ШТАММ БАКТЕРИОФАГА BACTERIOPHAGUM SALMONELLAE, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОСАЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И УСТОЙЧИВОСТЬЮ К БАКТЕРИОСТАТИКАМ, И ПРОТИВОСАЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫЙ ПРЕПАРАТ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 C12N7/00 C12R1/42 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к фаговым препаратам для борьбы с сальмонеллезом.

Известно применение для борьбы с сальмонеллезом антибиотиков, химиопрепаратов, глюкокортикоидов, антигистаминных препаратов (Справочник практического врача. М. Медицина, 1982, с. 293).

Недостатком препаратов является значительное количество противопоказаний и побочных эффектов, слабая эффективность при профилактическом использовании.

Известны препараты бактериофагов сальмонелл, применяемые для профилактики и лечения (например, авт. св. ЧССР N 192122).

Недостатком препаратов является ограниченный спектр действия (не на все виды сальмонелл), низкая концентрация фаговых частиц, дороговизна.

Прототипом настоящего изобретения является фаговый препарат, получаемый по авт. св. ЧССР N 221104. Препарат выращивают, используя зараженный фагом штамм сальмонелл при 37^o на казеин-гидролизатовой питательной среде, содержащей 3,5% казеин-гидролизата, в течение 3-5 часов, после чего смешивают с альбумином в соотношении 10:1-2 сушат до влажности 7% Препарат используют в концентрации 1 г/л воды перорально в течение 2-3 дн при выпаивании животных. Животные выздоравливают через 48 ч. Длительность хранения препарата в жидком виде 3-4 мес.

Недостатками препарата и способов его применения является ограниченность применения: только культивируемый вид сальмонелл и, как следствие, невозможность профилактики, а также недостаточные сроки хранения препарата.

Задачей, стоявшей перед авторами, явилось создание фагового препарата, эффективного против различных видов сальмонелл, а также стабильного при хранении с различными бактериостатиками в течение длительного времени.

Задача была решена путем выделения бактериофага из сточных вод С. Петербурга и селекции его популяций выдержкой в течение 10-15 пассажей в присутствии 0,1 мг/мл метацида, 2,5 мг/мл ампициллина и 1 мг/мл хинозола.

Фаг Bacteriophagum salmonellae был депонирован в Коллекции ГосНИИ особо чистых биопрепаратов под номером СФ-17.

Штамм обладает следующими характеристиками. На электроннограммах морфология фага: головка гексогональной формы, размер 48-50 нм, хвостовой отросток 115-120 нм. Морфология негативных колоний на бактериальном хозяине: диаметр негативных колоний 3-5 нм, центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Спектр литической активности: бактериофаг лизировал 208 штаммов сальмонелл серологических групп A, B, C, D, E, из которых 3 штамма принадлежали к группе A, 26 штаммов к группе B, 10 штаммов к группе C₂, 21 штамма к группе C₁, 143 штамма к группе D₁, 5 штаммов к группе E₁.

Диапазон специфичности: лизирует сальмонеллы различных серологических групп, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки и другие представители нормальной микрофлоры. Не теряет активности в присутствии 1 мг/мл метацида, 2,5 мг/мл ампициллина, 1 мг/мл хирозола.

Бактериальные штаммы для поддержания и размножения сальмонеллезного бактериофага: Salmonella enteritidia штамм N 36. Оптимальные условия размножения бактериофага: среда аминопептид для микробиологических питательных сред, множественность заражения (бактерия/фаг) -1:5 1:10. Условия хранения: жидкий препарат бактериофага, приготовленный на аминопептиде хранят при температуре 2-8^oC. Периодичность посевов 1 год. Литическая активность (титр по Грациа) 10⁹-10¹⁰ бляшкообразующих единиц в 1 см³.

Способ размножения: размножается на штамме Salmonella enteritidis N 36 (группа D), соматический-О-антиген; рецепторы 1, 9, 12, жгутиковый антиген: рецепторы g, m.

Биологическая активность: лизирует сальмонеллы групп A, B, C, D, E. Безвредность проверялась на мышах при внутрикожном введении цельного препарата и на птицах при пероральном и аэрозольном применении. Препарат безвреден (LD₅₀ не достигнута).

