СПОСОБ ЭКСПРЕСС - ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕТИЧЕСКИХ НЕЙРОИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/536 

Изобретение относится к медицине, в частности, к диагностике герпетических поражений центральной нервной системы у детей.

Известен ряд тестов диагностики герметических инфекций, основанных на обнаружении противогерпетических антител: радиоиммунный, твердофазный, иммуноферментный и другие тесты. С помощью этих методов в последние годы удается легко ставить диагноз герпетической инфекции в ранние сроки заболевания по наличию у ребенка антител класса IgM в крови и ликворе. Значительно в меньшей степени используется система экспресс-диагностики указанными тестами герметического антигена в пробах крови и ликворе.

Недостатком всех указанных методов является невозможность в одной системе одновременно оценить уровень антигена, антител, циркулирующего иммунного комплекса. В лабораторной практике в настоящее время отсутствует тест-система, позволяющая проводить подобный анализ.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ диагностики герпетической инфекции ЦНС с предполагаемым герпетическим энцефалитом, основанный на выявлении в крови и ликворе антител в реакции иммуноблотинга к специально очищенному белку gB вируса герпеса (Kahlon J, Chaffcrjee S. Lakeman et al. Dctioction of antibodjes to herpes simplex virus the ceribcospinal fluid of patiens with HVE. J. Infect. Dis., 1987, 155, 1, p. 38-44).

Авторы определяли у больных с энцефалитом антитела к белку gB вируса герпеса в 95% обследованных биопсий. В то же время при других методах выявления антител к герпесу /4-х кратный прирост комплемент-связывающих антител и другие/ в первые 8 дней заболевания диагностика герпетического энцефалита была в меньшем проценте случаев /от 50 до 64%/. Более того необходимо отметить, что в острой фазе герметической инфекции ЦНС часто происходит задержка в выработке антител и образовании иммунного комплекса, так что поставить этиологический диагноз без выявления герметического антигена в ликоворе практически невозможно. Если же инфекционный процесс в ЦНС протекает в умеренной степени, то первично вырабатывающиеся антитела вступают в иммунный комплекс с вирусным антигеном в пределах ЦНС и выявить в этих условиях антиген или антитела становится достаточно трудно.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для установления этиологии, тяжести и характера герпетической инфекции нервной системы у больного в крови и ликворе определяют концентрацию герметического антигена, противогерпетических антител, общего иммунного комплекса в крови и ликворе в унитарной системе жидкостного иммуно-ферментного теста. Предложенный авторами способа экспресс-диагностики может помочь в устранении недостатков способа, описанного в прототипе. Устраняется также один из главных недостатков базового способа - необходимость использования для проведения реакции выявления антител специально очищенного белка gB вируса герпеса простого.

В предлагаемом способе возможно использование различных жидкостных иммуноферментных тестов, основанных однако на одновременном совместном выявлении герпетического антигена, противогерпетических антител и образованного иммунного комплекса. Может быть две разновидности таких жидкостных иммуноферментных методов, дающих возможность определения этих факторов у больного - иммуноферментный метод, основанный на использовании фермент-меченых антиглобулинов или с помощью ферментного определения комплемента, участвующего в выявлении антигена, антител и иммунного комплекса. Другие разновидности более сложны и нуждаются в использовании сложных многокомпонентных препаратов-диагностикумов.

Целью предлагаемого изобретения является установление диагноза герпетической инфекции ЦНС, а также оценка тяжести и периода ее течения. Поставленная цель достигается тем, что путем сочетания вносимых в реакцию ингредиентов - стандартного герпетического антигена, экспериментальной противогерпетической гипериммунной сыворотки и точно титрованного количества комплемента в ликовре и крови больных определяют одномоментно герпетический антиген, специфические антитела и иммунный комплекс. Основные принципы метода - иммуноферментное определение концентрации комплемента при определении всех указанных факторов и жидкостная система постановки иммуноферментной реакции. С помощью такого принципа создается возможность идентификации указанных факторов и унификации конечного показателя при выполнении способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Цельный ликвор больного и его сыворотка крови в разведении 1:10 соединяют в равных объемах альтернативно со стандартным герпетическим антигеном или противогерпетической иммунной сывороткой /10-20 вируснейтрализующих доз/. Далее в приготовленные смеси добавляют 1-2 гемолитических дозы экзогенного комплемента /сыворотки морской свинки/, разведенного до удвоенного объема смеси, полученной до внесения. Полученные растворы выдерживают в термостате при 37^oC в течение 60-90 мин и затем определяют в ферментной реакции уровень свободного комплемента в пробах.

