Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается фармацевтического средства, содержащего гиалуронан в качестве активного ингредиента. Более конкретно, изобретение касается средства для лечения аутоиммунных заболеваний, средства для лечения воспалительных заболеваний, средства для лечения неврологических заболеваний, средства для профилактики аутоиммунных заболеваний, средства для профилактики воспалительных заболеваний и средства для профилактики неврологических заболеваний, средства, повышающего жизнеспособность клеток, ингибитора экспрессии связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов, средства, усиливающего синаптическую передачу и защищающего синапсы, содержащего гиалуронан в качестве активного ингредиента. Изобретение также касается фармацевтического средства для лечения спинномозговых травм, астмы и аллергии.
Уровень техники
Гиалуронан - это длинноцепочечный полисахарид, состоящий из повторяющихся звеньев дисахарида, состоящего из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, причем известна и его олигосахаридная форма. Гиалуронан экстрагируют из такой биологической ткани, как петушиный гребешок, пуповина, кожа или суставная жидкость, либо его получают методом ферментации с помощью стрептококковых бактерий. Поскольку у гиалуронана отсутствуют токсикологические и иммунологические эффекты, он применяется как фармацевтический или косметический компонент, к примеру, в хорошо известном способе лечения артрита с помощью внутрисуставного введения гиалуронана. В дальнейшем описании тетрасахарид гиалуронана обозначается как НА4.
Сообщалось, что НА4 оказывает терапевтическое и ингибирующее действие при хранении органов, заболеваниях печени и язве желудка (см. WO 2002/004471). Известно также, что НА4 обладает эффектом повышения экспрессии стрессового белка и эффектом ингибирования клеточной смерти (см. Xu H, Ito Т, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi Н, Isahara К, Yoshida К, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J. Biol. Chem. 2002, 10; 277(19): 17308-14). Кроме того, сообщалось, что олигосахарид гиалуронана обладает целым рядом физиологических активностей (см. Asari A, Novel Functions of Hyaluronan Oligosaccharides. In Science of Hyaluronan Today, Editors: Vincent C. Hascall. Masaki Yanagishita Glycoforum (http://www.glycofbrum.gr.jp/science/hyaluroRan/HA.12/HA12J.html), 2005). Кроме того, известно, что НА4 терапевтически эффективен на модели спинномозговой травмы (см. WO 2004/ 084912).
Множественный склероз зачастую возникает в период от подросткового возраста до сорока лет и сопровождается такими симптомами, как нетвердая походка, слабое зрение, двоение в глазах, затруднения при мочеиспускании, боли и онемение. При возникновении его в детском или юношеском возрасте он иногда сопровождается эпилепсией. Возникает один или несколько патологических очагов, ответственных за эти симптомы, диффузно в мозжечке или спинном мозге. Более того, патологические очаги являются диффузными не только в смысле пространственной диффузности, но и в смысле временной диффузности с внезапным появлением и исчезновением. Патологическое состояние множественного склероза затрагивает иммунную систему, поэтому его относят к аутоиммунным заболеваниям или воспалениям. К тому же, поскольку повреждается спинномозговой нерв, то его относят и к неврологическим заболеваниям.
Жизнеспособность клеток означает активное состояние клетки. Поскольку некоторым заболеваниям присуще снижение жизнеспособности клеток или клеточная денатурация, то улучшение жизнеспособности клеток должно обеспечить терапевтический эффект при таком заболевании. Жизнеспособность клеток можно определить по такому показателю, как способность к окрашиванию красителем Rhodamine 123. Так как митохондрии играют ключевую роль в энергетическом метаболизме, то интенсивность флуоресценции Rhodamine 123 повышается в зависимости от потенциала на мембранах митохондрий. Соответственно, степень окрашивания красителем Rhodamine 123 служит показателем активности митохондрии, а тем самым и показателем степени активности клетки (см. Kim M, Cooper DD, Hayes SF, Spangrude GJ, Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial action on rather than dye efflux. Blood, 1998 Jun 191(11): 4106-17).
Цитокин - это обобщенное название, охватывающее белковые факторы (главным образом, гликопротеиды), которые выделяются из клетки, а затем опосредуют такие межклеточные взаимодействия, как эффекты, контролирующие иммунные или воспалительные реакции, антивирусные эффекты, противораковые эффекты и эффекты, регулирующие клеточный рост/дифференцировку. К цитокинам как таковым относятся интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухолей (TNF) и другие. С другой стороны, хемокины определяются как группа хемотактических цитокинов, способных вызывать хемотаксис лейкоцитов. В настоящем изобретении хемокины определяются как понятие, исключенное из цитокинов.
Связанный с цитокинами ген в общем смысле означает ген, который кодирует цитокин, и ген, который регулирует экспрессию данного гена. Известно много связанных с цитокинами генов, и предполагается взаимосвязь между усилением экспрессии связанного с цитокинами гена и заболеванием. Эффективное ингибирование экспрессии связанных с цитокинами генов сильно способствует лечению многих заболеваний.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение средства для лечения аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний. Другой целью изобретения является обеспечение средства для профилактики аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний.
Следующей целью изобретения является обеспечение нового средства, повышающего жизнеспособность клеток.
Соответственно, целью изобретения является обеспечение нового средства, ингибирующего экспрессию связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов.
Соответственно, целью изобретения является обеспечение нового средства, усиливающего синаптическую передачу и защищающего синапсы.
Средство для лечения аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний по изобретению, которое достигает вышеописанные цели, содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента. Аналогичным образом средство для профилактики аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний по изобретению, которое достигает вышеописанные цели, содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента.
Средство, повышающее жизнеспособность клеток по изобретению, которое соответствует вышеописанным целям, содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента.
Средство, ингибирующее экспрессию связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов по изобретению, которое достигает вышеописанные цели, содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента. Таким образом, изобретение совершено на основе того открытия, что гиалуронан обладает новой функцией ингибирования экспрессии связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов.
Итак, средство, ингибирующее экспрессию связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов по изобретению, содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента. Используемый в нем гиалуронан предпочтительно является тетрасахаридом, содержащим 2 звена, при этом единичным звеном является D-глюкуроновая кислота-β-1,3-D-N-ацетилглюкозамин-β-1,4. Особенно важно то, что он может ингибировать экспрессию связанных с провоспалительными цитокинами генов как представляющих вышеописанные гены, связанные с цитокинами.
Средство, усиливающее синаптическую передачу и защищающее синапсы, которое достигает вышеописанные цели, содержит тетрасахарид гиалуронана в качестве активного ингредиента.
Поскольку каждое из этих средств - фармацевтическое средство, повышающее жизнеспособность клеток, ингибирующее экспрессию связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов, усиливающее синаптическую передачу и защищающее синапсы по изобретению, содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента, они преимущественно могут быть легко получены в большом количестве при сравнительно низких затратах. К тому же, поскольку гиалуронан почти не обладает токсичностью или антигенностью и повышает естественную способность к излечению или профилактике заболеваний, которая присуща тому организму, который он должен защищать, то можно ожидать, что он окажется терапевтическим, профилактическим и ингибиторным средством, обладающим чрезвычайно слабым побочным действием. Таким образом, в соответствии с изобретением можно получить новое фармацевтическое средство, которое эффективно против аутоиммунных заболеваний, воспалительных и неврологических заболеваний. Кроме того, можно получить новое фармацевтическое средство, которое эффективно при лечении заболеваний, объясняемых снижением клеточной активности, а также новое фармацевтическое средство, которое эффективно при лечении заболеваний, объясняемых усилением экспрессии связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена схема функционирования Hsp72 в синапсе, при этом слева представлен поврежденный синапс, а справа - синапс, защищенный Hsp72.
На фиг.2 представлен график, полученный нанесением среднего числа баллов неврологических симптомов ЕАЕ, наблюдавшихся на модели множественного склероза у животных, получавших курс НА4 сразу после инокуляции, по оси ординат, и количество дней после инокуляции в день 0 по оси абсцисс.
На фиг.3 представлен график, полученный нанесением среднего числа баллов неврологических симптомов ЕАЕ, наблюдавшихся на модели множественного склероза у животных, получавших НА4 на протяжении 11 дней после начала заболевания, по оси ординат, и количество дней после инокуляции в день 0 по оси абсцисс.
