ШТАММ БАКТЕРИОФАГА BACTERIOPHAGUM SALMONELLAE ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОСАЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО ПРЕПАРАТА, ПРОТИВОСАЛЬМОНЕЛЛЕЗНЫЙ ПРЕПАРАТ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА Российский патент 1995 года по МПК C12N7/00 A61D7/00 C12N7/00 C12R1/42 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, а именно к фаговым препаратам и их применению для борьбы с сальмонеллезом.

Известно применение для борьбы с сальмонеллезом антибиотиков, глюкокортикостероидов, антигистаминных препаратов [1]
Недостатком препаратов является значительное количество противопоказаний и побочных эффектов, слабая эффективность при профилактическом использовании.

Известны препараты бактериофагов сальмонелл, применяемые для профилактики и лечения [2]
Недостатками препаратов являются ограниченный спектр действия (не на все виды сальмонелл), дороговизна.

Прототипом изобретения является фаговый препарат, получаемый по авт. св. ЧССР N 221104. Препарат выращивают, используя зараженный фагом штамм сальмонеллы культивированием при 37^оС на казеин-гидролизатовой жидкой питательной среде, содержащей 3,5% казеин-гидролизата, в течение 3-5 ч, после чего смешивают с альбумином в соотношении 10:1-2, сушат до влажности 7% Препарат используют в концентрации 1 г/л воды перорально в течение 2-3 дней при выпаивании животных. Животные выздоравливают через 48 ч.

Длительность хранения препарата в жидком виде 3-4 месяца.

Недостатками препарата и способов его применения является ограниченность применения только культивируемый вид сальмонелл и, как следствие, невозможность профилактики.

Задачей изобретения являлось создание более эффективного препарата против сальмонеллеза и способа его применения.

Данная задача была решена использованием выделенного в 1990 г. из сточных вод (С-Петербург) бактериофага Bacteriop- hagum salmonellae, депонированного в коллекции НИИ особо чистых биопрепаратов под номером СФ-1/36.

Штамм обладает следующими характеристиками. На электронно-граммах морфология фага: головка гексагональной формы, размер ≈53 нм, хвостовой отросток ≈110 нм. Морфология негативных колоний на бактериональном хозяине: диаметр негативных колоний 3-4 мм, центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Спектр литической готовности: бактериофаг лизировал 196 штаммов сальмонелл серологических групп A, B, C, D, E, из которых 1 штамм принадлежал к группе A, 26 штаммов к группе B, 8 штаммов в группе C₂, 21 штамм к группе C₁, 137 штаммов к группе D₁, 5 штаммов к группе E₁.

Диапазон специфичности: лизирует сальмонеллы различных серологических групп, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки и другие представители нормальной микрофлоры.

Бактериальный штамм для поддержания и размножения сальмонеллезного бактериофага Salmonella enteritidis штамм N 36. Оптимальные условия размножения бактериофага: среда аминопептид для микробиологических питательных сред, множественность заражения 1:5 1:10. Условия хранения: жидкий препарат бактериофага, приготовленный на аминопептиде, хранят при температуре 2-8^оС. Периодичность пересевов 1 год. Литическая активность (титр по Грациа) 10⁹ 10¹⁰ бляшкообразующих единиц в 1 см³.

Способ размножения: размножается на штамма Salmonella enteritidis N 36 (группа Д), соматический-0-антиген; рецепторы 1, 9, 12; жгутиковый антиген: рецепторы g, m.

Биологическая активность: лизирует сальмонеллы групп A, B, C, D, E. Безвредность проверялась на мышах при внутрикожном введении цельного препарата и на птицах при пероральном и аэрозольном применении. Препарат безвреден (ЛД₅₀ не достигнута).

Способ хранения: хранится в жидком и лиофильно высушенном виде при 2 10^оС. Срок хранения 1 год.

