СПОСОБ ПОДДЕРЖАНИЯ И КОРРЕКЦИИ ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО БАЛАНСА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2008 года по МПК A61D99/00 

Изобретение относится к биотехнологии, исследовательской ветеринарии и может быть использовано для различных целей при последующем получении ветеринарных и иных препаратов.

Известно, что аргинин-вазотоцин (АВТ) представляет собой один из наиболее рано возникших в эволюции гормонов семейства вазопрессина - окситоцина, секретирующийся из нейрогипофиза у всех позвоночных и являющийся (исключая млекопитающих) основным гормоном осмотической регуляции внутренней среды организма [13. Jackson Е.К. //. In: J.G.Hardman, A. Goodman Oilman, L.Е.Limbird (ed.) The pharmacological basis of therapeutics, 9th ed. NY.: McGraw Hill. 1995. P.715-731].

У млекопитающих ведущая роль в осморегуляции принадлежит аргинин-вазопрессину (АВП). В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о действии аргинин-вазотоцина и аргинин-вазопрессина у млекопитающих через общие рецепторы V1a. V1b, V2, активизирующие систему G-белков. Эти результаты свидетельствуют о тесном взаимодействии двух низкомолекулярных гормонов на молекулярном уровне в клетке-мишени, в том числе в полярной эпителиальной клетке, экспрессирующей ионные каналы и обменники [Bernard К, Bogliolo S, Ehrenfeld J. // Вт J Pharmacol. 2005. v.144(8). P.1037-50].

Исследования механизма действия вазотоцина на асимметричные эпителиальные клетки почечных канальцев и кишечника у амфибий, рыб и птиц показали, что АВТ может участвовать в открытии натриевых каналов апикальной мембраны, усиливая чрезклеточный натриевый транспорт. В культуре основных эпителиальных клеток собирательных трубок кортикального слоя почки мыши выявлены рецепторы АДГ/АВТ, активирующие Na-транспортер в присутствии PI₃-киназы.

Увеличение внутриклеточной концентрации кальция в клетках мочевого пузыря лягушки свидетельствовало об участии этого вторичного посредника в вазотоцин-индуцированном транспорте воды [Горшков А.Н., Королев Е.В., Комисарчук Я.Ю. II Цитология. 2000. т.42 (12). C.I 113-24].

Из уровня техники известен способ поддержания и коррекции вводно-электролитного баланса у млекопитающих (крыс) при введении АВТ, который как было установлено способен увеличивать реабсорбцию воды и осмотическое концентрированно мочи подобно вазопрессину, а при более высокой концентрации оказывает выраженное натрийуретическое действие [Гао Цзе, Наточин Ю.В. II Журн. эвол. биохим. и физиол. 2004. 40 (2). С.168-172].

Недостатком известного способа является то, что он не применялся для приматов и особенности антидиуретического и ион-регулирующего действия вазотоцина, их связь с направленными модификациями в структуре молекулы АВТ у приматов не исследовались.

Авторы настоящего изобретения впервые провели научные исследования, не имеющие прямых аналогов, которые позволили для приматов определить необходимые условия способа получения антидиуретического эффекта - препараты, дозировки и условия введения, позволяющие решить данную задачу.

Итак, задачей настоящего изобретения является разработка способа поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих (исключая человека), позволяющего увеличить реабсорбцию осмотически свободной воды при сохранении баланса калия и натрия и не вызывающего изменений деятельности сердечно-сосудистой системы.

Техническим результатом данного изобретения является реализация заявленного назначения, поскольку такая задача решена впервые.

Результат достигается за счет того, что согласно изобретению животным непосредственно после водной нагрузки инъецируют внутримышечно синтетический аналог аргинин-вазотоцина - D-аргинин-вазотоцин (D-ABT) или 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-ABT) или 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-ABT) в дозе не менее 0,5 мкг на 1 кг массы тела животного. При проведении исследовании регистрировали артериальное давление и частоту сердечных сокращений.