Методически при постановке способа в индикацию включаются следующие пробы.

1. Цельный ликвор и стандартный герпетический антиген - реакция для определения противогерпетических антител в ликворе.

2. Цельный ликвор и гипериммунная противогерпетическая сыворотка - реакция для определения герпетического антигена в ликворе.

3. Цельный ликвор + плацебо /мединалово-вероналовый буфер/ - реакция для определения иммунного комплекса в ликворе.

4. Сыворотка больного /1:10/ и стандартный герпетический антиген - реакция для определения антител в крови больного.

5. Сыворотка больного /1:10/ и гипериммунная противогерпетическая сыворотка - реакция для определения герпетического антигена в крови больного.

6. Сыворотка больного /1:10/ + плацебо /мединалово-вероналовый буфер/ - реакция для определения иммунного комплекса в крови больных.

Во все пробы с 1 по 6-ю вносятся 1-2 дозы стандартного комплемента. Контролем для вносимой дозы комплемента служит проба 7 - комплемент + плацебо /мединалово-вероналовый буфер/.

После проведения реакции свободный неадсорбированный комплемент определяют во всех семи пробах в любом из современных количественных тестов, желательно с использованием иммуноферментного анализа. Заявители использовали для этого ферментное выявление комплемента косвенно по активности каталазы бараньих эритроцитов после дополнительного внесения в пробы гемолитической системы, состоящей из 1,0% бараньих эритроцитов и соответствующей гемолитической сыворотки /5-10 гемолитических доз/. После добавления этой системы и проведении реакции при 24-26^oC до появления первых следов гемолиза в пробах N 7 в пробы добавлялась смесь 3,0% перекиси водорода и 0,2% раствора ортофенилендиамина. Пробы выдерживались в течение 10 мин после появления оранжевого окрашивания, реакция останавливалась 0,9N H₂SO₄ и измерялась концентрация каталазы эритроцитов спектрофотометрически на иммуноферментном анализаторе формы Abbott (492 нм). Активность обнаруженной каталазы линейно соответствовала уровню свободного, несорбированного на иммунные комплексы в пробах комплемента.

Величину свободного комплемента можно определять и в других иммуноферментных реакциях (например, по сорбции его на антитела к фракции C₁ комплемента, сорбированные на твердой матрице).

После определения активности свободного комплемента оцениваются результаты по следующим параметрам: снижение активности комплемента в пробах 1 и 4 означает наличие в крови или ликворе больного соответственно антител к вирусу герпеса, аналогичное уменьшение уровня комплемента в пробах 2 и 5 означает наличие антигена в ликворе или крови больных. Уменьшение комплемента в пробе 3 соответствует количеству имеющегося в ликоворе иммунного комплекса, а в пробе 6 - аналогичный показатель, отражающий наличие иммунного комплекса в крови. Дополнительно после установления содержания иммунных комплексов в ликворе в пробах 3 и 6 после установления снижения свободного комплемента, т. е. наличия иммунных комплексов, их специфичность, а именно наличие в этом иммунном комплексе герпетического антигена, добавляют на 30-35 мин гипериммунную противогерпетическую сыворотку /10-20 нейтрализующих доз/ и определяют специфичность иммунного комплекса по увеличению уровня комплемента по сравнению с исходной пробой 3 и 6, а также пробой 7.

С помощью всех указанных разновидностей реакций в данном способе удается определить у больного одновременно в ликворе и крови специфический герметический антиген /1-го или 2-го серотипа/, противогерпетические антитела, а также в этих пробах общий иммунный и специфический иммунный комплекс. Определение антигена основано на том, что вносимые противогерпетические антитела в виде противогерпетической гипериммунной сыворотки образуют с эндогенными герпетическим антигеном в крови или ликворе специфический иммунный комплекс "ин витро", сорбирующий на себе внесенный в реакцию комплемент. Обратным образом выявление противогерпетических эндогенных антител у больного основано на определении сорбции комплемента на образующийся "ин витро" иммунный комплекс антител больного и вносимого антигена вируса простого герпеса 1-го или 2-го серотипа.

Иммунный комплекс общего характера выявляется по простой сорбции вносимого комплемента в ликвор или сыворотку крови больного. Необходимо отметить, что при герпетической инфекции ЦНС в ликворе и особенно в крови величина этого иммунного комплекса практически соответствует количеству специфического иммунного комплекса /антиген герпеса + антитело/, циркулирующего в организме больного эндогенно. Однако для доказательства его специфичности нами включена в исследование разновидность метода его определения с дополнительным внесением гипериммунной специфической противогерпетической сыворотки. Основана эта разновидность на том, что при минимальном времени контакта /30-35 мин/ гипериммунные антитела вытесняют антиген из эндогенного иммунного комплекса и этот процесс сопровождается десорбцией с иммунного комплекса компонентов комплемента, которые увеличивают величину гемолитического комплемента и, следовательно, выхода каталазной активности изэритроцитов.