Для практического использования препарата на базе штамма была создана композиция, обладающая повышенной эффективностью как при аэрозольном, так и при пероральном введении, а также стабильностью при хранении. Композиция имеет следующий состав (на 1 мл раствора):
аминопептид 0,2 0,5 г,
фаг СФ-1/36 10⁶ 10¹⁰ частиц,
хинозол 10^-3 10^-4 г,
растворитель (вода или физраствор) остальное.

Более концентрированного фагового препарата в настоящее время получить не удалось, концентрация менее 10⁶ делает препарат неэффективным. При более низких концентрациях аминопептида и хинозола не удается добиться стабильности препарата, при более высоких концентрациях препарат теряет гомогенность.

Оптимальным условием использования препарата для профилактики и лечения птиц является сочетание аэрозольного и перорального способов введения. Аэрозольная обработка осуществляется разведением препарата до содержания фага не менее 10⁸ частиц на 1 мл и обработкой в течение 20 мин, лучше 25-30 мин, а пероральная добавлением препарата в питье из расчета не менее 10⁶ частиц на голову птицы. Вместе с тем возможно использование одного из указанных способов в качестве самостоятельного для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц.

Использование препарата в больших дозах или обработка в течение более длительного времени не дает дополнительного эффекта.

Указанный штамм, композиция препарата на его основе и способ применения в литературе не описаны, что свидетельствует о их соответствии критерию "Новизна".

Новые свойства штамма лизирование сальмонелл 5 групп при отсутствии негативного эффекта, создание композиции, позволяющей сохранять препарат в жидкой форме в течение по крайней мере 1 года, эффективность воздействия свидетельствуют о получении эффекта, давно стоявшего перед учеными, разрабатывающими методы борьбы с одним из самых серьезных и распространенных заболеваний животных и птиц сальмонеллезом, и до настоящего времени ими не достигнутого, что подтверждает наличие у данной группы изобретений соответствия критерию "изобретательский уровень".

Препарат прошел успешные испытания на ряде птицефабрик Московской и Ленинградской области.

Объединение вышеописанных изобретений в единую группу обусловлено их подчинению единому изобретательскому замыслу созданию методов борьбы с сальмонеллезом, а также единой основой отдельных изобретений новым штаммом бактериофага СФ-1/36, создание которого сделало возможным их создание и использование.

П р и м е р 1. Получение препарата бактериофага.

3 л "аминопептида для микробиологических питательных сред" растворяют в 9 л воды при перемешивании до полной прозрачности. Для получения матричной расплодки фага в бутыль, содержащую аминопептидный бульон, вносят бульонную культуру сальмонелл 16-18-часового роста и бактериофаг СФ-1/36 из расчета 2 см³ бульонной культуры и 2-3 см³ фага на 1 л среды и выдерживают в течение 4-8 ч при 37-38^оС при периодическом перемешивании до полного просветления раствора, после чего в препарат добавляют 1%-ный раствор хинозола до конечной концентрации 0,01-0,1% в зависимости от концентрации фага. (Оптимальное соотношение 10 см³ 1%-ного раствора хинозола на 1 л фага). Полученный препарат выдерживают 5 сут при температуре 37-38^оС для выявления возможной констаминации, фильтруют и расфасовывают по флаконам по 10 см³.

Испытание противосальмонеллезной эффективности препарата бактериофага проводили на птицефабрике производственного объединения "Синявинское" (Ленинградская область) в девятиэтажных корпусах.

П р и м е р 2. Аэрозольное применение сальмонеллезного бактериофага на выводе (в выводном шкафу).

1 флакон препарата сальмонеллезного фага (10 мл препарата содержат 10 тыс. доз) разводят дистиллированной водой до 500 мл. Аэрозольную обработку осуществляют с помощью генератора САГ. Объем жидкости, переводимой в аэрозоль, должен составлять 5 мл (5˙10⁹ частиц фага) на 1 м³ выводного шкафа. Время экспозиции 20 мин. В опыте и контроле использовали по 20,5 тыс. голов в возрасте от 1 до 39 дней. При этом были получены следующие результаты. В опытной партии птиц падеж составлял 1,56% в контрольной 2,84% Т.о. кратность увеличения выживаемости обработанных птиц составила 1,82 раза.