На фиг.4 представлен график, полученный нанесением среднего числа баллов неврологических симптомов ЕАЕ, наблюдавшихся на модели множественного склероза у животных, получавших НА4 однократно сразу после инокуляции, по оси ординат, и количество дней после инокуляции по оси абсцисс.
На фиг.5 представлены фотографии полученных в примере 2 клеток в каждой группе.
На фиг.6 представлены данные, показывающие результаты измерения интенсивности флуоресценции на полученных в примере 2 клетках в каждой группе.
На фиг.7 представлены результаты иммуноокрашивания на Hsp72 в первичном очаге повреждения, при этом (а) фотография среза в каждой группе после окрашивания и (b) данные, представляющие результаты измерения интенсивности света при иммуноокрашивании на Hsp72.
На фиг.8 представлены результаты иммуноокрашивания на Hsp72 во вторичных очагах повреждения, при этом (а) фотография среза в каждой группе после окрашивания и (b) данные, представляющие результаты измерения интенсивности света при иммуноокрашивании на Hsp72.
На фиг.9 представлены результаты иммуноокрашивания на синаптофизин в первичном очаге повреждения, при этом (а) фотография среза в каждой группе после окрашивания и (b) данные, представляющие результаты измерения интенсивности света при иммуноокрашивании на Hsp72.
На фиг.10 представлены результаты иммуноокрашивания на синаптофизин во вторичных очагах повреждения, при этом (а) фотография среза в каждой группе после окрашивания и (b) данные, представляющие результаты измерения интенсивности света при иммуноокрашивании на Hsp72.
На фиг.11 представлены фотография серого и белого вещества после двойного окрашивания на Hsp72 и синаптофизин и фотография серого вещества после двойного окрашивания на Hsp72 и синаптофизин, при этом на фотографии справа Hsp72 окрашен в красный цвет, на фотографии слева синаптофизин окрашен в зеленый цвет, а в центре левая фотография наложена на правую.
На фиг.12 представлены данные, показывающие результаты измерения продукции IL-1α и IL-1β с помощью матрицы на цитокины.
На фиг.13 представлены данные, показывающие результаты измерения продукции IL-6 и TGF-1β с помощью матрицы на цитокины.
На фиг.14 представлены данные, показывающие результаты измерения продукции TNF-α и TNF-β с помощью матрицы на цитокины.
На фиг.15 представлены данные, показывающие результаты измерения продукции IL-6 и TGF-1β методом ELISA.
На фиг.16 представлена схема предполагаемого механизма действия НА4 при лечении множественного склероза.
На фиг.17 представлена схема предполагаемого механизма действия НА4 при лечении спинномозговой травмы.
На фиг.18 представлена схема предполагаемого механизма действия НА4 против астмы и аллергических заболеваний.
Осуществление изобретения
Изобретение более подробно раскрывается ниже. Средство, повышающее жизнеспособность клеток по изобретению, представляет собой фармацевтическое средство, функцией которого является повышение жизнеспособности клеток. Термин "повышающее жизнеспособность клеток" означает, что облегчается физиологическая жизнеспособность клетки или что ингибируется снижение физиологической жизнеспособности клетки. Улучшение жизнеспособности клеток приводит к лечению или облегчению того заболевания, которое снижает клеточную активность, или того заболевания, которое вызывает денатурацию клетки.
Средство, ингибирующее экспрессию связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов по изобретению, представляет собой средство, функцией которого является ингибирование экспрессии целого ряда связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов. Выражение "ингибирование экспрессии связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов" означает, что при сравнении уровня экспрессии соответствующих генов в клетках у животного, не получавшего лечения, с уровнем экспрессии соответствующих генов в клетках у животного, подвергавшегося лечению средством по изобретению, последний будет значительно ниже. Уровень экспрессии можно измерить с помощью ДНК-чипа, полученного при иммобилизации большого числа ДНК-зондов на подложке.
Средство, усиливающее синаптическую передачу, по изобретению проявляет эффект усиления синаптических функций. Средство, защищающее синапсы, по изобретению проявляет эффект восстановления синаптических функций. Средство, усиливающее синаптическую передачу и защищающее синапсы по изобретению, может повышать степень передачи нейромедиатора между пре- и постсинапсом. В пресинапсе находятся синаптические везикулы, содержащие белок теплового шока 72 (Hsp72) и нейромедиатор. В постсинапсе находятся рецепторы Hsp72 и нейромедиатора. Средство, усиливающее синаптическую передачу и защищающее синапсы по изобретению, действует таким образом, что состояние, представленное слева на фиг.1, переходит в состояние, представленное справа, то есть таким образом, что повышается уровень нейромедиатора.
Изобретение подробно раскрывается ниже. При последующем описании терапевтические и профилактические средства, повышающие жизнеспособность клеток, ингибирующие экспрессию связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов, усиливающие синаптическую передачу и защищающие синапсы по изобретению, собирательно называются фармацевтическими средствами.
Гиалуронан, содержащийся в фармацевтическом средстве по изобретению, может представлять собой любой дисахарид или более высокомолекулярный сахарид, включающий, по меньшей мере, одно звено дисахарида, у которого β-D-глюкуроновая кислота в положении 1 образует связь с β-D-N-гацетиллюкозамином в положении 3 и который построен в основном из β-D-глюкуроновой кислоты и β-D-N-гацетиллюкозамина, даже если такие элементы связаны с одним или несколькими такими дисахаридными звеньями, соединенными вместе, а также могут применяться и производные типа тех, что содержат защищающие от гидролиза группы типа ацильной группы. Такой сахарид может быть ненасыщенным, и таким ненасыщенным сахаридом, к примеру, может быть невосстановленный концевой сахарид, как правило, глюкуроновая кислота с ненасыщенной связью между атомами углерода в положении 3 и 4. Используемый в изобретении гиалуронан, как правило, может быть экстрагирован из природного материала, к примеру, животного, получен путем микробиологической ферментации, синтезирован химическим или энзиматическим способом. Например, гиалуронан может быть получен из такой биологической ткани, как гребешок, пуповина, кожа или суставная жидкость, методом экстракции и методом очистки, известным в этой области. Кроме того, он может быть получен методом ферментации с помощью стрептококковых бактерий.
В данном изобретении гиалуронан охватывает и олигосахариды гиалуронана, причем можно использовать от низкомолекулярного гиалуронана типа дисахарида, состоящего из одинарного звена дисахарида, описанного выше, и его производных, до высокомолекулярного гиалуронана, у которого средневзвешенный молекулярный вес достигает 4000000. Предпочтительным можно считать такой гиалуронан, у которого средневзвешенный молекулярный вес составляет от 380 до 900000, что обеспечивает отличную проницаемость в ткани, причем более предпочтительным является гиалуронан, состоящий из 2-20 сахаридов.
Предпочтительно низкомолекулярный гиалуронан получают специфически путем уменьшения молекулярного веса гиалуронана одним из известных методов, таких как энзиматическое расщепление, щелочное расщепление, тепловая обработка и обработка ультразвуком (Biochem. 33 (1994) р.6503-6507), либо посредством химического или энзиматического синтеза (Glycoconjugate J. (1993) р.435-439, WO 93/20827). Например, энзиматическое расщепление может осуществляться методом, в котором способный к расщеплению гиалуронана фермент типа ферментов, разлагающих гиалуронан (гиалуронидаза из семенников, гиалуронидаза из Streptomyces, гиалуронидаза SD и др., хондроитиназа АС, хондроитиназа ACII, хондроитиназа ACIII и хондроитиназа АВС), действует на гиалуронан с образованием олигосахарида гиалуронана (см. Shin-Seikagaku Jikkenkoza "Saccharides II - Proteoglycans and Glycosaminoglycans", p.244-248, published in 1991, Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd).
Метод щелочного расщепления, к примеру, может представлять собой процесс, в котором основание, например, 1 н. NaOH, добавляют в водный раствор гиалуронана, который нагревают несколько часов для снижения молекулярного веса, а затем для нейтрализации добавляют кислоту типа соляной кислоты, при этом получая низкомолекулярный гиалуронан. Используемый в изобретении гиалуронан охватывает и его солевую форму, причем фармацевтически приемлемая соль может использоваться при желании для составления композиции препарата. Например, это может быть соль такого щелочного металла, как натрий и калий, соль такого щелочноземельного металла, как кальций и магний, соль такого амина, как три(н-бутил)амин, триэтиламин, пиридин и соли аминокислот.
