ПРЕПАРАТ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ГОЛУБЕЙ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ГОЛУБЕЙ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/112 C12N1/02 A61P31/04 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии. Целью изобретения является создание препарата для эффективного лечения сальмонеллеза голубей, вызванного Salmonella typhimurium.

Среди бактериальных инфекций голубей сальмонеллез занимает одно из ведущих мест. Гибель голубей от этой инфекции может достигать 20-25%, а молодняка - до 80% (Гусев Вал.В., Гусев Вик.В. Сальмонеллезная инфекция у голубей / Птицеводство №5; 2003. - С.48-53). Заболевание наносит значительный ущерб, заключающийся помимо потерь от гибели птицы в отставании в росте и развитии переболевших голубей, снижении оплодотворяемости яиц, потере спортивных, служебных и декоративных качеств. Больные и переболевшие дикие и домашние голуби являются возможным источником инфицирования сельскохозяйственной птицы, животных и токсикоинфицирования человека.

Сальмонеллез голубей наиболее часто вызывают сальмонеллы серогруппы В, относящиеся к сероварианту Salmonella typhimurium. S. typhimurium является основным возбудителем сальмонеллеза уток, гусей (80-90%) (Осидзе Д.Ф. Биологические и химиотерапевтические средства профилактики и лечения заболеваний продуктивных животных / Сб. ст. ВГНКИ, 1983. - 122 с.) и одним из основных серовариантов, вызывающих пищевые токсикоинфекции человека (Гусев В.В. Разработка технологии производства вакцины против сальмонеллеза голубей. Дис. на степ. канд. биол. наук, Оболенск, 2005 г. - С.48-53).

Система мероприятий по лечению сальмонеллеза голубей предусматривает проведение общих ветеринарно-санитарных мероприятий, применение различных антимикробных средств и пробиотических препаратов. Однако данные мероприятия не всегда эффективны, так как у сальмонелл быстро развивается резистентность к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Бесконтрольное применение антибиотиков способствует усугублению ситуации и селекции антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов.

Среди мер специфической профилактики сальмонеллеза голубей основная роль принадлежит вакцинации. Но, к сожалению, большинство существующих в нашей стране вакцин против сальмонеллеза птиц не пригодны для голубей из-за различия в антигенном составе вакцин для промышленного птицеводства и голубеводства (первые - на основе штаммов S. enteritidis и S. gallinarum-pullorum, в то время как основной серовариант сальмонелл, вызывающий сальмонеллез голубей, относится к серогруппе В - S. typhimurium (Georgiades G.K. Prevalence of Salmonella in pigeon, canaries and psittacines, 53 (2), 2002. - C.113-118).

Однако даже эффективная вакцинация не решает проблему сальмонеллоносительства, не защищает от заражения молодняк (голубят до 30-дневного возраста), не исключает обострение хронического течения сальмонеллеза.

Одним из перспективных и безопасных лечебно-профилактических препаратов против сальмонеллеза птиц, вызванного S. typhimurium, является бактериофаг.

Наиболее близким к препарату бактериофага тифимуриум являются сальмофаги энтеритидис и пуллорум. Их эффективно применяют в промышленном птицеводстве для лечения и профилактики сальмонеллеза кур (Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В. и др. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур. - М., МГАВМиБ, 2002 г. - 35 с). Но эти препараты не эффективны для лечения и профилактики сальмонеллеза тифимуриум у голубей.

Целью изобретения является создание эффективного фагового препарата для лечения сальмонеллеза голубей, а также разработка рационального способа лечения и профилактики болезни.

