ПРИМЕНЕНИЕ [ДЕЗАМИНО-1, ИЗОЛЕЙЦИН-3, АРГИНИН-8]ВАЗОПРЕССИНА В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ВЫВЕДЕНИЯ ПОЧКОЙ СОЛЕЙ НАТРИЯ И УСИЛЕНИЯ ОБРАТНОГО ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ВСАСЫВАНИЯ ИЗ ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ В КРОВЬ ВОДЫ-РАСТВОРИТЕЛЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K38/11 A61P3/12 A61P7/12 

Изобретение относится к области физиологии, а именно к терапевтически активным химическим соединениям (гормонам), влияющим на мочеобразующую деятельность почек, и может быть использовано, например, для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя.

Регулирование процессов мочеобразования имеет важное значение для обеспечения жизнедеятельности организмов. В природе эту функцию выполняют прежде всего различные вазотоцины и вазопрессины - полипептидные (нонапептидные) гормоны, содержащие в цепи молекулы 9 остатков аминокислот и вырабатываемые нейросекреторными клетками гипоталамуса головного мозга. Они накапливаются в задней доле гипофиза, откуда переходят в кровоток; с кровью доставляются к почке, где участвуют в регулировании мочеобразования. Помимо этих важных для обеспечения жизни эндогенных (синтезируемых в органах животных) соединений, в организме присутствуют как их предшественники (например, полипептиды с меньшим числом остатков аминокислот, составляющих цепочку молекулы), так и продукты их биологических превращений (продукты их гидролиза, дезаминирования, окисления и др.).

Основные процессы мочеобразования происходят в нефронах почки [1, 2]. Часть крови, поступающей к нефрону, фильтруется через его полупроницаемую входную мембрану. В норме эта мембрана непроницаема для клеток крови и белков (высокомолекулярных соединений) и легко проницаема для воды и большинства низкомолекулярных растворенных соединений (неорганических солей металлов, аминокислот, витаминов, мочевины и др.). Из фильтрата (первичной мочи), поступившего во внутреннюю полость нефрона, часть растворенных веществ и воды возвращается (всасывается, «реабсорбируется») через боковые стенки полости нефрона в омывающую нефрон кровь. При этом основная часть воды (около двух третей фильтрата) возвращается в кровь («реабсорбируется») в начале нефрона, перед поступлением в петлю канальца нефрона. Затем часть оставшейся воды «реабсорбируется» при протекании жидкости в петле нефрона, в дистальном извитом канальце и в собирательных трубках. Оставшаяся в нефроне вода выделяется с мочой. Из всего количества катионов натрия фильтрата около 64% «реабсорбируется» в кровь на участке до петли нефрона, около 25% - из петли нефрона, около 9% - из дистального извитого канальца и около 1% - из собирательных трубок. Оставшиеся в канальцевой жидкости катионы (соли) натрия выделяются из организма с мочой.

Мы вынуждены употреблять здесь общепринятый в физиологии термин «реабсорбция» для обозначения процесса всасывания воды и растворенных в ней веществ, т.е. для обозначения такого процесса, который не относится к абсорбции - поглощению газов и паров в жидкостях. Так как этот термин является общепринятым в отечественных и зарубежных публикациях по физиологии почечной деятельности, мы употребляем его как профессиональный термин в данной области науки.

Скорость мочевыделения (скорость диуреза, V) выражают числом миллилитров мочи, выделяемых в единицу времени, обычно из расчета на 100 г массы тела животного.

Скорость выведения с мочой катионов натрия Na⁺, в виде его солей, выражают числом миллиграмм-ионов Na⁺, выделяемых с мочой в единицу времени, обычно из расчета на 100 г массы тела животного.

Для обеспечения нормального функционирования организма необходимо регулировать прежде всего количество выводимой мочи, количество выводимых с мочой солей натрия и интенсивность обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя, т.е. воды, свободной от растворенных веществ (интенсивность «реабсорбции» воды-растворителя). Усиление обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя особенно важно для обеспечения работоспособности и функционирования организма при длительном пребывании в малогабаритных изолированных камерах подводных, космических или других аппаратов.

