ШТАММ БАКТЕРИОФАГА SALMONELLA TYPHIMURIUM S-394, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2011 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине, а именно к штаммам для создания профилактических и лечебных биологических препаратов против сальмонеллеза и других бактериальных инфекций, а также может быть использовано для борьбы с носительством возбудителей сальмонеллезных инфекций у животных, что является необходимым условием при производстве экологически чистых продуктов питания человека.

Патогенные микроорганизмы - основная причина многих заболеваний человека. До сих пор в борьбе с этими бактериями используют антибиотики, но высокая устойчивость микроорганизмов к ряду антибиотиков не дает ощутимых результатов.

Бактериофаги привлекают внимание ученых как новые антимикробные агенты, способные строго специфично воздействовать на определенные группы бактерий, снижая их численность на несколько порядков. Фаги строго специфичны к составу пептидогликанов клеточной стенки данной бактерии. На этой специфичности и базируется их возможное применение как терапевтических агентов для контроля широкого круга патогенов, таких как Escherichia coli, Salmonella, Shigella.

Известен штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae СФ-17, выделенного из сточных вод в г. С.-Петербурге и полученного селекцией его популяций выдержкой в течение 10-15 пассажей в присутствии 0,1 мг/мл метацида, 2,5 мг/мл ампициллина и 1 мг/мл хинозола (патент РФ №2080384, МПК C12N 7/00, опубл. 27.05.1997). Фаг Bacteriophagum salmonellae депонирован в Коллекции ГосНИИ особо чистых биопрепаратов под номером СФ-17. Спектр литической активности: бактериофаг лизировал 208 штаммов сальмонелл серологических групп А, В, С, D, Е, из которых 3 штамма принадлежали к группе А, 26 штаммов - к группе В, 10 штаммов - к группе С₂, 21 штамм - к группе С₁, 143 штамма - к группе D₁, 5 штаммов - к группе E₁. Диапазон специфичности: лизирует сальмонеллы различных серологических групп, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки и других представителей нормальной микрофлоры. Не теряет активности в присутствии 1 мг/мл метацида, 2,5 мг/мл ампициллина, 1 мг/мл хинозола.

Однако штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae СФ-17 обладает недостаточно широким спектром литической активности, в частности не лизирует бактерии родов Escherichia coli и Shigella.

Известен штамм бактериофага Bacteriophagum salmonella IBP-1, обладающий лизирующей активностью по отношению к S.enteritidis (патент РФ №2342429, МПК C12N 7/00, опубл. 27.12.2008 г.). Штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae IBP-1 выделен из сточных вод гусеводческого хозяйства и депонирован в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова (СПбГМА им. И.И.Мечникова) под №0048. Фаг обладает способностью лизировать 47% культур штамма S.enteritidis. Диапазон специфичности: лизирует S.enteritidis, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки, синегнойной палочки и штаммы других представителей нормальной микрофлоры.

Однако штамм бактериофага Bacteriophagum salmonella IBP-1 также обладает недостаточно широким спектром литической активности, в частности не лизирует бактерии родов Escherichia coli и Shigella.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм бактериофага EPS7, обладающий литической поливалентной активностью по отношении к бактериям Salmonella typhimurium и Е. coli, выделенный южно-корейскими исследователями (Federation of European Microbiological Societies (FEMS) Microbiol. Lett. 289 (2008), 202-209). Существенной отличительной особенностью заявляемого бактериофага S-394 по сравнению с прототипом является более широкий спектр литической активности в отношении патогенных микроорганизмов.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение бактериофага Salmonella typhimurium S-394 с более широким спектром литической активности в отношении грамотрицательных патогенных микроорганизмов - Escherichia coli, Salmonella и Shigella, обусловленной действием содержащегося в нем бактериолитического фермента.