Для этого предложен препарат бактериофаг тифимуриум для борьбы с сальмонеллезом птиц, вызванным Salmonella typhimurium. Предлагаемый препарат по сравнению с имеющимися препаратами для борьбы с сальмонеллезом голубей, вызванным Salmonella typnimurium, обладает рядом преимуществ: использование литически высокоактивных фагов эффективно и экологически безопасно, обеспечивает защиту от заболевания с первых дней жизни, позволяет предотвратить поствакцинальные осложнения и суперинфекции, повысить сохранность поголовья, фаговый препарат обладает лечебным и профилактическим эффектом, санирует организм от сальмонеллоносительства, является перспективным компонентом комплексной системы профилактики сальмонеллезной инфекции.

Цель достигается созданием препарата, содержащего суспензию высокоактивных штаммов бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium №5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см³, Phagum Salmonella typhimurium №8 MЕ-ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см³ в культуральной среде (мясо-пептонный бульон), консервированной хинозолом, при следующем соотношении компонентов (на 1 л культуральной среды):

Суспензия частиц фагов:

Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП - с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см³,

Phagum Salmonella typhimurium №8 MЕ-ДЕП - с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см³,

Хинозол - 1% раствор в конечной концентрации в фаговом лизате 0,01% и способом лечения сальмонеллеза голубей, вызванного Salmonella typhimurium, отличающимся тем, что лечебный препарат, содержащий, об.%:

Суспензия частиц фагов в равных объемах:

Phagum Salmonella typhimurium №5 Т3-ДЕП - 3,6×10⁸ БОЕ/см³,

Phagum Salmonella typhimurium №8 МЕ-ДЕП - 1,0×10⁷ БОЕ/см³,

Хинозол - 1%-ный раствор в конечной концентрации в фаговом лизате 0,01%, выпаивают взрослым голубям перорально из расчета 0,5 см³ препарата с активностью 10⁸ индивидуально, молодняку до 14-дневного возраста - 0,25 см³ бактериофага тифимуриум или добавляют в питьевую воду из расчета 5-10 мл на 1 кг массы птицы на одно выпаивание с интервалом 48-72 ч, причем птицу выдерживают без воды три часа до выпойки препарата.

С целью выделения бактериофагов S. typhimurium нами по методу обогащения по Адамсу исследованы пробы помета и сточных вод голубятен. Полученные фильтраты проверяли на стерильность, безвредность, литическую активность по методам Аппельмана и Грациа. Два из наиболее литически активных бактериофагов были использованы для изготовления препарата бактериофага тифимуриум.

Для изготовления препарата использовались выделенные штаммы бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП. К тому же были выделены еще 6 резервных высокоактивных штаммов бактериофагов, которые могут быть использованы для улучшения изготовленного нами препарата бактериофага тифимуриум.

Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП и один резервный штамм Phagum Salmonella typhimurium №9 MM депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, справки о депонировании имеют регистрационные номера Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП 2738/19, Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП 2739/19, Phagum Salmonella typhimurium №9 MM-ДЕП 2740/19.

Штаммы бактериофагов обладают следующими свойствами. Морфология вирионов. По классификации А.С.Тихоненко (1962) все три депонированных бактериофага относятся к четвертой группе. Это фаги с длинным, несокращающимся отростком и изометрическими головками размером от 50 до 100 нм, содержащими внутри двутяжевую ДНК, входят в семейство Siphoviridae.

Размеры структурных элементов вириона, нм.

Изолят бактериофага Диаметр головки Длина хвостового отростка Ширина хвостового отростка Морфотип фага №5 ТЗ-ДЕП 50 225 11 В1 №8 МЕ-ДЕП 64 120 11 В1 №9 ММ-ДЕП 37 117 10 В1

Морфология негативных колоний. Бактериофаги при посеве на штамме-хозяине в течение 18 ч культивирования при 37°С формировали на бактериальном газоне №5 ТЗ-ДЕП - круглые, прозрачные с ровными краями колонии диаметром 1,5-2,5 мм, №8 MЕ-ДЕП - крупные, прозрачные колонии диаметром 2,5-3,5 мм с вторичным ростом индикаторной культуры, №9 MM-ДЕП - округлые, прозрачные с ровными краями колонии диаметром 1,5-2,5 мм.