Способ хранения: хранится в жидком и лиофильно высушенном виде при +2 - +10^oC. Срок хранения 1 г.

Для практического использования на базе нового фага был создан препарат, отличающийся высокой эффективностью при аэрозольном применении и стабильный при хранении с различными бактериостатиками, что является особо важным в условиях дефицита реагентов для микробиологических целей.

Препарат содержал на 1 мл фильтрата культурной жидкости: фаг СФ-17 - 10⁸-10¹⁰ частиц, бактериостатик 0,1-2,5 мг, аминопептид - остальное.

В качестве бактериостатиков использовались ампициллин в концентрации 1-2,5 мг/мл, хинозол в концентрации 0,1-1 мг/мл, метацид в концентрации 0,2-1 мг/мл или их смеси.

Более высокие концентрации бактеристатиков снижают эффективность фага, более низкие не гарантируют отсутствие проростов.

Концентрация фага менее 10⁸ частиц/мл не обеспечивает достаточной эффективности. Концентрацию фага более 10¹⁰ частиц/мл получить не удалось.

Фаговый препарат может использоваться как аэрозольно, так и перорально.

Оптимальными условиями использования препарата для профилактики и лечения птиц является сочетание аэрозольного и перорального способов введения. Аэрозольная обработка осуществляется разведением препарата до содержания фага не менее 10⁸ частиц на мл и обработкой в течение 20-30 мин, а пероральная добавлением препарата в питье из расчета не менее 10⁶ частиц на голову птицы. Вместе с тем возможно использование одного из указанных способов в качестве самостоятельного для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц.

Использование препарата в больших дозах или обработка в течение более длительного времени не дает дополнительного эффекта.

Указанный штамм, композиция препарата на его основе в литературе не описан, что свидетельствует о его соответствии критерию "новизна".

Новые свойства штамма лизирование сальмонелл пяти групп при отсутствии негативного эффекта при стабильности в присутствии вышеуказанных консервантов, создание композиции, позволяющей сохранять препарат практически без потери активности в жидкой форме в течение по крайней мере 1-1,5 лет, эффективность воздействия свидетельствует о получении эффекта, позволяющего решить задачу, стоящую перед учеными, разрабатывающими методы борьбы с одним из самых серьезных и распространенных заболеваний животных и птиц сальмонеллезом, и до настоящего времени ими не достигнутого, что подтверждает наличие у данной группы изобретений соответствия критерию "изобретательский уровень".

Препарат прошел успешные испытания на ряде птицефабрик Московской и Ленинградской области.

Объединение вышеописанных изобретений в единую группу обусловлено их подчинению единому изобретательскому замыслу созданию методов борьбы с сальмонеллезом, а также единой основой отдельных изобретений новым штаммом фактериофага СФ-17, что сделало возможным их производство и использование.

Сущность и преимущество изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение препарата бактериофага.

3 л аминопептида для микробиологических питательных сред растворяют в 9 л воды при перемешивании до полной прозрачности. Для получения матричной расплодки фага в бутыль, содержащую аминопептидный бульон, вносят бульонную культуру сальмонелл 16-18-часового роста и бактериофаг СФ-17 из расчета 2 см³ бульонной культуры и 2-3 см³ фага на 1 л среды и выдерживают в течение 4-8 ч при 37-38^oC при периодическом перемешивании до полного просветления раствора, после чего в препарат добавляют раствор метацида до концентрации 0,2-1 мг/мл, или раствор хинозола до конечной концентрации 0,1-1 мг/мл, или раствор ампициллина до 1-2,5 мг/мл. Полученный препарат выдерживают 5 сут при температуре 37-38^oC для выявления возможной контаминации, фильтруют и расфасовывают по флаконам по 10 см³.

Испытание противосальмонеллезной эффективности препарата бактериофага проводили на птицефабрике производственного объединения "Синявинское" (Ленинградская область) в девятиэтажных корпусах.

Пример 2. Опыты по хранению препаратов, содержащих различные бактериостатики.

Препарат бактериофага СФ-17 с содержанием частиц 10¹⁰ с различными количествами бактериостатиков хранился 18 месяцев при температуре +4±2^oC.