Следует подчеркнуть, что только вся совокупность существенных признаков в целом позволяет реализовать заявленное назначение, что и будет показано на приведенных ниже примерах конкретной реализации. В том числе и использование именно заявленных количественных параметров позволяет стабильно достичь указанного антидиуретического эффекта.

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Объектом явились ненаркотизированные обезьяны самцы Масаса mulatta в возрасте 3-4 года, с массой тела 4-6 кг. Животных помещали в приматологические кресла, не ограничивая прием воды и пищи. За несколько дней до тестирования вазотоцина животным проводили исследование антидиуретической реакции в условиях подавления эндогенной секреции вазопрессина, при водной нагрузке (30 мл воды на кг массы тела).

АВТ инъецировали внутримышечно в дозе 0,5 мкг на кг массы тела сразу после водной нагрузки (3% ВН).

Для достоверного подтверждения способ повторяли, но не чаще, чем один раз в 4 дня, чтобы избежать последствий изменения фонового уровня водно-солевого обмена у животных. После введения водной нагрузки (3% ВН) время выделения фракции мочи регистрировали при спонтанном мочеотделении, измеряли ее объем, концентрацию креатинина, ионов Na+, К+, осмоляльность. Пробы венозной крови отбирались венепункцией локтевой вены до начала и через 4 часа после введения ВН.

В образцах сыворотки крови и мочи, полученных от животных, измерялись: концентрация креатинина - по реакции Яффе с использованием наборов реагентов фирмы «Витал диагностик» (Россия) на анализаторе «Clima 15» (Ral, Испания); концентрация электролитов - ионоселективными электродами на анализаторе Easy LyteQS («Medica», США), осмоляльность - гигроскопическим методом на анализаторе «Varpo™» (Wescor, США).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием t-критерия Стьюдента по программе ANOVA.

Достижение результата было подтверждено результатами исследования.

Введение воды в желудок животных вызывало увеличение мочеотделения. Максимум диуреза у обезьян в ответ на 3% ВН наблюдался в период 60-120 мин после введения воды. Функционально это было обусловлено изменением осмотической проницаемости собирательных трубок, в результате у животных снижалась реабсорбция осмотически свободной воды и увеличивалась ее экскреция. За 4 часа выводилось в среднем 87±17% введенной животному жидкости.

Внутримышечное введение вазотоцина (АВТ) в дозе 0,05 нмоль на 100 г массы тела не приводило к достоверному изменению доли выведения нагрузки (за 4 часа у обезьян экскретировалось 54,6±16,3% от введенного объема воды), что указывает на то, что сам АВТ обладает слабым антидиуретическим эффектом.

Пример 2.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его синтетический аналог D-аргинин-вазотоцин (D-ABT). Синтез всех упомянутых аналогов АВТ был проведен ЗАО «Синтез пептидов» [Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Азъмуко А.А., и др. II Биоорг.хим. 2004. т.30 (2). С.115-125], использовали вазотоцин фирмы Sigma, десмопрессин - фирмы Ferring (Германия).

Пример 3.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его синтетический аналог 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-ABT).

Пример 4.

Условия проведения способа соответствовали Примеру 1, но вместо АВТ применяли его другой синтетический аналог 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-ABT).

Инъекция аналогов вазотоцина в той же дозировке, что и АВТ, показала, что препараты 1-d-ABT (Пример 3) и 1-d-D-ABT (Пример 4) задерживали выведение водной нагрузки значительно эффективнее и АВТ, и аналога АДГ - десмопрессина. Так, за 4 часа после инъекции аналога 1-d-ABT выводилось, в среднем, только 7,8±3% введенной животному жидкости, а за 8 часов - всего лишь четверть всего объема. За 4 часа после инъекции аналога 1-d-D-ABT не отделялось ни одной порции мочи, а за 8 часов экскретировалось примерно 25% введенного объема.

