СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СВИНЦОВОЙ НЕФРОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патофизиологических механизмов токсического действия тяжелых металлов, в частности свинца, на функциональное состояние почек.

Обладая мощным токсическим действием и выраженной кумулятивной активностью, свинец является одним из высокоопасных политропных ядов I класса опасности. Механизм повреждающего действия свинца связан с его способностью инактивировать функциональные группы биомолекул, замещая жизненно важные элементы в биокомплексах, изменяя при этом конформацию молекул, что приводит к повреждению клеточных мембран. Проникая в организм свинец вызывает не только нарушения обмена веществ, но и способствует развитию гисто-функциональных изменений во внутренних органах. Одними из первых токсическому влиянию подвергаются почки, являющиеся основными экскреторными органами, выполняющие за счет этого и детоксикационную функцию в организме. Токсическое действие, как при хроническом, так и при остром поступлении свинца в организм сопровождается тубулоинтерстициальными изменениями в почках, что приводит к снижению канальцевой реабсорбции воды. Установлено, что хроническое поступление свинца в организм приводит к развитию токсической нефропатии.

Наряду с приведенными литературными данными необходимо заметить, что недостаточно исследованным остается вопрос о патофизиологической роли изменения чувствительности клеток дистального отдела канальцев к гормону задней доли гипофиза (вазопрессину) в развитии нарушений водовыделительной функции почек в условиях хронической свинцовой

интоксикации, поскольку вазопрессин основной регулятор концентрирующей функции почек.

Известен способ диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, заключающийся в определении в эритроцитах и почечной ткани концентрации малонового диальдегида и одновременно активность Na⁺-K⁺ - АТФ-азы почечной ткани [Пат. 2281505 Российская Федерация, МПК G01N 33/48. Способ диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении / Датиева Л.Р., Дзугкоева Ф.С; заявитель и патентообладатель Северо-Осетинская государственная медицинская академия (RU). - №2005109450/15; заявл. 01.04.2005; опубл. 10.08.2006, Бюл. №22.]. Данная модель взята нами в качестве прототипа.

Недостатком описываемого способа является то, что, во-первых, основным диагностическим критерием развития токсической нефропатии являются продукты перекисного окисления липидов, как в крови, так и в почечной ткани. Из литературных данных известно, что активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) является ключевым звеном многочисленного ряда патофизиологических процессов, в том числе таких, как токсическое повреждение всех внутренних органов [Мышкин, В.А. Перекисное окисление липидов и гепаторенальные повреждения у крыс при воздействии стойких загрязнителей / В.А. Мышкин, Д.А. Еникеев, Д.М. Галимов, Л.Т. Идрисова, И.В. Мышкин // Фундаментальные исследования. - 2011. - №10-1. - С. 137-139.]. Кроме того, токсическая нефропатия является не единственной патологией почечной ткани, которая сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов, известно, что мощная активация процессов ПОЛ происходит также при развитии пиелонефрита [Гудкова, Т.В. Перекисное окисление липидов в тромбоцитах и сосудисто-тромбоцитарный гемостаз у больных хроническим первичным пиелонефритом / Т.В. Гудкова, Г.X. Мирсаева, Φ.X. Камилов, Р.

Μ. Фазлыева // Нефрология. - 2005. - Т. 9. - №3. - С. 70-74.]. Следовательно, в качестве основного диагностического критерия хронической токсической нефропатии в данном способе использовался неспецифический показатель функционального состояния почечной ткани, который не способен в полной мере отразить развитие патологических изменений. Во-вторых, в данном способе не проведено морфологическое исследование почек, дающее полное представление о степени развития и локализации гистологических изменений в почечной ткани.