Культуральные свойства

Штаммы бактериофагов обладают высокой литической активностью, титр фага, определенный методом Аппельмана №5 ТЗ-ДЕП - 10^-10, №8 МЕ-ДЕП - 10^-8, №9 MM-ДЕП - 10^-10, литическая активность по методу Грациа составляет:

Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП - 3,6×10⁸ БОЕ/см³,

Phagum Salmonella typhimurium №8 MЕ-ДЕП - 1,0×10⁷ БОЕ/см³,

Phagum Salmonella typhimurium №9 MM-ДЕП - 1,4×10⁸ БОЕ/см³.

Спектр литического действия. Штаммы обладают широким спектром литического действия по отношению к изолятам Salmonella typhimurium, выделенным в неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях, лизируют более 80-90% выделенных сальмонелл. Кроме того, выделенные бактериофаги лизируют S. enteritidis (90-100%), S. gallinarum-pullorum (75-100%), S. dublin (85-100%).

Штамм Salmonella typhimurium М-2ф t является штаммом хозяином, используемым для накопления бактериофаговых частиц.

Штамм Salmonella typhimurium М-2ф t является контрольно-производственным, депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, справка под номером №2742/19 от 16 октября 2007 года, автор - Пименов Н.В.

Свойства штамма Salmonella typhimurium М-2ф t.

По морфологии - Salmonella typhimurium М-2ф t - грамотрицательные подвижные палочки с закругленными концами, не образующие спор и капсул, размером 2-4 мкм.

Ферментативные свойства - ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, манит, мальтозу, сорбит, арабинозу, рамнозу, дульцит, растет на среде Симмонса, образует сероводород, не образует индол, оксидазоотрицательна, каталазоположительна, не ферментирует сахарозу, лактозу.

Антигенная структура - агглютинируется монорецепторными сальмонеллезными сыворотками 04, H-i, 1, 2,

Способ лечения сальмонеллеза голубей предусматривает введение в организм бактериофагового препарата, содержащего смесь суспензий фаговых частиц штаммов Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см³, Phagum Salmonella typhimurium №8 MЕ-ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см³ в равных объемах в культуральной среде, при следующем соотношении компонентов (на 1 л культуральной среды): суспензия частиц фагов Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП - 3,6×10⁸ БОЕ/см³, Phagum Salmonella typhimurium №8 MЕ-ДЕП - 1,0×10⁷ БОЕ/см³, Хинозол - 1%-ный раствор в конечной концентрации в фаговом лизате 0,01%.

Препарат готовили, высевая в предварительно нагретый до 37°С разведенный 1:5 МПБ штамм-хозяина Salmonella typhimurium М-2ф t - ДЕП и фильтрат фагов Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ-ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №8 МЕ-ДЕП. Контролями служило отсутствие роста при посеве в разведенный МПБ фагов и отдельно рост сальмонелл (по выраженной мутности). После наступления лизиса бактерий бактериофаг консервировали раствором хинозола до его конечной концентрации в препарате 0,01%, после чего препарат фильтровали и расфасовывали во флаконы. Готовый препарат проверяли на стерильность высевом на МПА и в МПБ и на активность на белых мышах.

Пример конкретного применения

Бактериофаг тифимуриум выпаивали голубям перорально из расчета 0,5 см³ препарата с активностью 10⁸ индивидуально при помощи автоматической пипетки-дозатора или же необходимое для обработки поголовья голубей количество доз препарата добавляют в питьевую воду из расчета 5-10 мл на 1 кг массы птицы на одно выпаивание с интервалом 48-72 ч. За три часа до выпойки бактериофага тифимуриум птицу выдерживали без воды.

Применение бактериофагового препарата возможно в комплексе с лечением с пробиотиками на фоне антибиотикотерапии и вакцинации.