Результаты сохранения активности препарата приведены в таблице.

Пример 3. Аэрозольное применение сальмонеллезного бактериофага на выводе (в выводном шкафу).

1 флакон препарата сальмонеллезного фага (10 мл препарата содержат 10 тысяч доз) разводят водой до 500 мл. Аэрозольную обработку осуществляют с помощью генератора САГ. Объем жидкости, переводимой в аэрозоль, должен составлять 5 мл (5•10⁹ частиц фага) на 1 м³ выводного шкафа. Время экспозиции 20 минут. В опыте в контроле использовали по 20,5 тысяч голов птицы в возрасте от 1 до 39 дн. При этом были получены следующие результаты: в опытной партии птиц падеж составлял 0,86% в контрольной 2,84% Таким образом, кратность увеличения выживаемости обработанных птиц составила 3 раза.

Пример 4. Пероральное применение сальмонеллезного бактериофага.

Препарат спаивали через желобковые поилки в течение 6 суток, начиная с 1 сут в количестве 0,5 дозы на цыпленка (10⁸ частиц фага). Перед употреблением препарат разводили водой из расчета содержания 1 дозы препарата в 1 мл.

Для обработки 20 тысяч голов 1 флакон препарата разводили в 10 л воды. Возраст птицы тот же, что в примере 3. В результате пероральной обработки 20,5 тысяч голов птиц через поилки получены следующие результаты: в опытной партии падеж птицы составил 1,9% в контроле 3% а кратность увеличения выживаемости птицы в опыте составила 1,5 раза.

Пример 5. Сочетанная аэрозольно-пероральная обработка птицы проводилась в условиях обработки, указанной в примерах 3, 4. Число птиц 20 тысяч.

В результате сочетанной обработки падеж птицы составил 0,8% в контроле - 2,3% а кратность увеличения выживаемости в опыте 3,5 раза.

Таким образом, наиболее эффективным способом оказалась сочетанная аэрозольно-пероральная обработка птиц, начиная с односуточного возраста. Как показали приведенные результаты, использование препарата СФ-17 позволяет эффективно осуществлять профилактику и лечение птиц, обработку яиц и т.п. методы борьбы с сальмонеллезом.

Выпуск препарата осуществляется АО "БИОТЕХ" с 1993 года.

Использование: микробиология. Сущность изобретения: штамм бактериофага выделен из сточных вод С.Петербург. Штамм Bacteriophagum salmonellae, депонированный в Коллекции Гос. НИИ ОЧБ под шифром СФ-17, обладает лизирующей активностью по отношению к самльмонеллам всех 5 групп, а также устойчив к действию бактериостатиков, таких как метацид, ампициллин, хинозол. Препарат на основе бактериофага имеет следующий состав ингредиентов в 1 мл препарата: фаг СФ-17 - 10⁸-10¹⁰ частиц, бактериостатик - 0,1-2,5 мг, аминопептид - остальное. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae ГосНИИ особо чистых биопрепаратов NСФ-17, обладающий противосальмонеллезной активностью и устойчивостью к бактериостатикам. 2. Противосальмонеллезный препарат, содержащий бактериофаг, компоненты питательной среды и добавки, отличающийся тем, что в качестве бактериофага используют бактериофаг по п.1, в качестве компонентов питательной среды - аминопептид, а в качестве добавок бактериостатик при следующем содержании ингредиентов в мл препарата:
Бактериофаг Bacteriophagum salmonellae ГосНИИ особо чистых биопрепаратов NСФ-17 10⁸ 10¹⁰ частиц
Бактериостатик 0,1 2,5 мг
Аминопептид Остальное
3. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что в качестве бактериостатика используют метацид в конечной концентрации 0,2 1 мг/мл. 4. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что в качестве бактериостатика используют ампициллин в конечной концентрации 1 2,5 мг/мл. 5. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что в качестве бактериостатика используют хинозол в концентрации 0,1 1 мг/мл. 6. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что в качестве бактериостатика используют смесь, содержащую по крайней мере два вещества из группы, содержащей метацид, хинозол и ампициллин.