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: для исследования функционального состояния почек используется моча экспериментальных животных, в качестве токсического вещества используется ацетат свинца.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: ацетат свинца вводят экспериментальным животных в дозе 40 мг/кг массы тела, что позволяет создать модель необратимой нефропатии; функциональное состояние почек исследуется в условиях водного диуреза, что позволяет в полной мере изучить адаптивную способность структур почечной ткани к разведению и концентрированию мочи; для диагностики хронической токсической нефропатии используется аналог гормона задней доли гипофиза - десмопрессин; для подтверждения диагностики хронической токсической нефропатии применяется морфогистологический метод исследования почечной ткани экспериментальных животных.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Решение этой задачи позволяет повысить точность диагностики свинцовой нефропатии, выяснить значимость гормональных изменений в формировании ренальной патологии и провести дальнейший поиск средств 4

способных предотвращать развитие почечной патологии в условиях отравления свинцом.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способ диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий проведение лабораторных исследований у животных в условиях водного диуреза характеризуется тем, что определяется чувствительность канальцевого аппарата к десмопрессину, с последующим проведением морфологического исследования тканей почек, что подтверждает возможность осуществления и достоверность диагностической точности исследования в отличие от прототипа.

Совокупность указанных общих существенных признаков дополняют, развивают и уточняют следующими частными отличительными признаками, которые направлены на решение этой задачи диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных, что позволяет повысить диагностику патологического состояния. Применение пробы с чувствительностью к десмопрессину позволяет функционально установить наличие морфофункциональных изменений канальцевого аппарата почек.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: ацетат свинца вводят экспериментальным животных в дозе 40 мг/кг массы тела, что позволяет создать модель необратимой нефропатии; функциональное состояние почек исследуется в условиях водного диуреза, что позволяет в полной мере изучить адаптивную способность структур почечной ткани к разведению и концентрированию мочи; для диагностики хронической токсической нефропатии в условиях водной нагрузки используется аналог гормона задней доли гипофиза - десмопрессин, действие которого в условиях сформировавшейся нефропатии нивелировано, и процент выведения водной нагрузки составляет 85,8%, тогда как в норме процент выведения при действии десмопрессина равен 44%; для подтверждения диагностики

хронической токсической нефропатии применяется морфогистологический метод исследования почечной ткани экспериментальных животных.

Между отличительными признаками и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: снижение чувствительности канальцевого аппарата почек к основному гуморальному регулятору тубулярной реабсорбции в условиях хронической свинцовой интоксикации свидетельствует о нарушении способности почек к концентрированию мочи, являющейся основным показателем функционального состояния почек, т.е. диагностируется свинцовая нефропатия. Определенные функциональные изменения подтверждаются также морфологическим исследованием почек экспериментальных животных.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения не известна из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники, так как из него не выявляется выше указанные влияния на получаемый технический результат-новое свойство объекта - совокупности признаков, которые отличают от прототипа заявляемое изобретение, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине, с получением технического результата, заключающегося в более точном способе диагностики свинцовой нефропатии. Учитывая то, что исследование чувствительности эпителия почечных канальцев к десмопрессину позволяет в полной мере оценить функциональную целостность канальцевого аппарата почек, данное исследование можно использовать для диагностики свинцовой нефропатии не только у лабораторных животных, но также и у людей. Все

это позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения токсического вещества ацетат свинца растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,2 мл, приходится 8 мг свинца (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор ацетата свинца вводят через атравматичный зонд в желудок в дозировке 40 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 16 дней одной группе животных. В целях изучения функции почек в условиях гипергидратации животным через зонд в желудок вводили водную нагрузку (5% от массы тела), после чего крыс помещали в обменные клетки па 3 часа, в течение которых через каждый час собиралась моча. В моче исследовали содержание креатинина. С целью изучения изменения чувствительности канальцевого аппарата почек к вазопрессину на фоне хронической свинцовой интоксикации вместе с водной нагрузкой внутрижелудочно вводили андитиуретический гормон, в качестве которого использовали десмопрессин в дозе 0,15 мкг/100 г. По истечению срока эксперимента крысы забивались с использованием тиопентала для исследования плазмы и тканей. Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на чертеже (Фиг. 1) в группе животных получавших ацетат свинца выявлены изменения клубочкового аппарата почек, проявляющиеся в виде полнокровных капиллярных петель (а) с гипертрофией ядер эндотелиоцитов и

мезангиальных клеток с наличием их отека (б). Гистологические изменения канальцевого аппарата почек животных получавших ацетат свинца (Фиг. 2) характеризовались наличием выраженных дистрофических, некробиотических и некротических изменений. Дистрофические изменения проявлялись в виде мутного набухания цитоплазмы (а) с одновременной зернистой (б) и дигропической (в) дистрофией клеток канальцевого аппарата почек. Токсическое действие свинца на почку приводило к увеличению просвета канальцев (г), внутри которых определялось гомогенное белковое содержимое (д). Очаговый фиброз развившийся у экспериментальных животных под действием ацетат свинца подтверждался наличием коллагеновых волокон (е) по периметру большинства канальцев.