Для количественной характеристики полученных показателей можно использовать непосредственные показатели, полученные на иммуноферментном анализаторе, либо оценивать по уровню снятия активности от уровня пробы 7 /в процентах/.

Пример 1. Больной Яккола, 5 лет. Поступил в клинику НИИ детских инфекций с диагнозом "Вирусный энцефалит, корково-подкорковая форма". Состояние средней тяжести, судорожный синдром, сопор, гемипарез. При диагностике на герпетическую инфекцию заявляемым способом установлено:
Вирусологический диагноз: Герпетический менингоэнцефалит, конец острой фазы заболевания /вариант 2-3, см. далее/.

Исход заболевания: Больной получал гормоны, виролекс, дегидрационную и дезинтоксикационную терапию. Выздоровление в удовлетворительном состоянии с минимальными неврологическими остаточными явлениями.

Совершенно другие показатели выявляются в случае поражений ЦНС с тяжелым течением и неблагоприятным прогнозом.

Пример 2. Больная Семенова, 2 года 3 мес. Поступила в клинику НИИ детских инфекций с диагнозом "Тяжелый вирусный менингоэнцефалит", "Судорожный коматозный синдром. Отек и набухание головного мозга с дислокацией".

При диагностике на герпетическую инфекцию заявляемым способом установлено:
Вирусологический диагноз: Герпетический менингоэнцефалит. Первично острая форма инфекции. Прогноз плохой /вариант 1, см. далее/.

Исход заболевания: Больная, несмотря на проводимое лечение, включая и специфическую терапию виролексом, погибла на 5-ый день от поступления в клинику в связи с отеком мозга и его дислокацией.

Использование предлагаемого способа позволяет не только точно поставить диагноз герпетической инфекции, но и, предположительно, установить фазу инфекционного процесса и прогноз заболевания. Возможно вычленить 4 варианта течения и прогноза заболевания.

Вариант 1. У больного высокий уровень антигена в ликворе /более 60%/, при низкой концентрации антител в ликворе /менее 20%/. В данном случае - это первичная острейшая форма герпетической инфекции. При отсутствии в ликворе иммунных комплексов - раннее начало, при наличии иммунных комплексов /в пределах 50-60%/ - 5-6 дней от начала инфекции. В первом варианте, даже при наличии иммунных комплексов, но при отсутствии в пределах ЦНС антител - прогноз плохой.

Вариант 2. У больного умеренная концентрация антигена в ликворе или крови /от 20 до 60%/, наличии иммунного комплекса /более 50%/, но при отсутствии или минимальном содержании антител в ликворе /до 20%/. В данном случае у больного конец острого периода активации герпетической инфекции. Прогноз при наличии иммунного комплекса - средний.

Вариант 3. У больного антиген в ликворе минимален /до 20%/ или полностью отсутствует, но в ЦНС определяются антитела к вирусу герпеса /более 50%/ - это либо легкая форма герпетической инфекции, либо период ранней реконвалесценции.

Вариант 4. Значительная концентрация у больного антител в ликворе /более 65%/, отсутствует антиген и умеренная концентрация иммунного комплекса - это практически исход инфекционного процесса.

При вариантах 3 и 4 прогноз благоприятный, особенно если антитела обнаруживаются также и в крови.

Необходимо отметить, что при 1-м варианте в достаточном проценте у больного выявляются такие осложнения, как гепатит /размножение вируса герпеса в печени/, а также аллергические осложнения.

Таким образом представленный способ позволяет не только поставить диагноз герпетической инфекции, но и по лабораторным данным установить фазу заболевания и дать предположительный прогноз исхода инфекционного процесса.

Преимуществами данного способа является его высокая чувствительность так как этап реакции проходит фазу иммуноферментного определения исследуемых факторов, унификация цифровых показателей результатов, выявление в однотипной реакции нескольких параметров - антигена, антител, иммунного комплекса. Кроме того, необходимо отметить, что постановка данного способа по его этапам физиологична, чем твердофазные иммуноферментные способы, где при проведении реакции трудно учесть ряд сторон патогенеза инфекционного герпетического процесса. К таковым сторонам относятся - наличие иммунного комплекса и влияние на него собственного или дополнительного внесенного комплемента, одновременное присутствие в крови и ликворе герпетического вируса и его антигенов и свободных противовирусных антител, а также роль в образовании иммунного комплекса растворимых сывороточных факторов. Все эти стороны могут быть установлены при выполнении реакций данным способом и внимательной оценке получаемых цифровых показателей.