Известно, что для увеличения мочевыделения, с целью устранения отеков, используют мочегонные средства, из которых наиболее эффективным и наиболее известным является фуросемид [3, стр.502; 4, стр.834], т.е. 4-хлор-N-(2-фурилметил)-5-сульфамоилантраниловая кислота, он же furosemide FS, т.е. (4-chloro-N-furfuryl-5-sulfamoil-anthranilic acid), C₁₂H₁₁ClN₂O₅S с молекулярной массой 330,7 у.е. (углеродных единиц). При этом фуросемид увеличивает не только объем выделяемой мочи, но и общее количество выделяемых с мочой катионов (солей) натрия. Однако эти эффекты фуросемид проявляет лишь при достаточно высоких дозах, около 1 мг (на 100 г массы тела) при некоторых формах патологии. В дозах менее 1 мкг (на 100 г массы тела) мочегонное действие фуросемида практически незаметно. Недостатком фуросемида является и то, что он не способен усиливать обратное избирательное всасывание из почечных канальцев в кровь воды-растворителя. Кроме того, недостатком фуросемида является то, что при многоразовом его употреблении, несмотря на увеличение выведения солей натрия с мочой, растет концентрация солей натрия в крови, а при его передозировке может произойти пагубное обезвоживание организма.

Известно также [4, стр.1536 и 1537] об использовании различных синтетических гормонов: вазотоцинов и вазопрессинов (химических соединений эндогенных для организма) для регулирования процессов мочеобразования. Из них наиболее эффективны: [аргинин-8]вазотоцин и [аргинин-8]вазопрессин. Отметим, что первый из них является предшественником второго в процессе эволюционного развития позвоночных. Оба соединения способны увеличивать общее количество выделяемых с мочой катионов (солей) натрия, однако не в достаточной мере. При этом первый из них, в отличие от второго, способен более значительно увеличивать избирательную «реабсорбцию» воды-растворителя из почечных канальцев, и поэтому проявляет более выраженную антидиуретическую активность. Это наиболее эффективный из известных антидиуретических эффекторов. Однако даже у него антидиуретическая активность недостаточно высока.

[Аргинин-8]вазотоцин, он же [arginine-8]vasotocin, т.е. [Arg-8]VT, С₄₃Н₆₇N₁₅O₁₂S₂ с молекулярной массой 1050 у.е., имеет структурную формулу

которая приведена в справочном каталоге фирмы «Сигма» [4, стр.1536].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности выведения почкой солей натрия и усиление обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя, т.е. воды, свободной от растворенных веществ.

Технический результат достигается тем, что в качестве средства, влияющего на указанные функции почек, предложено использовать химическое соединение [дезамино-1, изолейцин-3, аргинин-8]вазопрессин, т.е. [deamino-1, isoleucine-3, arginine-8]vasopressin, оно же [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP, со структурной формулой

общей молекулярной формулой С₄₃Н₆₆N₁₄O₁₂S₂ с молекулярной массой 1035 у.е.

Ранее было известно [5], что соединение [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP проявляет инсулиноподобную активность, т.е. ускоряет окисление глюкозы в крови хомяков и собак. Но не было сообщений о его способности увеличивать общее количество выделяемых с мочой катионов (солей) натрия и усиливать обратное избирательное всасывание из почечных канальцев в кровь воды-растворителя.

При изучении других известных решений в данной области техники признаки, идентичные признакам, отличающим заявляемое изобретение, выявлены не были, и поэтому оно соответствует критерию "изобретательский уровень".

Применение заявляемого изобретения на практике для регулирования процесса мочеобразования (для увеличения общего количества выделяемых с мочой катионов натрия и для усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя) обеспечивает ему критерий "промышленная применимость".

Пример.