Пример. Крысам самцам линии Вистар массой 200-300 грамм вводили через зонд в желудок раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг каждый день в течение 16 дней. По истечении времени эксперимента (16 дней) в условиях 5% водной нагрузки исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%) и чувствительность канальцевого аппарата к основному регулятору водовыделительной функции почек. Полученные результаты в опытной группе сравнивали с фоновыми показателями интактной группы животных.

Концентрацию креатинииа определяли спектрофотомстрически (PV1251C) с помощью набора «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0. При проведении экспериментов руководствовались статьей 11-й Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.).

Исследование функционального состояния почек на фоне 5% водной нагрузки выявило увеличение диуреза на 1 часе эксперимента у животных интрагастрально получавших ацетат свинца в дозе 40 мг/кг относительно показателей интактной группы животных. Рост диуреза был обусловлен снижением канальцевой реабсорбции воды, несмотря на снижение скорости клубочковой фильтрации, что свидетельствует о снижении концентрирующей функции почек, обусловленной развитием канальцевой дисфункции, сформировавшейся в условиях отравления ацетатом свинца. Несмотря на снижение канальцевой реабсорбции воды, диурез у животных интрагастрально получавших ацетат свинца на 2-ом часе после введения водной нагрузки был меньше значений интактного контроля, вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации. На 3-м часе после введения водной нагрузки у животных получавших ацетат свинца, объем диуреза был больше показателей интактного контроля, что было обусловлено наличием изменений в канальцевой реабсорбции воды. Суммарный трехчасовой диурез и процент выведения водной нагрузки у животных получавших ацетат свинца был выше показателей интактной группы животных, за счет увеличения объема диуреза на 1-м и 3-м часе эксперимента (табл.).

У большей части интактных крыс (83%) десмопрессии блокировал образование мочи за первый час, а у остальной части снизил его практически в 3 раза, что было обусловлено повышением уровня канальцевой реабсорбции. Снижение чувствительности к десмопрессину у животных получавших ацетат свинца проявлялось в отсутствие достоверных изменений в объеме мочи по сравнению с пробами без дссмопрессина, что свидетельствует о значительном снижении чувствительности канальцевого аппарата почек к десмопрессину в условиях свинцовой интоксикации (таб.).

Таким образом, из вышеизложенного следует, что при развитии свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении развиваются выраженные нарушения мочеобразовательной функции в условиях водного диуреза, сочетающиеся с потерей

чувствительности канальцевого аппарата почек к антидиуретическому гормону, что свидетельствует о наличие структурных изменениях в почке, которые подтверждаются морфологическим исследованием. То есть, использование определения чувствительности канальцевого аппарата почек к антидиуретическому гормону в качестве диагностического критерия свинцовой нефропатии является вполне обоснованным и диагностически верным.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении. Проводят лабораторные исследования. У животных в условиях водного диуреза определяют чувствительность канальцевого аппарата к антидиуретическому гормону, в качестве которого используют десмопрессин в дозе 0,15 мкг/100 г, с последующим проведением морфологических исследований тканей почек. Использование заявленного способа позволяет абсолютно точно диагностировать свинцовую нефропатию у экспериментальных животных. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ диагностики свинцовой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий проведение лабораторных исследований, отличающийся тем, что у животных в условиях водного диуреза определяют чувствительность канальцевого аппарата к антидиуретическому гормону, в качестве которого используют десмопрессин в дозе 0,15 мкг/100 г, и при отсутствии достоверных изменений в объеме мочи по сравнению с пробами без десмопрессина диагностируют снижение чувствительности к десмопрессину и свинцовую нефропатию.