Фармацевтическим средством настоящего изобретения может быть любой гиалуронан определенного молекулярного веса сам по себе или комбинация препаратов гиалуронана различного молекулярного веса, без ограничений. Фармацевтическое средство содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента и может улучшать состояние, по меньшей мере, при одном заболевании, выбранном из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, воспалительных и неврологических заболеваний, не оказывая неблагоприятного воздействия на живой организм при введении в эффективном количестве млекопитающему, в том числе человеку. Аутоиммунное заболевание, воспаление и неврологическое заболевание может, к примеру, представлять собой множественный склероз. Однако аутоиммунные заболевания и воспаления не ограничиваются множественным склерозом, их примерами являются и ревматизм, системная красная волчанка, воспалительный колит, увеит, нефрит, нефропатия, диабет I типа, атопический дерматит, синдром Шегрена, дефект рецепторов инсулина, васкулит, злокачественная миастения, полимиозит, астма и болезнь Хасимото. Неврологические заболевания не ограничиваются множественным склерозом, например, это может быть неврит, невралгия, нейропаралич, инсульт, церебральный паралич, депрессия, старческое слабоумие, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Реклингхаузена, закупорка артерий круга Виллизия, болезнь Краббе, острый диффузный энцефаломиелит, миелорадикулопатия, острый рассеянный энцефаломиелит, нейрооптикомиелит, лейкодистрофия надпочечников, метахроматическая лейкодистрофия, боковой амиотрофический склероз, периферическая невропатия (травма периферического нерва, синдром Гийена-Барре, туннельная невралгия, паралич плечевого сплетения, диабетическая невропатия и др.). Таким образом, фармацевтическое средство, содержащее гиалуронан в качестве активного ингредиента, обладает терапевтическим действием и профилактическим действием против различных аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний, описанных выше.
Также фармацевтическое средство содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента и может ингибировать снижение жизнеспособности клеток и/или может активировать клетки, не оказывая неблагоприятного воздействия на живой организм при введении в эффективном количестве млекопитающему, в том числе человеку.
Фармацевтическое средство содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента и может ингибировать экспрессию определенных связанных с цитокинами и хемокинами генов, не оказывая неблагоприятного воздействия на живой организм при введении в эффективном количестве млекопитающему, в том числе человеку.
Фармацевтическое средство содержит гиалуронан в качестве активного ингредиента и может усиливать синаптическую передачу и защищать синапсы, не оказывая неблагоприятного воздействия на живой организм при введении в эффективном количестве млекопитающему, в том числе человеку.
Фармацевтическое средство может быть заключено в нужную лекарственную форму само по себе или в комбинации с носителем, наполнителем и другими вспомогательными веществами по желанию, чтобы получить фармацевтический препарат для перорального или парентерального введения (введения в ткань (инъекции), например, внутрисуставно, внутривенно, внутримышечно, подкожно или через зонд и через кожу), интерназального введения, введения через накожный пластырь, и может вводиться пациенту любым способом. В особенности при его применении в качестве средства, повышающего жизнеспособность клеток, предпочтительна лекарственная форма для перорального введения. А при его применении специально в качестве средства, ингибирующего экспрессию определенных связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов, желательны лекарственные формы для инъекций и для перорального введения. При его применении специально в качестве средства, усиливающего синаптическую передачу и защищающего синапсы, предпочтительна лекарственная форма для интрадурального введения.
Лекарственная форма для перорального введения, к примеру, может представлять собой твердую форму типа порошка, гранул, капсул и таблеток; жидкую форму типа сиропа, эликсира и эмульсий. Форма типа порошка может быть получена в виде смеси с таким наполнителем, как лактоза, крахмал, кристаллическая целлюлоза, лактат кальция, кислый фосфат кальция, алюмосиликат магния и кремниевый ангидрид. Форма типа гранул может быть получена в процессе мокрой или сухой грануляции с добавлением, помимо вышеперечисленных наполнителей, такого связующего вещества, как сахар, гидроксипропилцеллюлоза, поливинилпирролидон и им подобные, такого связующего, как карбоксиметилцеллюлоза и кальциевая карбоксиметилцеллюлоза, и такого дезинтегрирующего вещества, как карбоксиметилцеллюлоза и кальциевая карбоксиметилцеллюлоза, по желанию. Форма типа таблеток может быть получена таблетированием порошка или гранул, описанных выше, самих по себе или вместе с таким смазочным веществом, как стеарат магния и тальк. Порошок или гранулы, описанные выше, могут быть покрыты основой для кишечно-растворимого покрытия типа гидроксипропилметилцеллюлозы, сополимера фталата и метилметакрилата и им подобных, либо могут быть покрыты этилцеллюлозой, карнаубским воском и гидрогенизированным маслом, образуя при этом кишечно-растворимую форму или форму для замедленного высвобождения. Форма типа твердых капсул может быть получена расфасовкой порошка или гранул, описанных выше, в твердые капсулы. Форма типа мягких капсул может быть получена смешиванием гиалуронана или его соли с глицерином, полиэтиленгликолем, кунжутным маслом, оливковым маслом и др., а затем нанесением желатиновой оболочки. Форма типа сиропа может быть получена растворением подслащивающего вещества типа сахара, сорбита и глицерина вместе с гиалуронаном или его солью в воде. В дополнение к подсластителю и воде можно добавить эфирное масло или этанол для получения эликсира либо добавить гуммиарабик, трагакант, полисорбат 80 или натриевую карбоксиметилцеллюлозу для получения эмульсии или суспензии. В такую жидкую форму можно добавить и ароматизатор, краситель, консервант и др., если нужно.
Лекарственная форма для парентерального применения, к примеру, может представлять собой форму для инъекций, форму для ректального введения, маточное кольцо, форму для нанесения на кожу, средство для ингаляции, аэрозоль, форму для капельного введения и др. Форма для инъекций может быть получена добавлением к гиалуронану или его соли вещества, модифицирующего значение рН, такого как соляная кислота, гидроокись натрия, молочная кислота, лактат натрия, двузамещенный фосфат натрия и однозамещенный фосфат натрия; осмотического агента, такого как хлорид натрия и глюкоза; дистиллированной воды для инъекций, с последующей стерилизацией фильтрованием, а затем заполнением в ампулы. Кроме того, туда можно добавить и маннит, декстрин, циклодекстрин, желатин и т.п., а затем лиофилизировать под вакуумом, получая форму для инъекций, требующую растворения перед употреблением. Также можно получить форму типа эмульсии для инъекций добавлением к гиалуронану или его соли такого эмульгатора, как лецитин, полисорбат 80, полиоксиэтилен и гидрогенизированное касторовое масло, с последующим эмульгированием в воде.
Лекарственная форма для ректального введения может быть получена добавлением к гиалуронану или его соли такой основы для свечей, как моно-, ди- или триглицерид жирных кислот масла какао и полиэтиленгликоль, с последующим нагреванием до расплавления, а затем заливкой в формочку и охлаждением, либо смешиванием гиалуронана или его соли с полиэтиленгликолем, соевым маслом и т.п., с последующим нанесением желатиновой оболочки. Форма для нанесения на кожу может быть получена добавлением к гиалуронану или его соли белого вазелина, пчелиного воска, вазелинового масла, полиэтиленгликоля и т.п., при необходимости с нагреванием, а затем перемешиванием до однородного состояния. Форма типа пластыря может быть получена перемешиванием гиалуронана или его соли вместе с адгезивным средством типа канифоли и полимера алкилакрилата, с последующим нанесением на нетканое полотно и т.д. Средство для ингаляции может быть получено растворением или диспергированием гиалуронана или его соли в таком вытеснителе, как фармацевтически приемлемый инертный газ, с последующим заполнением в устойчивую к давлению емкость.
Способ введения
Хотя способ введения фармацевтического средства настоящего изобретения, содержащего гиалуронан в качестве активного ингредиента, ничем особенно не ограничивается, он может представлять собой интраспинальное, внутривенное, внутрисуставное, интрадуральное, пероральное или интерназальное введение.