Пример применения препарата 1

Лабораторное испытание препарата бактериофагов тифимуриум в остром опыте проводили на 30 голубях 3-4-месячного возраста. Для этого были созданы три группы: две опытные (по 10 голубей) и контрольная (10 голубей), которых кормили и содержали по принципу аналогов.

Голубям первой опытной группы орально вводили бактериофаг из расчета 0,5 см³ препарата индивидуально при помощи автоматической пипетки-дозатора. Через 12 часов проводили заражение голубей смесью из 3 изолятов S. typhimurium (с вирулентностью для белых мышей при подкожном инъецировании 2 тыс. микробных клеток) в одинаковом количестве каждого изолята орально в дозе 10 млн. микробных клеток (дозу определяли, используя оптические стандарты мутности энтеробактерий).

Голубям второй опытной группы бактериофаг выпаивали согласно разработанному временному наставлению. Для этого необходимое для обработки поголовья птиц количество доз препарата добавляли в питьевую предварительно кипяченую и охлажденную до 20-30°С воду из расчета 10-20 мл на голубя на одно выпаивание. За три часа до выпойки бактериофага тифимуриум голубей выдерживали без поения. Заражение проводили через 12 часов аналогично заражению в первой группе. Голубей контрольной группы бактериофагом тифимуриум не обрабатывали и инфицировали смесью культур S. typhimurium в тех же дозах, что и в опытных группах.

За птицей наблюдали 15 дней, после чего проводили убой. Бактериологическое исследование трупов павших и убитых голубей проводили по схеме: посевы из паренхиматозных органов, крови сердца и красного костного мозга на МПА, МПБ, агар Эндо, висмут-сульфитный агар, окраска мазков-отпечатков и мазков растущих культур по Граму, реакция агглютинации с O-комплексными и O- и H-агглютинирующими монорецепторными сальмонеллезными сыворотками. Результаты лабораторных испытаний представлены в таблице.

Эффективность применения бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей в лабораторных условиях Группа Число голубей в группе, гол. Заболели и пали, гол. Сохранность, % Голубей, из которых выделена S typhimurium гол. % Первая опытная 10 0 100 0 0 Вторая опытная 10 1 90 1 10 Контрольная 10 9 10 10 100

Как видно из представленных в таблице данных, бактериофаговый препарат обладает выраженной литической активностью против сальмонелл in vivo, протективными свойствами 90-100% при непосредственном заражении вирулентными изолятами S. typhimurium в высоких дозах. Причем сохранность голубей в группе при оральном введении бактериофагового препарата индивидуально при помощи автоматической пипетки-дозатора была выше, чем при добавлении препарата в питьевую воду. У голубей, которым был выпоен бактериофаг, не было клинических проявлений сальмонеллеза.

Все павшие голуби имели характерные клинические признаки и патологоанатомические изменения: одышку, потерю аппетита, диарею, энтерит, ринит и др. При бактериологическом исследовании из печени с желчным пузырем, крови сердца, крови костного мозга, головного мозга, селезенки этих голубей выделили S. typhimurium, обладающую характерными для S. typhimurium свойствами.

Пример 2

Терапевтическая эффективность бактериофага тифимуриум апробирована на двух голубятнях г.Москвы, расположенных в районах Марьино и Кузьминки.

Клиническая картина голубей проявлялась взъерошенностью оперения, угнетением, нарушением координации движения или потерей способности к полету, отказом от корма, помет становился жидким зеленого цвета с примесью крови и слизи, у некоторых голубей проявлялись одышка и ринит. Диагноз был подтвержден бактериологическими и серологическими (ПНР) исследованиями. В первом случае заболеваемость составляла 70% при летальности до начала лечения 20% (преимущественно молодняка 2-4-месячного возраста), на голубятне в Кузьминках клиническое проявление отмечали у 16 голубей из 125 (13%), пали 3 (летальность 19%). Необходимо отметить, что птице во второй голубятне при появлении признаков инфекции владельцем выпаивался байтрил (при определении антибиотикочувствительности выделенная от этих голубей культура S. typhimurium обладала низкой чувствительностью к энрофлоксацину).