Пример 5 (сравнительный). Условия способа аналогичны Примеру 1. Препаратом сравнения служил десмопрессин, синтетический аналог вазопрессина (АДГ), вводимый внутримышечно в дозе 0,6 мкг, физиологические эффекты которого известны [Григорьев А.И., Ларина И.М., Доброхотов И.В. и др. II Физиол. чел. 2005. 31 (5). С.1-7]. В частности, известно, что десмопрессин способен оказывать специфический антидиуретический эффект на фоне водной нагрузки у человека [Григорьев А.И., И.М.Ларина, Л.Б.Буравкова, и др. II Физиол. чел. 2003. 29 (3). С.119-127, Григорьев А.И., Ларина И.М., Доброхотов И.В. и др. II Физиол. чел. 2005. 31 (5). С.1-7], не влияя на состояние сердечно-сосудистой системы. В данном примере реализации способа установлено, что внутримышечное введение десмопрессина на фоне 3% ВН вызывало снижение скорости мочеотделения: за 4 часа почки животных выводили только 20,8±1,0% объема водной нагрузки.

Дополнительная сравнительная оценка эффективности аналогов вазотоцина была продолжена при анализе показателей функции почки (табл.1). Показатель клиренса осмотически свободной воды за 4 часа после начала пробы с 3% ВН, нормированный на кг веса животного, составлял в среднем 23,8+5,9 мл/кг. Это означало, что практически вся выводимая почками животного моча состояла из осмотически свободной воды (выведение жидкости за 4 часа составляло около 30 мл/кг).

Аналогичное заключение можно сделать и в отношении инъецированного D-ABT (выведение жидкости за 4 часа в данной серии составляло 24+7 мл/кг). Однако введение 1-d-ABT вызывало усиление реабсорбции осмотически свободной воды, и показатель клиренса осмотически свободной воды приобретал, в этой серии, отрицательное значение. В меньшей степени это выявлялось и после введения 1-d-D-ABT (табл.1). Показатель клиренса осмотически свободной воды в серии с введением АВТ имел выраженную тенденцию к снижению, по сравнению с таковым на водной нагрузке, что показывает увеличение реабсорбции осмотически свободной воды, которая была удалена практически из 40% выведенного объема мочи. В то же время почка обезьян реагировала на инъекции 1-d-ABT и 1-d-D-ABT значимым снижением калийуреза, а после введения 1-d-ABT - натрийуреза (табл.2).

Было также выявлено, что физиологический эффект десмопрессина у обезьян несколько отличался от такового у крысы. Если при инъекции в мышцу крысам десмопрессина в дозе 0,02 мкг на фоне 5% ВН он показал свою высокую эффективность - за 2 часа животные не выводили ни одной порции мочи, а за 4 ч выведение мочи составляло около 4,5% от введенной нагрузки, то почки обезьян за 4 часа в серии «3% ВН+ десмопрессин», экскретировали 20,9±0,6% дополнительно введенного объема воды. У обезьян при введении аналогов АВТ по сравнению с серией ВН не отмечалось изменений натрий- и калийуреза (табл.2). Однако выраженное усиление реабсорбции свободной воды (значения показателя С_осм становились отрицательными, табл.2) указывало на развитие очень сильной антидиуретической реакции после введения этой дозы нанопептида, при которой с мочой вообще не происходило экскреции осмотически свободной воды, напротив, осмотически свободной вода в организме задерживалась. Следовательно, после внутримышечной инъекции десмопрессина и введении в желудок воды почки обезьян задерживали воду в организме в большем объеме, чем было введено. У этих обезьян не отмечалось изменений натрий- и калийуреза по сравнению с серией ВН (табл.2).

Таким образом, следует заключить, что дозировка десмопрессина, использованная в данном способе, была адекватной для применения на млекопитающих.

При инъекционном введении аналогов АВТ степень снижения калийуреза на 88% определялась скоростью выведения осмотически активных веществ. В целом, наряду с выраженным антидиуретическим эффектом, 1-d-ABT обладал натрий-сберегающим, a 1-d-D-ABT - и натрий- и калий-сберегающим действием.