Дозировка
Хотя дозировка может быть надлежащим образом подобрана в зависимости от подлежащего лечению заболевания, возраста, общего состояния и веса тела пациента и др., обычно она составляет от 0,05 до 50 мг/кг и вводится раз в день или в разделенных дозах.
Токсичность
Используемый в изобретении гиалуронан почти или совсем не проявлял цитотоксичности в дозе, в которой проявляется биологическая активность фармпрепарата.
ПРИМЕРЫ
Фармацевтическое средство по изобретению дополнительно раскрывается на нижеследующих примерах, которые не предназначены для ограничения технологических рамок изобретения.
Пример 1
В этом примере НА4 применяли при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЕАЕ), который является моделью множественного склероза, чтобы исследовать его эффективность.
Для модели множественного склероза приобретали 4-недельных крыс Lewis и использовали, когда они достигали 5-недельного возраста. В соответствии с методом Shibaki et al. (Shibaki К, Nomura К, Ono R, Shimazu K. Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by ninjineiyoto. Shinkeichiryo 19(2): 159-166, 2002) на одно животное растворяли 300 мкг основного белка миелина морской свинки (GPMBP, Sigma) в 50 мкл PBS, добавляли туда эквивалентное количество полного адъюванта Фрейнда (FCA, Difco) и простерилизованные Mycobacterium tuberculosis (MT, Difco) в концентрации 0,75 мг/мл, а затем по 50 мкл инокулировали в лапки обеих задних конечностей животного.
В этом примере животным из модели множественного склероза давали НА4 сразу после инокуляции или при появлении неврологических симптомов.
Введение тестируемых веществ
В этом примере НА4 готовили в концентрации 1 мг/мл и 10 мг/мл. В частности, НА4 получали методом Tawada et al. (Tawada A, Masa Т, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology, 2002, 12(7): 421-6). В качестве контроля использовали физиологический раствор.
В два момента времени, то есть сразу после инокуляции и при возникновении заболевания, подтвержденного наблюдением неврологических симптомов, животным из модели множественного склероза вводили катетер в мозговую полость и осуществляли интрадуральное введение в течение заданного времени. Для непрерывного введения использовали осмотический насос (модель 2004, Alzet). Животных разбивали на опытные группы, приведенные в табл.1.
Оценка неврологических симптомов ЕАЕ
Неврологические симптомы в баллах оценивали два работника каждый день после инокуляции антигена по нижеследующей 5-балльной шкале.
Шкала ЕАЕ:
0: нет симптомов,
1: снижение тонуса хвоста,
2: слабость задних конечностей,
3: паралич задних конечностей, иногда сопровождающийся недержанием мочи и кала,
4: паралич задних и передних конечностей.
Результаты
1) Эффект (профилактический) непрерывного интраспинального введения НА4 сразу после инокуляции (провоцирующей пробы) и впоследствии
После инокуляции антигена при непрерывном интраспинальном введении НА4 неврологические симптомы явно ослабевали по сравнению с физраствором (фиг.2). На фиг.2 представлен график, полученный нанесением среднего числа баллов описанных выше неврологических симптомов ЕАЕ по оси ординат и количества дней после инокуляции. При сравнении неврологических симптомов в разгар ЕАЕ клинический показатель в группе физраствора на 13-й день после инокуляции антигена составил 2,2±0,41 балла, тогда как в группе непрерывного введения НА4 на 13-й день он составил 0,2±0,41 балла, что значительно ниже (р<0,001), причем заболевание возникало только в 1/6 случаев в группе непрерывного введения НА4. Приведенные на фиг.2 результаты свидетельствуют, что фармацевтическое средство, содержащее гиалуронан в качестве активного ингредиента, эффективно для профилактики множественного склероза.
2) Эффект (терапевтический) непрерывного интраспинального введения НА4 сразу после возникновения заболевания
После возникновения заболевания непрерывное интраспинальное введение НА4 вызывало явное ослабление неврологических симптомов по сравнению с группой физраствора (фиг.3). На фиг.3 представлен график, полученный нанесением среднего числа баллов описанных выше неврологических симптомов ЕАЕ по оси ординат и количества дней после инокуляции. При сравнении неврологических симптомов в разгар ЕАЕ клинический показатель в группе, получавшей физраствор, на 13-й день после инокуляции антигена составил 2,2±0,41 балла, тогда как в группе непрерывного введения НА4 на 13-й день он составил 1,5±1,0 балла, что значительно ниже. При сравнении продолжительности заболевания: 6,5±0,55 дней в группе, получавшей физраствор, и 4,3±1,5 дня в группе непрерывного введения (glucNac-GlcA)2, проявилось значительное уменьшение в последней группе (р<0,01). Приведенные на фиг.3 результаты свидетельствуют, что фармацевтическое средство, содержащее гиалуронан в качестве активного ингредиента, эффективно для профилактики множественного склероза.
3) Эффект (терапевтический) однократного интраспинального введения НА4 сразу после возникновения заболевания
После возникновения заболевания однократное интраспинальное введение НА4 вызывало явное ослабление неврологических симптомов по сравнению с группой, получавшей физраствор (фиг.4). На фиг.4 представлен график, полученный нанесением среднего числа баллов описанных выше неврологических симптомов ЕАЕ по оси ординат и количества дней после инокуляции. При сравнении неврологических симптомов в разгар ЕАЕ клинический показатель в группе, получавшей физраствор, на 13-й день после инокуляции антигена составил 2,2±0,41 балла, тогда как в группе непрерывного введения НА4 на 13-й день он составил 1,8±0,5 балла, что значительно ниже. При сравнении продолжительности заболевания: 6,5±0,55 дней в группе, получавшей физраствор, и 5,0±1,5 дня в группе непрерывного введения НА4, проявилось значительное уменьшение в последней группе (р<0,001). Приведенные на фиг.4 результаты свидетельствуют, что фармацевтическое средство, содержащее гиалуронан в качестве активного ингредиента, эффективно для профилактики множественного склероза.
Пример 2
В этом примере измеряли эффект фармацевтического средства по изобретению на жизнеспособность клеток с помощью Rhodamine 123. Интенсивность флуоресценции Rhodamine 123 повышается в зависимости от мембранного потенциала митохондрий, которые играют главную роль в энергетическом метаболизме. Соответственно, степень окрашивания Rhodamine 123 служит показателем активности митохондрий, а тем самым и показателем клеточной активности (см. непатентную ссылку 2).
Активируемые клетки
В этом примере использовали клетки К562 (известные как клетки эритролейкемии человека или клетки эритробластоидной лейкемии человека). Клетки К562 приобретали у фирмы Riken, Япония.
В этом примере, касающемся получения тестируемого вещества, НА4 готовили в концентрации 100 нг/мл. В частности, НА4 получали методом Tawada et al. (Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology, 2002, 12(7): 421-6), и доводили концентрацию с помощью физиологического раствора.
Экспериментальный метод
Сначала клетки К562 инкубировали в условиях, описанных ниже. Для культивирования клеток К562 использовали среду RPMI-1640. В этом примере клетки инкубировали в группах 1-3, представленных ниже. Каждую группу культивировали в условиях, описанных ниже. В культуральную среду для группы 3 добавляли НА4 (100 нг/мл).
Группа 1: 80 мин при 37°С.
Группа 2: 20 мин при 43°С (тепловая обработка), а затем 60 мин при 37°С.
Группа 3: 20 мин при 43°С (тепловая обработка), а затем 60 мин при 37°С.
После инкубации в каждой группе добавляли Rhodamine 123, растворенный в среде MI. Конечная концентрация Rhodamine 123 составляла 1 мкг/мл. После добавления Rhodamine 123 и инкубации при 37°С в течение 10 мин клетки К562 промывали средой RPMI.
Клетки К562 после промывки инокулировали при 1×104 клеток/мл на 96-луночный планшет и фотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon). Снимок пересылали в программу Adobe Photoshop (Adobe Systems), где измеряли интенсивность флуоресценции клеток.
Снимки по каждой группе представлены на фиг.5, а измерения интенсивности флуоресценции представлены на фиг.6. Приведенные на фиг.5 и 6 результаты показывают, что тепловая обработка при 43°С в течение 20 мин вызывала снижение окрашиваемости Rhodamine 123 (группа 2), тогда как присутствие НА4 ингибировало это снижение (группа 3). Отличие по интенсивности флуоресценции между группами 2 и 3 было значимым.