Указанный технический результат достигается получением штамма бактериофага Salmonella typhimurium S-394, который содержит бактериолитический фермент и обладает литической активностью по отношению к бактериям вида Escherichia coli, штаммам Salmonella typhimurium ТА 1537 и Salmonella typhimurium ТА 100 и штаммам Shigella sonnei 32 и Shigella flexneri Ad.

Заявляемый бактериофаг Salmonella typhimurium (авторское название S-394) выделен стандартным методом - путем высева образцов стоков в суспензию бактериальной культуры Salmonella typhimurium в L-бульоне (1% триптона, 0,5% дрожжевого гидролизата, 1% NaCl) с последующим выделением фага из единичных пятен лизиса на агаризованной поверхности (0,6% агар в L-бульоне).

Штамм был идентифицирован по морфологическим признакам (электронная микроскопия) и рестрикционному анализу ДНК. Показано, что данный бактериофаг относится к роду Caudovirales сем. Siphoviridae Т5-подобный фаг. Вирион бактериофага обладает бинальным типом симметрии, состоит из икосаэдрической головки и длинного хвостового отростка, диаметр головки составляет 75-80 нм, длина хвостовой части - 200-220 нм. Геном бактериофага представлен двуцепочечной ДНК с молекулярным весом около 112000. Плотность фага в CsCl - 1,5 г/см³.

Штамм бактериофага Salmonella typhimurium S-394 депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) под номером Ph-1240.

Исследование заявляемого бактериофага на инфекционность (литическую активность) осуществлялась по методике Миллера [Miller R.V. (1998) Methods for enumeration and characterization of bacteriophages from environmental samples, in Techniques in microbial ecology. pp.218-235]. Чувствительные штаммы определяли благодаря способности бактериофага образовывать негативные пятна лизиса на газонах из этих штаммов. В процессе работы отобрали и проанализировали 19 штаммов бактерий родов Escherichia, Salmonella, Shigella. Показано, что бактериофаг Salmonella typhimurium S-394 лизирует все 9 взятых штаммов Escherichia coli, 4 штамма Shigella подгруппы В и Д и 3 из 6 штаммов Salmonella typhimurium.

При посеве на газоне из чувствительной культуры в течение 18-20 часов культивирования при 37°С бактериофаг формирует негативные прозрачные округлые пятна лизиса, диаметр которых составляет от 1 до 3 мм.

Заявляемый бактериофаг S-394 сохраняет инфекционность при рН от 6,6 до 7,6, оптимальная температура для развития фага (инфекции) от 35 до 38°С. Для определения оптимальных условий культивирования бактериофага с получением максимального выхода фаговых частиц использовали среды с интервалом рН от 5.0 до 9.0, температуру инкубирования изменяли от 26 до 40°С.

В работе мы использовали ампициллин-устойчивые бактериальные культуры, поэтому были проведены эксперименты по сравнению литической активности бактериофага S-394 при развитии инфекции на антибиотик-устойчивых и чувствительных бактериальных культурах. Показано, что динамика развития бактериофага S-394 на Salmonella typhimurium TA1537 и Salmonella typhimurium ТА100 (25 мкг/мл ампициллина) незначительно отличается в обоих случаях (см. таблицу 1). Это подтверждает возможность применения фага S-394 для лизиса ампициллин-устойчивых бактериальных культур. Оптическая плотность (О.П.) суспензии бактерии определяется при длине волны 560 нм, титр бактериофага

Таблица 1 Динамика развития бактериофага S-394 на антибиотикоустойчивых и чувствительных бактериях Бактерии-субстрат 0 мин 60 мин 120 мин О.П. бое/мл О.П. бое/мл О.П. бое/мл E.coli АВ-259, контроль 0,94 0 1,50 0 2,46 0 E.coli АВ-259, образец 1 0,94 1.2×10⁸ 0,71 4.2×10⁸ 0,45 2.8×10¹⁰ Salmonella typhimurium TA1537, контроль 0,88 0 1,66 0 3,22 0 Salmonella typhimurium ТА1537, образец 2 0,88 0.9×10⁸ 0,58 3.1×10⁸ 0,32 4.4×10¹⁰ Salmonella typhimurium ТА100, контроль 0,92 0 1,53 0 2,8 0 Salmonella typhimurium ТА100, образец 3 0,92 1.1×10⁸ 0,61 4.7×10⁸ 0,29 3.2×10¹⁰