Выпойку бактериофага тифимуриум в неблагополучных голубятнях проводили согласно разработанной и использованной в лабораторном эксперименте схеме. Обработку проводили трижды с интервалом 48 часов. На третьи сутки после начала фаготерапии состояние большинства заболевшей птицы улучшилось, появилась активность, восстановился аппетит, консистенция помета постепенно нормализовалась, цвет помета к 4-6 суткам стал светло-коричневым. Прекратилась гибель голубей. Через 14 суток при бактериологическом анализе смывов из клоаки у 23 голубей (24%), выборочно исследованных на голубятне в Марьино, и 20 голубей (16%) на голубятне в Кузьминках бактерий рода Salmonella не выделяли.

Безопасность метода использования фагов (в т.ч. для молодняка, с первых дней жизни), удобство применения, лечебный и профилактический эффект, высокая экономическая эффективность, возможность решения проблемы сальмонеллоносительства являются перспективным компонентом комплексной системы профилактики сальмонеллезной инфекции.

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии. Препарат в качестве бактериофагов содержит суспензию штаммов Phagum Salmonella typhimurium №5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см³ и Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см⁷ в равных объемах в культуральной среде, консервированной хинозолом, при следующем соотношении компонентов (на 1 л культуральной среды): суспензия частиц штамма Phagum Salmonella typhimurium №5 Т3-ДЕП - 3,6×10⁸ БОЕ/см³, суспензия частиц штамма Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП - 1,0×10⁷ БОЕ/см³, хинозол - в конечной концентрации 0,01%, Препарат выпаивают голубям в дозе 0,25-0,5 мл с интервалом 48-72 ч или добавляют в питьевую воду из расчета 5-10 мл на 1 кг массы птицы на одно выпаивание. До выпойки препарата птицу выдерживают в течение трех часов без воды. Препарат и способ его применения безопасны, позволяют эффективно лечить сальмонеллезную инфекцию, обеспечивают защиту от заболевания с первых дней жизни, предотвращают поствакцинальные осложнения и повышают сохранность поголовья. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Препарат для лечения сальмонеллеза голубей, вызванного Salmonella typhimurium, содержащий суспензию частиц бактериофагов, отличающийся тем, что в качестве бактериофагов содержит суспензию штаммов Phagum Salmonella typhimurium №5 Т3-ДЕП с концентрацией 3,6×10⁸ БОЕ/см³ и Phagum Salmonella typhimurium №8 ME-ДЕП с концентрацией 1,0×10⁷ БОЕ/см⁷ в равных объемах в культуральной среде, консервированной хинозолом, при следующем соотношении компонентов (на 1 л культуральной среды):
Суспензия частиц штамма Phagum Salmonella   typhimurium №5 Т3-ДЕП 3,6×10⁸ БОЕ/см³ Суспензия частиц штамма Phagum Salmonella   typhimurium №8 МЕ-ДЕП 1,0×10⁷ БОЕ/см³ Хинозол В конечной концентрации 0,01%

2. Способ лечения сальмонеллеза голубей, вызванного Salmonella typhimurium, отличающийся тем, что препарат по п.1 выпаивают голубям в дозе 0,25-0,5 мл с интервалом 48-72 ч или добавляют препарат по п.1 в питьевую воду из расчета 5-10 мл на 1 кг массы птицы на одно выпаивание, причем до выпойки препарата птицу выдерживают в течение трех часов без воды.

3. Способ лечения сальмонеллеза голубей по п.2, отличающийся тем, что взрослым голубям препарат по п.1 выпаивают в дозе 0,5 мл.

4. Способ лечения сальмонеллеза голубей по п.2, отличающийся тем, что молодняку до 14-дневного возраста препарат по п.1 выпаивают в дозе 0,25 мл.