Обсуждение
Как видно из результатов, описанных выше, НА4 ингибировал снижение мембранного потенциала митохондрий, то есть уменьшение активности митохондрий. Эти результаты свидетельствуют, что НА4 обладает эффектом подавления снижения активности митохондрий, которое неизбежно в условиях опасности (тепловая обработка), либо обладает эффектом восстановления активности митохондрий, если она уже была снижена, то есть обладает эффектом активирования митохондрий. Поскольку митохондрии являются органеллами, вырабатывающими клеточную энергию (АТР), то НА4 обладает эффектом повышения жизнеспособности клеток.
Библиография
1. Martin W, Hoffmeisterher M, Rotte С, Henze К. An overview of endosymbiotic models for the origins of eukaryotes, their ATP-producing organelles (mitochondria and hydrogenosomes), and their heterotrophic lifestytes. Biol. Chem. 2001 Nov, 382(11): 1521-39.
2. Hatefi Y. ATP synthesis in mitochondria. Eur. J. Biochem. 1993 Dec 15, 218(3): 759-67.
Пример 3
В этом примере оценивали повышение жизнеспособности клеток фармацевтическим средством по изобретению с помощью ДНК-чипа, способного регистрировать стимуляцию/ингибирование экспрессии генов.
Экспериментальный метод
Сначала клетки К562 инкубировали в группах 1 и 2 в среде RPMI, описанной выше. Обе группы инкубировали при 42°С в течение 20 мин, а затем при 37°С в течение 30 мин. В среду для группы 2 добавляли НА4 (10 нг/мл).
После инкубации среду удаляли центрифугированием при 1000 об/мин. Полученные клетки хранили в низкотемпературном холодильнике при -60°С. Из хранившихся клеток экстрагировали РНК стандартным методом. Выделенную РНК подвергали анализу экспрессии генов на ДНК-чипе. Анализ экспрессии генов на ДНК-чипе выполняли на DNA CHIP Research Inc. В частности, использовали чип AceGene™ Human Oligo Chip 30К версии 1 фирмы DNA CHIP Research Inc.
Результаты
Результаты анализа экспрессии на ДНК-чипе показали, что клетки, инкубируемые в среде, содержащей НА4, проявляли значительные изменения профиля экспрессии многих генов, связанных с жизнеспособностью клеток, которые перечислены в табл.2.
Как видно из табл.2, НА4 способствовал (1) ингибированию экспрессии генов, связанных с апоптозом, (2) ингибированию экспрессии генов, связанных с ингибированием транскрипции, и (3) усилению экспрессии генов, связанных с белками теплового шока. В частности, НА4 ингибировал экспрессию генов STK17b (DRAK2), pawr (Par-4), каспазы-2 и гранзима Н, которые являются факторами, связанными с индукцией или исполнением апоптоза. Кроме того, НА4 ингибировал экспрессию генов DNAJ2 и TAF9L, которые являются факторами, вызывающими ингибирование транскрипции. Более того, НА4 усиливал экспрессию гена гомолога dnaj (hsp40), который является белком теплового шока.
Обсуждение
Поскольку из связанных с апоптозом генов, представленных выше в результатах, STK17b (Dmm) и pawr (Par-4) являются факторами, служащими для индуцирования или усиления апоптоза, то ингибирование экспрессии этих генов ведет к ингибированию апоптоза. Насчет STK17b (DRAK2) см. Sanjo Н, Kawai Т, Akira S. DRAKs, novel serine/threonine kinases related to death-associated protein kinase that trigger apoptosis. J. Biol. Chem. 1998 273(44): 29066-71. Насчет pawr (Par-4) см. Johnstone RW, Sec RE, Sells SF, Wang J, Muthukkumar S, Englert C, Haber DA, Licht JD, Sugrue SP, Roberts T, Rangnekar VM, Shi Y. A novel represser, par-4, modulates transcription and growth suppression functions of the Wilms′ tumor suppressor WT1. Mol. Cell. Biol. 1996 16(12): 6945-56; и Mattson MP, Duan W, Chan SL, Camandola S. Par-4: emerging pivotal player in neuronal apoptosis and neurodegenerative disorders. J. Mol. Neurosci. 1999 Aug-Oct, 13(1-2): 17-30.
К тому же, поскольку каспаза-2 является исполнительным фактором апоптоза, то ингибирование экспрессии соответствующего гена ведет к ингибированию апоптоза. Насчет каспазы-2 см. Zhivotovsky В, Orrenius S. Caspase-2 function in response to DNA damage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005 331(3): 859-67.
Поскольку гранзим Н является фактором, с помощью которого лимфоциты индуцируют апоптоз в других клетках, то ингибирование экспрессии соответствующего гена ведет к ингибированию апоптоза. Насчет гранзима Н см. Sedelies КА, Sayers TJ, Edwards KM, Chen W, Pellicci DG, Godfrey DI, Trapani JA. Discordant regulation of granzyme H and granzyme В expression in human lymphocytes. J. Biol. Chem. 2004 279(25): 26581-7. Epub 2004 Apr 6.
Описанные выше результаты указывают на то, что ингибирование экспрессии генов DNAJ2 и TAF9L ведет к восстановлению транскрипционной активности, если она была заингибирована. Насчет DNAJ2 см. Terada К, Mori H. Human DnaJ homologs dj2 and dj3, and bag-1 are positive cochaperones of hsc70. J. Biol. Chem. 2000 275(32): 24728-34. Насчет TAF9L см. Chen Z, Manley JI. In vivo function analysis of the histone 3-like TAF9L and aTAF9-relatcd factor, TAF9L. J. Biol. Chem. 2003 278(37): 35172-83.
Как мы уже сообщали, НА4 обладает эффектом усиления экспрессии белка теплового шока 72 (Hsp72) (Xu H, Ito Т, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara К, Yoshida К, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J. Biol. Chem. 2002 10,277(19): 17308-14). В данном примере анализ с применением ДНК-чипа показал, что НА4 усиливает экспрессию гена гомолога dnaj (hsp40), который является белком теплового шока. Гомолог dnaj (hsp40) обладает эффектом ингибирования денатурации внутриклеточных белков и эффектом ингибирования гибели клеток, аналогично Hsp72.
В соответствии с результатами данного примера, изложенными выше, оказалось, что НА4 обладает новыми функциями, такими как ингибирование апоптоза, восстановление активности транскрипции и ингибирование денатурации белков. Поскольку все эти функции связаны с жизнеспособностью клеток, то можно сделать вывод, что НА4 обладает эффектом повышения жизнеспособности клеток.
Пример 4
В этом примере оценивали ингибирование экспрессии связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов фармацевтическим средством по изобретению с помощью ДНК-чипа, способного регистрировать стимуляцию/ингибирование экспрессии генов.
Экспериментальный метод
Сначала клетки K562 инкубировали в группах 1 и 2 в среде RPMI, описанной выше. Обе группы инкубировали при 42°С в течение 20 мин, а затем при 37°С в течение 30 мин. В среду для группы 2 добавляли НА4 (10 нг/мл).
После инкубации среду удаляли центрифугированием при 1000 об/мин. Полученные клетки хранили в низкотемпературном холодильнике при -60°С. Из хранившихся клеток экстрагировали РНК стандартным методом. Выделенную РНК подвергали анализу экспрессии генов на ДНК-чипе. Анализ экспрессии генов на ДНК-чипе выполняли на DNA CHIP Research Inc. В частности, использовали чип AceGene™ Human Oligo Chip 30К версии 1 фирмы DNA CHIP Research Inc.
Результаты
Результаты анализа экспрессии на ДНК-чипе показали, что клетки, инкубируемые в среде, содержащей НА4, проявляли значительные изменения профиля экспрессии многих генов, связанных с жизнеспособностью клеток, которые перечислены в табл.3.