В результате исследования полученных данных можно сказать, что аналоги АВТ обладают антидиуретическим действием, при этом клиренс осмотически свободной воды приобретал отрицательное значение, а наиболее выраженное антидиуретическое действие у обезьян отмечено после введения 1-d-ABT и 1-d-D-ABT (табл.1, 2).

Таким образом авторами изобретения разработан способ, позволяющий получить антидиуретический эффект у приматов, исключая человека, путем парентерального введения синтетических аналогов аргинин - вазотоцина.

При этом у обезьян обнаружено сходство в реакции на одну и ту же дозу аналогов АВТ в их влиянии на реабсорбцию воды. Было отмечено достоверное снижение выделения натрия после инъекции двух из исследованных аналогов (табл.2). Следует отметить, что экскреция ионов калия почкой резко снижалась у обезьян после инъекции 1-d-D-ABT, другие аналоги не обладали этим действием (табл.2).

Важно, что данный способ с АВТ и его аналогами, как показали экспериментальные исследования, не вызывал у обезьян изменений деятельности сердечно-сосудистой системы.

Таким образом, использование синтетических аналогов АВТ (в дозе, сопоставимой с таковой у природного агониста) вызывало не только увеличение реабсорбции осмотически свободной воды, но и сопровождалось статистически значимыми изменениями выведения ионов натрия или калия. Показано, что синтетические аналоги могут быть более эффективными и избирательными, чем природные агонисты. Это открывает определенные перспективы для создания и использования соответствующих лекарственных форм в клинической практике для поддержания и направленной коррекции водно-электролитного обмена организма.

Таблица 1.Показатель клиренса осмотически свободной воды за 4 час после начала пробы (мл/кг, М±m)№ п/пЭкспериментальные группыЧисло животныхс Н₂О1.3% водная нагрузка1123,8±5,92.3% водная нагрузка +D-ABT в/м424,1±7,53.3% водная нагрузка +1-d-ABT в/м4-2,3±0,94.3% водная нагрузка +1-d-D-ABT в/м4-0,8±0,35.3% водная нагрузка + вазотоцин в/м49,1±3,66.3% водная нагрузка + десмопрессин в/м4-5,7±2,1

Таблица 2.Показатели функции почки у обезьян за 4 часа после 3% водной нагрузки и инъекции аналогов АВТ и десмопрессина (М±SD)Животные и исследуемые параметрыВодная нагрузкаD-ABT1-d-ABT1-d-D-ABTАргинин-вазотоцинДесмопрессинV, мл/кг29,9±6,028,5±8,43,3±0,7^**1,6±0,2^**16,3±4,96,4±0,2^**С_H2O, мл/кг23,8±5,924,1±7,5-2,3±0,9^**-0,8±0,3^**9,1±3,6-5,7±2,1^**U_NaV, мкмоль/ кг521±94449±147114±47^**48±16^***452±92539±127U_KV, мкмоль/кг187±29106±35168±6176±18^**357±47*213±9Примечания: достоверность к водной нагрузке: р<0.05-^*, р<0.01-^**, р<0.001-^***.

Изобретение относится к биотехнологии. Животным внутримышечно вводят синтетический аналог аргинин-вазотоцина - D-аргинин-вазотоцин (D-АВТ) или 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-АВТ), или 1-дезамино-D-аргинин-вазотоцин (1-d-D-ABT) в дозе не менее 0,5 мкг на 1 кг массы тела. Способ не вызывает у животных изменений деятельности сердечно-сосудистой системы и обладает выраженным антидиуретическим эффектом. 2 табл.

Способ поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих, отличающийся тем, что животным инъецируют внутримышечно синтетический аналог аргинин-вазотоцина-D-аргинин-вазотоцин (D-ABT), или 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1-d-АВТ), или 1-дезамино-О-аргинин-вазотоцин (1-d-D-АВТ) в дозе не менее 0,5 мкг на 1 кг массы тела.