромб и растворяет внутрисосудистый тромб.