Как видно из табл.3, обработка НА4 приводила к ингибированию экспрессии многих связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов. Из приведенных в табл.3 связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов насчет гена IFN-γ см. Schroder К, Hertzog PJ, Ravasi T, Home DA. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J. Leukoc. Biol. 2004 75(2): 163-89. Насчет гена Mig (CXCL9) см. Farber JM. Mig and IP-10: CXC chemokines that target lymphocytes. J. Leukoc. Biol. 1997 61(3): 246-57. Насчет гена IL-5 см. Adachi Т, Alam R. The mechanism of IL-5 signal transduction. Am. J. Physiol. 1998 275(3 Pt 1): C623-33. Насчет IL-17b см. Li H, Chen J, Huang A, Stinson J, Heldens S, Foster J, Dowd P, Gumey AL, Wood WI. Cloning and characterization of IL-17B and IL-17C, two new members of the IL-17 cytokine family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 18 97(2): 773-8. Насчет IL-18RAP см. Cheung H, Chen NJ, Cao Z, Ono N, Ohashi PS, Yeh WC. Accessory protein-like is essential for IL-18-mediated signaling. J. Immunol. 2005 174(9): 5351-7. Насчет CCL28 см. Wang W, Soto H, Oldham ER, Buchanan ME, Homey B, Catron D, Jenkins N, Copcland NO, Gilbert DJ, Nguyen N, Abrams J, Kershenovich D, Smith K, McClanahan T, Vicari AP, Ziotnik A. Identification of a novel chemokine (CCL28), which binds CCR10 (GPR2). J. Biol. Chem. 2000 275(29): 22313-23. Насчет IL-1β см. Okamura H. IL-1 family (IL-1 alpha/beta, IL-1Ra, IL-18), IL-16, IL-17. Nippon Rinsho 2005 63 Suppl. 4: 226-33. Насчет IFN-ω1 см. Bekisz J, Schmeisser H, Hemandez J, Goldman ND, Zoon КС. Human interferons alpha, beta and omega. Growth Factors 2004 22(4): 243-51. А также Adolf GK, Maurer-Fogy I, Kalsner I, Cantell K. Purification and characterization of natural human interferon omega 1. Two alternative cleavage sites for the signal peptidase. J. Biol. Chem. 1990 265(16): 9290-5.
Обсуждение
В этом примере обработка НА4 приводила к ингибированию экспрессии связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов. Поскольку используемые клетки К562 происходят из лейкоцитов, естественно, у них происходит экспрессия связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов. Поскольку НА4 усиливает экспрессию Hsp72 (см. Xu H, Ito Т, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara К, Yoshida К, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J. Biol. Chem. 2002 10, 277(19): 17308-14), то возможно, что Hsp72 распознается in vivo клетками γδT, вырабатывающими IL-10, а затем IL-10 ингибирует продукцию различных воспалительных цитокинов и хемокинов. Однако, поскольку клетки γδТ не входили в данный пример, то экспрессия связанных с цитокинами генов и связанных с хемокинами генов, участвующих в воспалительных или аутоиммунных заболеваниях, ингибируется непосредственно при обработке НА4.
Пример 5
В этом примере на модели спинномозговой травмы крыс подвергали непрерывной обработке физиологическим раствором (группа, получавшая физраствор) или содержащим НА4 физраствором (группа НА4), после чего брали образцы ткани спинного мозга, которые затем подвергали иммуноокрашиванию с помощью антител против Hsp72 и/или против синаптофизина. Также в этом примере в качестве интактного контроля крыс подвергали ложной операции (группа ложной операции).
Модель спинномозговой травмы на крысах получали, подвергая крыс Wistar (11-недельных при получении, 12-недельных при использовании) процедуре, описанной ниже. Сначала выстригали участок от шейных до поясничных позвонков электрической машинкой под пентобарбиталовым наркозом, а затем стриженый участок прочищали 70% спиртом и ISOGIN. Затем снимали кожу на спине, обнажая грудные позвонки от 5 по 10, после чего 6-й грудной позвонок подвергали частичной ламинэктомии. Затем делали легкий надрез на твердой оболочке, после чего проводили кончик (составляющий 0,3 мм) микропинцета над поверхностью заднего канатика спинного мозга (около 1,5 мм) до тех пор, пока он не упрется в тело позвонка с абдоминальной стороны, и манипулировали микрощипцами в течение 10 сек так, чтобы вызвать рассечение спинного мозга (что в дальнейшем именуется первичным очагом повреждения). На модели спинномозговой травмы у крыс образуется вторичный очаг повреждения, который определяется как очаг повреждения, образовавшийся в результате распространения денатурации аксонов и гибели клеток из первичного очага повреждения. Как полагают, появление вторичного очага повреждения связано с воздействием воспалительных клеток, проникающих в первичный очаг повреждения.
Сразу же после рассечения спинного мозга в очаг повреждения со стороны шеи вставляли конец трубочки (н.д. 0,3 мм) и подсоединяли к осмотическому насосу Alzet, модель 2004 (Alza Corporation), через который осуществляли непрерывное интратекальное введение в течение заданного времени. С целью отделения очага повреждения от окружающих тканей вставляли желатиновый тампон (Gelform, Pharmacia), после чего ранку зашивали и животное возвращали в клетку.
Крыс в группе ложной операции готовили путем надреза твердой оболочки с последующим зашиванием.
Подготовленных таким образом крыс из группы ложной операции определяли в группу 1. Из модели спинномозговой травмы тех крыс, которые получали непрерывное интратекальное введение физиологического раствора, определяли в группу 2. Из модели спинномозговой травмы тех крыс, которые получали непрерывное интратекальное введение содержащего НА4 физраствора, определяли в группу 3. Разбивка на группы представлена в табл.4.
Содержащий НА4 физраствор, который вводили группе 3, получали методом Tawada et al. (Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology, 2002, 12(7): 421-6). У этих крыс в каждой группе делали срезы тканей из первичных и вторичных очагов повреждения, фиксировали формалином, а затем подвергали иммуноокрашиванию стандартным методом. В качестве первичных антител для Hsp72 использовали антитела против Hsp72 (Amersham), а в случае двойного окрашивания в качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитела против IgG кролика либо меченные Texas Red антитела против IgG кролика. В качестве первичных антител для синаптофизина использовали антитела к синаптофизину (Funakoshi), а в случае двойного окрашивания в качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитела против IgG мыши либо меченные FITC антитела против IgG мыши.
Результаты
Результаты опытов по иммуноокрашиванию на Hsp72 в первичных и вторичных очагах повреждения представлены на фиг.7 и фиг.8 соответственно. На фиг.7 и фиг.8 сверху представлены фотографии срезов тканей в соответствующих группах, а внизу представлены интенсивности света в соответствующих группах, измеренные методом NIH-визуализации. Как видно из фиг.7 и 8, в группе 1 почти не отмечалось Hsp72, в группе 2 наблюдалось слабое окрашивание, а в группе 3 наблюдалось более сильное окрашивание. При этом не проявлялось отличий в окрашивании между первичными и вторичными очагами повреждения.
Результаты опытов по иммуноокрашиванию на синаптофизин в первичных и вторичных очагах повреждения представлены на фиг.9 и фиг.10 соответственно. На фиг.9 и фиг.10 сверху представлены фотографии срезов тканей в соответствующих группах, а внизу представлены интенсивности света в соответствующих группах, измеренные методом NIH-визуализации. Как видно из фиг.9 и 10, в группе 1 проявлялась сильная экспрессия синаптофизина в сером веществе и умеренная экспрессия в белом веществе, а в группе 2 почти не проявлялось экспрессии. Напротив, в группе 3 экспрессия синаптофизина оказалась близкой к экспрессии в группе 1. При этом не проявлялось отличий в окрашивании между первичными и вторичными очагами повреждения.
Результаты двойного окрашивания на Hsp72 и синаптофизин у крыс группы 3 представлены на фиг.11. На фиг.11 (а) представлена фотография серого и белого вещества. На фиг.11 (b) справа представлена фотография серого вещества, на которой Hsp72 окрашен в красный цвет, слева представлена фотография серого вещества, на которой синаптофизин окрашен в зеленый цвет, а в центре левая фотография наложена на правую. На фотографии в центре фиг.11 (b) совместная локализация Hsp72 и синаптофизина окрашена в желтый цвет. Как видно из фиг.11 (а), в группе 3 наблюдалось повсеместное окрашивание на Hsp72. С другой стороны, на фиг.11 (b) проявлялась совместная локализация Hsp72 и синаптофизина.