Способ включает индикацию герпетического антигена, противогерпетических антител и уровня иммунного комплекса в цельном ликворе и сыворотке крови ребенка. Цельный ликвор и сыворотку крови, взятую в разведении 1:10, соединяют при равных объемных соотношениях со стандартным герпетическим антигеном или противогерпетической иммунной сывороткой или плацебо. Добавляют к полученным смесям по 1-2 гемолитические дозы сыворотки морской свинки в качестве экзогенного комплемента, взятии в удвоенном объеме относительно объема указанных смесей. Полученные растворы выдерживают. Затем с использованием иммуноферментного анализа определяют в пробе, содержащей цельный ликвор и стандартный герпетический антиген, а также в пробе. содержащей сыворотку крови и стандартный герпетический антиген. уровень противогерпетических антител. Определяют в пробе, содержащей цельный ликвор и противогерпетическую иммунную сыворотку, а также в пробе, содержащей сыворотку криви и противогерпетическую иммунную сыворотку, уровень герпетического антигена. Определяют в пробе, содержащей цельный ликвор и плацебо, а также в пробе, содержащей сыворотку крови и плацебо, уровень иммунного комплекса. И при уровне герпетического антигена (АГ) в ликворе более 60% относительно контроля, а уровне противогерпетических антител (AТ) 20% диагностируют острую форму герпетической нейроинфекции. При этом при отсутствии в ликворе иммунного комплекса (ИК) - начало, а при уровне ИК в ликворе 50-60%- 5-6 дней от начала заболевания. При уровне АГ в ликворе или сыворотке крови от 20 до 60%. уровне ИК в ликворе более 50% и уровне AT в ликворе до 20% диагностируют окончание острого периода активации герпетической нейроинфекции. При уровне АГ в ликворе до 20% и уровне AT в ликворе более 50% диагностируют легкую форму герпетической нейроинфекции или период ранней реконваленции. При уровне AT в ликворе более 60% и отсутствии АГ диагностируют исход инфекционного процесса. Способ позволяет поставить диагноз заболевания и по лабораторным данным установить фазу заболевания. 2 табл.

Способ экспресс-диагностики герпетической нейроинфекции у детей, включающий индикацию герпетического антигена и противогерпетических антител в цельном ликворе и сыворотке крови ребенка, отличающийся тем, что дополнительно определяют в цельном ликворе и сыворотке крови ребенка уровень иммунного комплекса, при этом цельный ликвор и сыворотку крови, взятую в разведении 1: 10, соединяют при равных объемных соотношениях со стандартным герпетическим антигеном или противогерпетической иммунной сывороткой или плацебо, добавляют к полученным смесям по 1-2 гемолитические дозы сыворотки морской свинки в качестве экзогенного комплемента, взятой в удвоенном объеме относительно объема указанных смесей, полученные растворы выдерживают и затем с использованием иммуноферментного анализа определяют в пробе, содержащей цельный ликвор и стандартный герпетический антиген, а также в пробе, содержащей сыворотку крови и стандартный герпетический антиген, уровень противогерпетических антител, определяют в пробе, содержащей цельный ликвор и противогерпетическую иммунную сыворотку, а также в пробе, содержащей сыворотку крови и противогерпетическую иммунную сыворотку, уровень герпетического антигена, и определяют в пробе, содержащей цельный ликвор и плацебо, а также в пробе, содержащей сыворотку крови и плацебо, уровень иммунного комплекса, далее оценивают уровни перечисленных показателей относительно контроля и при уровне герпетического антигена (АГ) в ликворе более 60% относительно контроля, а уровне противогерпетических антител (АТ) 20% диагностируют острую форму герпетической нейроинфекции, при этом при отсутствии в ликворе иммунного комплекса (ИК) - начало, а при уровне ИК в ликворе 50-60%- 5-6 дней от начала заболевания, при уровне АГ в ликворе или сыворотке крови от 20 до 60%, уровне ИК в ликворе более 50% и уровне АТ в ликворе до 20% диагностируют окончание острого периода активации герпетической нейроинфекции, при уровне АГ в ликворе до 20% и уровне АТ в ликворе более 50% диагностируют легкую форму герпетической нейроинфекции или период ранней реконваленции, а при уровне АТ в ликворе более 60% и отсутствии АГ диагностируют исход инфекционного процесса.