П р и м е р 3. Пероральное применение сальмонеллезного бактериофага.

Препарат спаивали через желобковые поилки в течение 6 сут. начиная с 1 сут. в количестве 0,5 дозы (106 частиц фага) на цыпленка. Перед употреблением препарат разводили дистиллированной водой из расчета содержания 1 дозы препарата в 1 мл.

Для обработки 20 тыс. голов 1 флакон препарата разводили в 10 л воды. Возраст птицы тот же, что в примере 2. В результате пероральной обработки 20,5 тыс. птиц через поилки получены следующие результаты.

В опытной партии падеж птицы составил 2,34% в контроле 2,99% а кратность увеличения выживаемости птицы в опыте составила 1,27 раза.

П р и м е р 4. Сочетанная аэрозольно-пероральная обработка птицы проводилась в условиях обработки, указанной в примерах 2, 3. Число птиц 20 тыс.

В результате сочетанной обработки падеж птицы составил 1,04% в контроле 2,29% а кратность увеличения выживаемости в опыте 2,2 раза.

Т. о. наиболее эффективным способом оказалась сочетанная аэрозольно-пероральная обработка птиц, начиная с односуточного возраста.

Как показали приведенные результаты, использование препарата на основе бактериофага СФ-1/36 позволяет эффективно осуществлять профилактику и лечение птиц, обработку яиц и т.п. методы борьбы с сальмонеллезом.

Выпуск препарата осуществляется ТОО "РУТ-К" с 1992 г.

Использование: микробиология, а именно бактериофаговые препараты. Сущность изобретения: выделен штамм бактериофага, зарегистрированный в коллекции НИИ ОЧБ за номером СФ-1/36, препарат для профилактики и лечения сальмонеллеза, содержащий на 1 мл водного раствора 10⁶-10¹⁰ фага, 10^-3-10^-4 г хинозола, 0,2-0,5 г аминопептида. Препарат используют перорально, введением в питье не менее 10⁶ частиц фага в сутки или аэрозольно, обрабатывая зараженный объект водным раствором, содержащим не менее 10⁸ частиц на 1/мл, распыляя последний или комбинируя оба способа. Использование изобретения на птицефермах позволило снизить падеж птиц на 20-100%. 3 с.п. ф-лы.

1. Штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae НИИ 04Б СФ-1/36 для получения противосальмонеллезного препарата. 2. Противосальмонеллезный препарат, содержащий фаг Bacteriophagum salmonellae, остатки питательной среды, добавки, воду или физраствор, отличающийся тем, что в качестве фага используют Bacteriophagum salmonellae НИИ 04Б СФ-1/36, из остатков питательной среды аминопептид, а в качестве добавки хинозол при следующем соотношении компонентов на 1 мл препарата:
Штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae НИИ 04Б СФ-1/36 10⁶ 10¹⁰ частиц
Аминопептид 0,2 0,5 г
Хинозол 10^-3 10^-4 г
Вода и физраствор Остальное
3. Способ профилактики и лечения сальмонеллеза, включающий введение фагового препарата птице, отличающийся тем, что из препаратов используют препарат, содержащий следующие компоненты на 1 мл препарата:
Штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae НИИ 04Б СФ-1/36 10⁶ 10¹⁰ частиц
Аминопептид 0,2 0,5 г
Хинозол 10^-3 10^-4 г
Вода и физраствор Остальное
препарат вводят аэрозольно или перорально, для аэрозольного введения используют препарат с содержанием фага не менее 10⁸ частиц на 1 мл, при этом распыление препарата проводят в течение по крайней мере 20 мин, а для перорального введения препарат используют в концентрации 10⁶ фаговых частиц в сутки.