Контроль - 50 мл суспензии бактерий E.coli, Salmonella typhimurium TA1537, Salmonella typhimurium TA100; образец 1 - 50 мл суспензии бактерий E.coli +0,5 мл фаголизата S-394; образец 2 - 50 мл суспензии бактерий Salmonella typhimurium ТА1537+0,5 мл фаголизата S-394; образец 3 - 50 мл суспензии бактерий Salmonella typhimurium TA100+0,5 мл фаголизата S-394. Фаголизат с титром 1.2×10¹⁰ бое/мл.

При обработке фаговых частиц 0.5% и 1% растворами SDS инфекционность фага не изменяется, при прогреве 50°С 3 мин титр инфекционного фага не изменяется, при прогреве 70°С 3 мин титр инфекционного фага уменьшается в 10 раз, что видно из таблицы 2.

Таблица 2 Данные по исследованию инфекционной активности бактериофага S-394 Образец Проба №1 Проба №2 Контроль 7,0×10⁹ бое/мл 4,0х10⁷ бое/мл 0,5% SDS 7,0×10⁹ бое/мл 1,0х10⁷ бое/мл 1,0% SDS 5,0×10⁹ бое/мл 1,0×10⁷ бое/мл 50°С, 3 мин 4,0×10⁹ бое/мл 3,5×10⁷ бое/мл 70°С, 3 мин 3,5×10⁸ бое/мл 6,0×10⁶ бое/мл

Бактериофаг S-394 размножали путем инфицирования бактерий Salmonella typhimurium или Escherichia coli AB-259, находящихся в логарифмической фазе роста в L-бульоне, с множественностью 0,1-1 фаговая частица на клетку, с дальнейшим инкубированием при 37°С, 180 об/мин, 16-20 часов. В обоих случаях урожай фага составляет 7,0 - 9,0×10¹⁰ бое/мл. Заявляемый бактериофаг S-394 характеризуется высокой урожайностью и скоростью роста.

Необходимо отметить, что высокий урожай бактериофага S-394 можно получать на условно патогенном штамме Escherichia coli AB-259, что безопасно при масштабных культивированиях для создания препаратов на основе этого бактериофага для ветеринарии против Escherichia coli, Salmonella, Shigella, а также для уничтожения и предотвращения больничных инфекций.

Хранение: фосфатный буфер рН 6.8 с 30% глицерина - температура хранения минус 64°С; лиофильное высушивание в сахарозо-желатиновой среде - температура хранения минус 20°С.

Расконсервация: инфицирование бактерий Salmonella typhimurium и Escherichia coli AB-259 в L-бульоне с высокой множественностью (8-20 фаговых частиц/клетка).

Применение: новый антимикробный агент, способный специфично воздействовать на определенные группы бактерий, для профилактики и лечения широкого круга заболеваний, вызываемых Escherichia coli, Salmonella, Shigella.

Пример. Исследование спектра антибактериальной литической активности бактериофага S-394

Штамм бактериофага S-394 обладает высокой литической активностью в отношении многих патогенных микроорганизмов. Лизис культуры интактным фагом определяли по наличию негативных пятен (бляшек) на газоне соответствующей бактериальной культуры. Бактериофаг хорошо инфицирует и бактерии, растущие в бульоне. Причем титр фаговых частиц в лизате достаточно высок - до 10¹⁰ фаговых частиц на миллилитр.

В таблице 3 приведены данные по исследованию активности бактериофагов, в том числе заявляемого S-394. Из таблицы 3 видно, что заявляемый бактериофаг S-394 инфицирует и разрушает бактерии нескольких родов Escherichia coli, Salmonella, Shigella, что не специфично для других фагов.