Обсуждение
Обработка НА4 привела к повышению экспрессии Hsp72 на месте спинномозговой травмы. В данном случае, хотя и проявлялось повсеместное присутствие Hsp72, следует отметить, что его локализация совпадает с локализацией синаптофизина. Синаптофизин находится в синаптических везикулах и участвует в синаптической передаче. Соответственно, можно полагать, что НА4 защищает синаптические везикулы и синаптофизин через усиление экспрессии Hsp72 в синаптических везикулах (слева на фиг.1). Хотя долговременное усиление эффективности передачи в синапсах гиппокампа подвержено ингибированию скополамином, однако известно, что предшествующая термообработка гиппокампа для индуцирования Hsp70 предотвращает такое ингибирование (Lin YW, Yang HW, Min MY, Chiu TH. Heat-shock pretreatment prevents suppression of long-term potentiation induced by scopolamine in rat hippocampal CA1 synapses. Brain Res. 2004, 5; 999(2): 222-6). Hsp72 (представитель семейства Hsp70), экспрессию которого усиливал НА4, также выполняет роль шаперона, способствуя функционированию белков, связанных с синаптической передачей, и полагают, что он способствует или восстанавливает такие функции. С другой стороны, до сих пор не было известно ни одно фармацевтическое средство, усиливающее экспрессию Hsp72 в синаптических везикулах. В этом примере НА4 идентифицирован как новое фармацевтичесое средство, усиливающее экспрессию Hsp72 в синаптических везикулах.
В соответствии с вышеприведенными результатами и обсуждением оказалось, что НА4 обладает новой функцией как средство, усиливающее синаптическую передачу и защищающее синапсы.
Пример 6
Методом матрицы ДНК на клетках К562 было показано, что НА4 ингибирует продукцию различных цитокинов типа IL-1β и IFN-γ при наличии теплового шока. В этом примере использовали клетки U937, которые вырабатывают различные цитокины при стимулировании LPS, для исследования эффекта НА4 на продукцию цитокинов.
Материалы
1. Исследуемое вещество: НА4, полученный в соответствии с методом Tawada et al. (1).
2. Клетки: клетки U937 (линия моноцитов человека), приобретенные у Dainipon Sumitomo Seiyaku.
3. Культуральная среда: среда RPMI (содержащая 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS).
4. Липополисахарид (LPS) E.coli. Oil 1B4, Chemicon.
Методы
Клетки U937 засевали порциями по 2 мл в 6-луночный планшет при 5×105 клеток/мл с добавлением LPS в конечной концентрации 100 или 1000 нг/мл, а затем инкубировали при 5% CO2 в течение 24 часов при 37°С в присутствии или в отсутствие НА4 (100 нг/мл). Культуральную жидкость центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин для получения исследуемого вещества. Порцию в 1 мл полученного супернатанта подвергали анализу на матрице с антителами к цитокинам человека (Human Cytokine Antibody array, Raybio), детектируя продукцию различных цитокинов методом ELISA (Endogen).
Более конкретно, использовали следующую процедуру для измерения продукции цитокинов методом матрицы для цитокинов и методом ELISA.
Матрица с антителами к цитокинам
На мембрану с фиксированными антителами наносили 2 мл блокирующего буфера, а затем встряхивали в течение 30 мин. Блокирующий буфер удаляли, добавляли 1 мл супернатанта культуры и встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов, промывали 5 раз, а затем вносили раствор первичного антитела. После встряхивания при комнатной температуре в течение 1,5 часов и 5-кратной отмывки добавляли раствор вторичного антитела и перемешивали в течение ночи при 4°С. После 5-кратной отмывки оставляли для развития хемилюминесценции и фотографировали на Polaroid. Снимок сканировали для получения цифровых данных, которые переносили на Image J для измерения интенсивности люминесценции. Рассчитывали отношение по интенсивности люминесценции внутреннего стандарта, нанесенного на мембрану в 6 точках. Кроме того, рассчитывали относительный уровень (%), принимая за 100% уровень экспрессии в группе, не подвергавшейся обработке (NT).
ELISA (IL-6)
На микропланшет наносили 50 мкл раствора биотинилированного антитела и 50 мкл супернатанта культуры и оставляли при комнатной температуре на 2 часа. После отмывки три раза промывочным буфером добавляли 100 мкл раствора стрептавидин-HRP, оставляли при комнатной температуре на 30 мин и промывали промывочным буфером три раза. Добавляли ТМВ, оставляли при комнатной температуре на 30 мин, после чего добавляли гаситель для остановки реакции и измеряли поглощение при 450 нм (контроль: 562 нм). Рассчитывали концентрацию IL-6 (пг/мл), исходя из стандартного раствора, измеряемого параллельно.
Результаты
При стимуляции с помощью 100 нг/мл LPS добавление НА4 100 нг/мл приводило к снижению продукции воспалительных цитокинов IL-1α, β, IL-6, TGF-β, TNF-α и β (фиг.12-14 (матрица для цитокинов), фиг.15 (ELISA). На графиках, приведенных на фиг.12-14, по оси ординат представлены относительные значения (%), принимая за 100% уровень экспрессии в группе, не подвергавшейся обработке (NT). Только IL-6 представлен в виде относительной концентрации.
Эти результаты показали, что НА4 обладает фармакологическим действием как ингибитор продукции воспалительных цитокинов.
Ссылка
1. Tawada A, Masa Т, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology, 2002,12(7): 421-6.
Пример 7
Интратекальное введение НА4 после инокуляции антигена (провоцирующей инъекции) при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЕАЕ), являющемся моделью множественного склероза, ведет к значительному ингибированию развития такого неврологического симптома, как паралич. С другой стороны, известно, что снижение экспрессии транстиретина приводит к повышению продукции норадреналина. Норадреналин обладает эффектом ингибирования экспрессии воспалительных цитокинов и эффектом усиления активности. Исходя из такого понимания, можно полагать, что ингибирование НА4 выраженности такого неврологического симптома, как паралич, затрагивает снижение экспрессии транстиретина. В примере 1 был описан эффект НА4 на аутоиммунное заболевание/воспаление и множественный склероз, который является неврологическим заболеванием. Соответственно, в этом примере модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), являющегося моделью множественного склероза, подвергали лечению НА4 или физиологическим раствором (отрицательный контроль), а на 14-й день после обработки, когда симптомы становились наиболее тяжелыми, брали образцы ткани головного и спинного мозга и подвергали анализу на матрице ДНК, чтобы исследовать механизмы действия.
Материалы и методы
В качестве экспериментальных животных использовали крыс Lewis, которых приобретали в 4-недельном возрасте и использовали в 5-недельном возрасте. В качестве исследуемого вещества использовали НА4 (1 мг/мл, 10 мг/мл). НА4 получали методом Tawada et al. (Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology, 2002, 12(7): 421-6).
Модель множественного склероза (ЕАЕ)
(1) Исследуемые вещества
- Основной белок миелина морской свинки (GPMBP), Sigma.
- Простерилизованные Mycobacterium tuberculosis (MT, Difco).
- Полный адъювант Фрейнда (FCA, Difco).
- Физиологический раствор (PS).
(2) Подготовка модели
В соответствии с методом Shibaki et al. (Shibaki К, Nomura К, Ono R, Shimazu К. Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by ninjineiyoto. Shinkei-chiryo 19(2): 159-166, 2002) на одно животное растворяли 300 мкг GPMBP в 50 мкл PBS, добавляли туда эквивалентное количество FCA и простерилизованные Mycobacterium tuberculosis, доведенные до концентрации 0,75 мг/мл, а затем по 50 мкл инокулировали в лапки обеих задних конечностей животного.
Сразу же после инокуляции антигена вставляли катетер в мозговую полость и осуществляли интратекальное введение в течение заданного времени. Для непрерывного введения использовали осмотический насос (модель 2004, Alzet). Животных разбивали на две группы, представленные ниже, причем одна группа получала НА, а другая - физиологический раствор в качестве контроля.
Анализ на матрице ДНК
На 14-й день после введения брали образцы ткани головного и спинного мозга и объединяли по каждой группе, а затем подвергали экстракции РНК. Полученные при этом образцы РНК направляли на анализ методом ДНК-матрицы на TakaraBio. Результаты представлены в табл.6.