Эксперименты выполнены на ненаркотизированных самках белых крыс линии Вистар, массой тела 150-200 г, в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными. Исследуемые животные были разделены на 4 группы: 1-я группа (№1) - контрольная, 2-4 группы - опытные. Животным всех групп делали внутримышечную инъекцию физиологического раствора (физраствора) хлористого натрия из расчета 0.1 мл на 100 г массы тела. При этом для группы №1, в отличие от опытных групп, физраствор не содержал эффектора. Для группы №2 физраствор содержал [Arg-8]VT в концентрации 0.050 мкг на 0.1 мл; для группы №3 -[dA-t, Ile-3, Arg-8]VP в концентрации 0.050 мкг на 0.1 мл; для группы №4 - фуросемид в концентрации 1000 мкг на 0.1 мл. Как указано выше, фуросемид не проявляет заметного мочегонного эффекта при дозах менее 1 мкг на 100 г массы тела. Поэтому в опытах с фуросемидом его весовая доза была подобрана намного более высокой, чем с двумя другими эффекторами, для достижения сопоставимых результатов.

Каждое животное помещали в отдельную клетку-пенал с полом из металлической сетки, под которым находился воронкообразный сток для сбора мочи при произвольном мочеиспускании. Пробы мочи собирали в подвешенные градуированные пробирки, которые заменяли после каждого мочеиспускания животного. Сбор проб проводили в течение 4 часов с регистрацией времени каждого мочеиспускания и объема выделившейся мочи, для расчета скорости диуреза V, мл/(2 ч)/(100 г массы тела). После этого брали пробу крови из сонной артерии животного, под нембуталовым наркозом в дозе 0.50 мг/(100 г массы тела). После свертывания крови ее центрифугировали, центрифугат (сыворотку крови) отделяли и анализировали. Измерение концентрации катионов натрия в сыворотке крови проводили на анализаторе электролитов AVL 9140 (США); а в моче - на пламенном фотометре Corning-410 (Великобритания), в воздушно-пропановом пламени. Осмоляльность сыворотки крови и мочи определяли криоскопическим методом на миллиосмометре МТ-4 ("Буревестник", Санкт-Петербург). Результаты измерений и расчетов представлены в таблице.

Для ясности приводим полную последовательность заполнения таблицы для серии опытов №3 с предлагаемым эффектором [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP (см. в таблице столбец 5).

Средние величины каждого измеряемого параметра рассчитывали по результатам 30-ти его измерений, а средние величины произведения двух параметров, измеряемых в индивидуальном опыте, - по результатам 30-ти произведений.

1. Измерили волюметрически скорость диуреза (V - скорость выведения почкой мочи):

V=1.3±0.1 (мл мочи)/(2 ч)/(100 г массы тела) - для 30-ти измерений.

2. Измерили на пламенном фотометре концентрацию в моче катионов натрия (U_Na):

U_Na=245±5 (мкг-ион Na⁺)/(мл мочи) - для 30-ти измерений.

3. Рассчитали общее количество мкг-ионов натрия в V мл мочи (U_Na*V):

U_Na*V=245±5 (мкг-ион Na⁺)/(мл мочи)*1.3±0.1 (мл мочи)/(2 ч)/(100 г массы тела) = 319±32 (мкг-ион Na⁺)/(2 ч)/(100 г массы тела) - для 30-ти произведений.

4. Рассчитали общее количество мкг-ионов натрия в V мл мочи (см. столбец 5 таблицы), образовавшихся только под действием дозы эффектора (ΔU_Na*V)_доза, т.е. за вычетом результата контрольного опыта (15 мкг-ион Na⁺, в столбце 3 таблицы):

(ΔU_Na*V)_доза=(U_Na*V)_ст5-(U_Na*V)_ст3=319±32-15±6=304±38 (мкг-ион Na⁺)/(2 ч)/(100 г массы тела)/(0.05 мкг эффектора).