Заявляемый бактериофаг S-394 инфицирует и разрушает бактерии, находящиеся на разных стадиях роста. При инфицировании бактерий, находящихся в логарифмической стадии роста, наблюдается более быстрый и глубокий лизис бактерий (падение титра бактерий на два порядка за 30 мин), а при инфицировании бактерий, находящихся в стационарной фазе роста, титр бактерий уменьшается в 10 раз за 30 мин. В таблице 4 представлены данные по исследованию лизирующей активности заявляемого штамма бактериофага S-394 в отношении бактерий, находящихся в разных фазах роста.

Контроль - 15 мл суспензии бактерий E.coli + 1 мл буфера; образец 1 - 15 мл суспензии бактерий Е. coli + 1 мл фаголизата S-394; образец 2 - 15 мл суспензии бактерий E.coli + 1 мл фаголизата S-394; контроль - 15 мл суспензии бактерий Salmonella typhimurium + 1 мл буфера; образец 3 - 15 мл суспензии бактерий Salmonella typhimurium + 1 мл фаголизата S-394; образец 4 - 15 мл суспензии бактерий Salmonella typhimurium + 1 мл фаголизата S-394. Фаголизат с титром 1.2×10¹⁰ бое/мл.

Таким образом, приведенные выше экспериментальные данные (таблицы 1-4) подтверждают наличие у заявляемого бактериофага Salmonella typhimur S-394 более широкого спектра литической активности в отношении живых патогенных грамотрицательных бактерий, среди которых Escherichia coli, Salmonella, Shigella.

Лизис бактериальной культуры возможен и в логарифмической, и в стационарной фазах роста в отличие от известных аналогов и прототипа.

Таблица 4 Данные по исследованию лизирующей активности заявляемого штамма Бактерии-субстрат Оптическая плотность суспензии бактерии при длине волны 560 нм 0 30 мин 60 мин 120 мин E.coli АВ-259, контроль 0.91 1.55 2.08 2.94 E.coli АВ-259, образец 1 0.91 0.41 0.35 0.28 E.coli АВ-259, образец 2 4.96 3.44 2.36 1.27 Salmonella typhimurium ТА100, контроль 1.08 1.88 2.56 3.33 Salmonella typhimurium ТА100, образец 3 1.08 0.94 0.33 0.21 Salmonella typhimurium ТА100, образец 4 3,64 2,16 2,06 0,85

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине, а именно к штаммам для создания профилактических и лечебных биологических препаратов против сальмонеллеза и других бактериальных инфекций. Штамм бактериофага Salmonella typhimurium S-394 депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) под номером Ph-1240. Штамм обладает поливалентной литической активностью по отношению к бактериям родов Escherichia coli, штаммам Salmonella ТА 1537 и Salmonella ТА 100 и штаммам Shigella sonnei 32 и Shigella flexneri Аd. При этом высокий урожай бактериофага S-394 можно получать на условно патогенном штамме Escherichia coli AB-259, что безопасно при масштабных культивированиях для создания препаратов для ветеринарии против Escherichia coli, Salmonella и Shigella, а также для уничтожения и предотвращения больничных инфекций. Изобретение обеспечивает более широкий спектр литической активности в отношении грамотрицательных патогенных микроорганизмов Escherichia coli, Salmonella и Shigella, обусловленный действием содержащегося в нем бактериолитического фермента. 4 табл.

Штамм бактериофага Salmonella typhimurium S-394, обладающий литической активностью по отношению к бактериям вида Escherichia coli, штаммам Salmonella typhimurium ТА 1537 и Salmonella typhimurium ТА 100 и штаммам Shigella sonnei 32 и Shigella flexneri Ad., обусловленной действием содержащегося в нем бактериолитического фермента, и депонированный в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под номером Ph-1240.