Обсуждение
Известно, что снижение экспрессии транстиретина ведет к повышению продукции норадреналина (Caggiula M, Batocchi АР, Frisullo G, Angelucci F, Patanella AK, Sancricca C, Nociti V, Tonali PA, Mirabella M. Neurotrophic factors and clinical recovery in relapsing-remitting multiple sclerosis. Scand. J. Immunol. 2005 Aug, 62(2): 176-82). Норадреналин обладает эффектом ингибирования экспрессии воспалительных цитокинов (Sousa JC, Grandela С, Femandcz-Ruiz J, de Miguel R, de Sousa L, Magalhaes AI, Saraiva MJ, Sousa N, Palha JA. Transthyretin is involved in depression-like behaviour and exploratory activity. J. Neurochem. 2004, 88(5): 1052-8) и эффектом усиления поискового поведения/активности (Feinstein DL, Heneka МТ, Gavrilyuk V, Dello Russo С, Weinberg G, Gales E. Noradrenergic regulation of inflammatory gene expression in brain. Neurochem. Int. 2002, 41(5): 357-65. Обзор). Исходя из вышеописанного понимания, можно полагать, что ингибирующий эффект НА4 на снижение способности к передвижению/паралич затрагивает снижение экспрессии транстиретина, описанное выше.
Субстрат-2 рецептора фактора роста фибробластов является субстратом для рецепторов фактора роста фибробластов (GFG) и нервных факторов роста типа фактора роста нервов. Соответственно, увеличение количества субстрата-2 рецептора фактора роста фибробластов означает повышение чувствительности к нервному фактору роста, который экспрессируется при множественном склерозе (Caggiula M, Batocchi АР, FrisuIIo G, Angelucci F, Patanella AK, Sancricca C, Nociti V, Tonali PA, MirabeMa M. Neurotrophic factors and clinical recovery in relapsing-remitting multiple sclerosis. Scand. J. Immunol. 2005 Aug, 62(2): 176-82; Triaca P, Tirassa P, Aloe L. Presence of nerve growth factor and TrkA expression in the SVZ of EAE rats: evidence for a possible functional significance. Exp. Neurol. 2005,191(1): 53-64; Laudiero LB, Aloe L, Levi-Montalcini R, Buttinelli C, Schilter D, Gillessen S, Otten U. Multiple sclerosis patients express increased levels of beta-nerve growth factor in cerebrospinal fluid. Neurosci. Lett. 1992 Nov 23, 147(1): 9-12). Соответственно, можно полагать, что обработка НА4 обеспечивает такие эффекты нервных факторов роста, как ингибирование гибели нейронов, дифференцировка нейронов и рост аксонов, посредством которых и происходит подавление симптомов множественного склероза (Villoslada P, Genain СР. Role of nerve growth factor and other trophic factors in brain inflammation. Prog. Brain Res. 2004, 146: 403-14. Обзор; Gielen A, Khademi M, Muhallab S, OIsson T, Piehl F. Increased brain-derived neurotrophic factor expression in white blood cells of relapsing-remitting multiple sclerosis patients. Scand. J. Immunol. 2003, 57(5): 493-7; Villoslada P, Hauser SL, Bartke J, Unger J, Heald N, Rosenberg D, Cheung SW, Mobley WC, Fisher S, Genain CP. Human nerve growth factor protects common marmosets against autoimmune encephalomyelitis by switching the balance of T helper cell type 1 and 2 cytokines within the central nervous system. J. Exp. Med. 2000 15, 191(10): 1799-806; Boutros T, Croze E, Yong VW. Interferon-beta is a potent promoter of nerve growth factor production by astrocytes. J. Neurochem. 1997, 69(3): 939-66; Massaro AR, Soranzo C, Bigon E, Battiston S, Morandi A, Camevale A, Callegaro L. Nerve growth factor (NGF) in cerebrospinal fluid (CSF) from patients with various neurological disorders. Ital. J. Neurol. Sci. 1994, 15(2): 105-8; Althaus HH, Kloppner S, Schmidt-Schultz T, Schwartz P. Nerve growth factor induces proliferation and enhances fiber regeneration in oligodendrocytes isolated from adult pig brain. Neurosci. Lett. 1992 3,135(2): 219-23).
Ложный рецептор TRAIL без домена смерти проявляет конкурентное ингибирование связывания TRAIL со своим рецептором (Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R, Dixit VM. An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science 1997 8, 277(5327): 815-8). Соответственно, можно полагать, что НА4 ингибирует гибель нейронов и олигодендроцитов (миелина) посредством TRAIL через увеличение ложных рецепторов TRAIL без домена смерти (Urewicz A, Matysiak M, Andrzejak S, Selma) К. TRAIL-induced death of human adult oligodendrocytes is mediated by JNK pathway. Glia 2006 15,53(2):158-66).
Обзор
Эффекты НА4 на множественный склероз, спинномозговую травму и астму/аллергические заболевания
Как описано выше, при введении НА4 крысам на модели ЕАЕ (экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита), который является моделью множественного склероза, наблюдалось ингибирование неврологических симптомов.
Также на основании анализа тканей головного и спинного мозга крыс методом ДНК-матрицы, измерения митохондриального потенциала и анализа клеток К562 методом ДНК-матрицы и иммуноокрашивания синаптофизина/Нзр72 на модели спинномозговой травмы оказалось, что НА4 обладает (1) эффектом ингибирования воспаления и (2) эффектом улучшения нервной деятельности (ингибирования снижения нервной передачи) через эффект защиты синапсов, эффект ингибирования клеточной смерти олигодендроцитов (миелина) и ингибирование гибели нейронов/дифференцировку нейронов/прорастание аксонов (фиг.16).
При анализе методом ДНК-матрицы на клетках К562 наблюдалось ингибирование экспрессии IL-1β. Известно, что IL-1β является фактором, обостряющим спинномозговую травму (Yang L, Jones NR, Blumbergs PC, Van den Heuvel C, Moore EJ, Manavis J, Sarvestani GT, Ghabriel MN. Severity-dependent expression of pro-inflammatory cytokines in traumatic spinal cord injury in the rat. J. Clin. Neurosci. 2005 Apr, 12(3): 276-84). Вышеотмеченные эффекты НА4 (1) и (2) также способствуют ингибированию обострения/лечению при спинномозговой травме. Вышеприведенный факт указывает на терапевтический эффект НА4 и при спинномозговой травме.
При анализе методом ДНК-матрицы на клетках К562 отмечалось ингибирование экспрессии IL-5. Известно, что IL-5 является фактором, обостряющим аллергические заболевания типа астмы (Hamelmann E, Gelfand EW. IL-5-induced airway eosinophilia - the key to asthma? Immunol. Rev. 2001 Feb, 179: 182-91). Кроме того, эффект снижения транстиретина под действием НА4 способствует ингибированию обострения/лечению в случае астмы или аллергических заболеваний, так как он ведет к повышению продукции норадреналина и расширению бронхов. Вышеприведенный факт указывает на терапевтический эффект НА4 и при астме и аллергических заболеваниях (фиг.18).
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается терапевтического или профилактического средства от воспаления и дисфункции нервной системы, средства, ингибирующего экспрессию генов, связанных с цитокинами, хемокинами, средства, повышающего жизнеспособность нервных клеток, средства, повышающего синаптическую передачу и защищающего синапсы, а также способа лечения и дисфункции нервной системы. Активным компонентом средства является тетрасахарид гиалуронана НА4, содержащий 2 звена, при этом единичным звеном является D-глюкуроновая кислота-β-1,3-D-N-ацетилглюкозамин-β-1,4. Заявленное изобретение позволяет эффективно лечить и препятствовать развитию воспалительных заболеваний нервной системы. 7 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 табл., 18 ил.
Приоритет по пунктам:
| Способ приготовления мыла | 1923 |
|
SU2004A1 |
| E.V.Maytin et al | |||
| Hyaluroran Participates in the Epidermal Response to Disruption of Permeability Barrier in vivo., Am | |||
| J | |||
| Pathol., N | |||
| Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды | 1921 |
|
SU4A1 |
| Способ приготовления мыла | 1923 |
|
SU2004A1 |
| RU 98119391 A, 30.09.2000. | |||