5. Рассчитали общее количество мкг-ионов натрия в V мл мочи, образовавшихся под действием 1 мкмоля эффектора (ΔU_Na*V)_{1 мкмоль}:

(ΔU_Na*V)_{1 мкмоль}=304±38 (мкг-ион Na⁺)/(2 ч)/(100 г массы тела)*1035 (мкг эффектора)/(мкмоль эффектора):0.05 мкг эффектора=6292800±786600 (мкг-ион Na⁺)/(2 ч)/(100 г массы тела)/(мкмоль эффектора).

Иными словами, под действием одной молекулы предлагаемого эффектора почка выводит с мочой 6290000 катионов натрия (в виде его солей).

6. Рассчитали относительную величину (ΔU_Na*V)_{1 мкмоль} в процентах относительно результата в опытной серии с фуросемидом (серия №4, 6-я колонка таблицы):

(ΔU_Na*V)_{1 мкмоль, %}=6292800:115*100=5517544.

Иными словами, под действием одной молекулы предлагаемого эффектора почка выводит с мочой в 55200 раз больше катионов натрия, чем под действием одной молекулы фуросемида.

7. Измерили на миллиосмометрс осмотическую концентрацию мочи (U_osm):

U_osm=749±23 мкосм/(мл мочи) - для 30-ти измерений.

Измеренная величина осмоляльности мочи (749 мкосм/мл) намного больше, чем осмоляльность нормальной сыворотки крови (298 мкосм/мл). Это свидетельствует о том, что данный эффектор усиливает избирательное возвращение (обратное всасывание, «реабсорбцию») свободной воды-растворителя из почечных канальцев в кровь, омывающую нефрон, что приводит к увеличению концентрации электролитов в моче.

8. Рассчитали общее количество мкосмолей в V мл мочи (U_osmV):

U_osmV=749±23 (мкосм)/(мл мочи)*1.3±0.1 (мл мочи)/(2 ч)/(100 г массы тела)=973±107 (мкосм)/(2 ч)/(100 г массы тела) - для 30-ти произведений.

9. Рассчитали, до какой величины (V=_osm) необходимо изменить объем мочи (разбавить водой или сконцентрировать 1.3 мл мочи), чтобы ее осмоляльность стала равной осмоляльности сыворотки крови:

V_=osm=973±107 (мкосм):298 (мкосм)/мл=3.26±0.2 мл.

Иными словами, для того, чтобы сравнять осмоляльность мочи с осмоляльностью сыворотки крови, необходимо 1.3 мл мочи разбавить чистой водой до объема 3.26 мл, т.е. необходимо добавить 1.96 мл чистой воды.

10. Рассчитали величину показателя проявления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя, т.е. разницу реального объема мочи V и расчетного ее объема V_=osm:

(V-V_=osm)=1.3 мл-3.26 мл=-1.96 мл.

Т.е. в данной серии опытов в результате выраженного увеличения обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя объем образующейся мочи уменьшился на 1.96 мл и оказался равным фактическому объему мочи 1.3 мл.

11. Выразили относительную величину показателя проявления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя, в процентах от его величины в контрольной серии №1:

(V-V_=osm)_%=-1.96 мл:-0.43 мл*100%=456%.

Аналогичными способами были измерены и рассчитаны такие же параметры и в других сериях опытов. Все результаты измерений и расчетов представлены в таблице.

Таблица№ п/пНаименование параметраСредняя величина параметра за 2 часа мочеобразования в группе №1
(контроль)2
([Arg-8]VT, 0.05 мкг)3
([dA-1, Ile-3, Arg-8]VP, 0.05 мкг)4
(фуросемид, 1000 мкг = 1 мг)1V, (мл мочи)/(2 ч)/(100г массы тела)0.16±0.030.60±0.041.3±0.13.1±0.32U_Na (мкг-ион Na+)/(мл мочи)96±15220±6245±5116±23U_Na*V(мкг-ион Na⁺)/(2 ч)/100 г массы тела)15±6132±13319±32360±394(ΔU_Na*V)_доза, для всей дозы эффектора0117±19304±38345±475(ΔU_Na*V)_{1 мкмоль}, для 1 мк моля эффектора-2460000(117*1050/0.05=2457000)6290000(304*1035/0.05=6292800)114(345*330,7/1000=114.09)6(ΔU_Na*V)_{1мкмоль}, %-2160000(2457000/115*100=2157895)5520000(6292800/115*100=5517544)1007U_osm, мкосм/(мл мочи)1092±95815±30749±23312±88U_osmV, мкосм/(2 ч)/(100 г массы тела)175±51489±103973±107967±1149V_=osm, мл//(2 ч)/(100 г массы тела)0.59±0.11.64±0.13.26±0.23.24±0.310(V-V_=osm), мл/(2 ч)/(100 г массы тела)-0.43±0.13-1.04±0.14-1.96±0.3-0.14±0.611(V-V_osm)_%, % от серии №110024245632

Из данных таблицы следует, что заявляемый эффектор [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP обладает наибольшей способностью повышать эффективность выведения почкой солей натрия и усиливать обратное избирательное всасывание из почечных канальцев в кровь воды-растворителя. Так, по способности повышать эффективность выведения почкой солей натрия [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP превосходит [Arg-8]VT более чем в 2 раза (5517544/2157895=2.557) и превосходит фуросемид более чем в 55 тысяч раз (5517544/) 00=55175). При этом [Arg-8]VT и особенно [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP вызывают намного большее усиление обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя: соответственно, на 142% и 356% больше, чем в контрольной серии опытов (242%-100%=142%; 456%-100%=356%). Тогда как фуросемид, напротив, уменьшает среднюю величину этого показателя на 68% по сравнению с контрольной серией опытов (100%-32%=68%). Иными словами, по своей способности повышать эффективность выведения почкой солей натрия и усиливать обратное избирательное всасывание из почечных канальцев в кровь воды-растворителя, предлагаемое соединение [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP превосходит наиболее эффективные антидиуретики и мочегонные средства. Такая комбинация свойств [dA-1, Ile-3, Arg-8]VP может найти практическое применение в тех случаях, когда необходимо увеличить выведение из организма солей натрия и при этом максимально сохранить в организме воду (например, при гипернатриемии), что важно для обеспечения оптимальной осмоляльности крови.

Источники информации

1. Наточин Ю.В. Почки. Сравнительная физиология. / В многотомнике: «Большая Советская Энциклопедия». - М.: Советская энциклопедия. Том 20. 1975. С.453-456.

2. Наточин Ю.В. Физиология почек. / В многотомнике: «Большая медицинская энциклопедиям (3-е издание). - М.: Советская энциклопедия. Том 20. 1983. С.432-440.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей. / Москва: «Новая волнам. 2005. С.502 (Фуросемид).

4. Каталог фирмы «Sigma». Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. 2000-2003 годы. С.874 (Furosemide), с.1536 ([Arg-8]vasotocin), с.1537 ([Arg-8]vasopressin).

5. Schillinger E., Loge О., Schroder Е., Klieger Е., Lubke K. Structure Activity Relationship of the Insulin-like Effects of the Neurohypophisial Peptide Hormones. // Eur. J. Biochem. 1972. 27. P.473-481.

На с.478 ([dA-1, Ile-3, Arg-8]VP, т.е. [dA-1, Ile-3, Arg-8]vasopressin], и его инсулиноподобная активность).

6. Заявка на изобретение RU №2005131938 (2006.06.27) «Способ нормализации мочеиспускания при нарушении функции почек» (Авторы: Виддер Кеннет Дж. и др.).

Предложено применение [дезамино-1, изолейцин-3, аргинин-8]-вазопрессина в качестве средства для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя. Средство по заявленной активности превосходит аргинин-8-вазотоцин и может найти применение при гипернатриемии. 1 табл.

Применение [дезамино-1, изолейцин-3, аргинин-8]вазопрессина в качестве средства для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя.