СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОСТАФИНА Российский патент 2008 года по МПК C12N9/00 C12N1/06 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения фермента лизостафина, который находит применение в качестве лекарственного препарата против золотистого и других видов стафилококков, в том числе антибиотикоустойчивых.

Известен способ получения лизостафина (белка с изоточкой, равной 9,5) из культуральной жидкости продуцента Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus, который включает ультрафильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ - целлюлозе и гель-фильтрацию на сефадексе G-75. Способ позволяет получать лизостафин с «минорными» примесями [1].

Недостатками способа являются его длительность, трудность масштабирования и низкий выход целевого продукта (22%, со специфической активностью 1200 ед./мг).

Известен способ получения лизостафина из культуральной жидкости S. simulans biovar staphylolyticus карбонатным буфером при pH 10,8-11,0 с 0,5 М NaCl, который включает ультрафильтрацию, ионообменную хроматографию на Амберлите ИРЦ-50 и гидрофобную хроматографию на фенилсефарозе [2]. Выход целевого электрофоретически чистого продукта составляет 51% со специфической активностью 1520 ед./мг.

Способ легко можно масштабировать, однако он также длителен, и выход целевого продукта не достаточно высок.

Задача изобретения - повышение выхода и упрощение процесса получения целевого продукта.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе получения лизостафина, включающем ультрафильтрацию, хроматографию культуральной жидкости S. simulans biovar staphylolyticus с последующей элюцией целевого продукта, после ультрафильтрации хроматографию проводят на силохроме С-80 при нейтральном значении pH (7,0-7,5), затем балластные белки и цветные примеси удаляют в 0,2 М глицин - NaOH буфере в присутствии 0,2 М NaCl при pH 9,0-9,3 (ниже значения изоточки лизостафина), а элюцию целевого продукта проводят, используя смесь 0,4 М трис-HCl буфера с 0,2 М глицин -NaOH буфером 0,4 М NaCl при pH 9,8-10,0 (выше значения его изоточки).

Силохром С-80 известен как высокопористый (средний размер пор 52 нм), кремнеземный носитель, однако сорбционные свойства его и других кремнеземных сорбентов известны недостаточно. Полагают, что сорбция белков на кремнеземных сорбентах происходит за счет отрицательно заряженных силанольных (-SiO^-) групп на поверхности [3]. Но при нейтральных значениях pH (7,0-7,5) ионные (катионообменные) свойства кремнеземов (в том числе силохрома) очень слабы, их изоточка (pI) находится при pH 2,0-2,5, а значение рК˜9,0 (значение pH, при котором половина групп становится заряженными). Поэтому до сих пор считалось, что белки не могут быть очищены на таких слабых кремнеземных ионообменниках, известно их использование лишь для очистки вирусов, но не белков [4].

Отличительной особенностью предлагаемого способа получения лизостафина является то, что после проведения ультрафильтрации хроматографию на силохроме проводят при нейтральных значениях pH. Из-за большой разницы между pI и рК силохром (и другие кремнеземы) следует рассматривать как сорбенты смешанного типа. Связывание белков при нейтральных значениях pH может идти только за счет других сил слабого взаимодействия (водородных связей и гидрофобных взаимодействий). Лишь при приближении pH к значению рК (˜9,0) и выше определяющими становятся ионные связи, а сорбент - ионообменником. Поэтому на силохроме могут сорбироваться различные белки, в том числе и кислые, но при pH ˜9,0 белки с низкими значениями изоточки, как правило, десорбируются и остаются только белки, имеющие щелочные значения изоточек. Поскольку лизостафин является щелочным белком, то, удалив балластные белки при pH, меньшем, чем значение изоточки лизостафина, его можно выделить (и таким образом очистить) при большем, чем его изоточка, значении pH. Отсюда следует, что чем выше значение изоточки сорбированного белка, тем при большем значении pH он элюируется.

Способ получения лизостафина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 50 литров культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus ГНЦ ПМ 1030 концентрируют в 8 раз ультрафильтрацией на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа. Клетки отделяют центрифугированием (3000 g, 30 мин). Затем пропускают этот объем жидкости через колонку с силохромом С-80 (7,5 х50 см), уравновешенную 0,02 М фосфатным буфером, pH 7,0 со скоростью 700 мл/ч. Промывают колонку двумя литрами этого буфера до значения оптической плотности □0,05 при 280 нм и pH поднимают до 9,0, используя 0,2 М глицин - NaOH буфер с 0,2 М NaCl. Элюируют балластные белки, имеющие значение изоточки ниже, чем у лизостафина, цветные примеси и около 5% самого лизостафина (скорость элюции 500 мл/ч, величина оптической плотности в элюате □0,01 при 280 нм). Значение pH поднимают до 9,8 (выше значения изоточки лизостафина), используя смесь 0,4 М трис-HCl буфера с 0,2 М глицин - NaOH буфером и 0,4 М NaCl (скорость элюции 100 мл/ч) и выделяют чистый лизостафин.

Пример 2. 50 литров культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus ГНЦ ПМ 1030 концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа. Клетки отделяют центрифугированием (3000 g, 30 мин). Затем пропускают этот объем жидкости через колонку с силохромом С-80 (7,5×50 см), уравновешенную 0,02 М фосфатным буфером, pH 7,5 со скоростью 700 мл/ч. Промывают колонку двумя литрами этого буфера до значения оптической плотности □0,05 при 280 нм и pH поднимают до 9,3, используя 0,2 М глицин - NaOH буфер с 0,2 М NaCl. Элюируют балластные белки, имеющие значение изоточки ниже, чем у лизостафина, цветные примеси и около 5% самого лизостафина (скорость элюции 500 мл/ч, величина оптической плотности в элюате □0,01 при 280 нм). Значение pH поднимают до 10,0 (выше значения изоточки лизостафина), используя смесь 0,4 М трис-HCl буфера с 0,2 М глицин - NaOH буфером и 0,4 М NaCl (скорость элюции 100 мл/ч) и выделяют чистый лизостафин. Результат получения фермента показан в таблице.

Стадия очисткиОбъем, млАктивность, ед./млПолная активность, ед.Белок, мгСпецифическая активность, ед./мгВыход,
%Культуральная жидкость500003,5175000180009,7100Ультрафильтрация500030,0150000750020,086Хроматография на силохроме, pH 10,0600207,012420088,0141171

Таким образом, как видно из результатов, представленных в таблице, выход целевого продукта составляет 71% со специфической активностью 1411 ед./мг. Фермент является электрофоретически чистым (чертеж). По сравнению с аналогом и прототипом выход целевого продукта (лизостафина) выше на 50% [1] и 20% [2] соответственно, а число хроматографий целевого продукта сокращается с двух до одной. Кроме того, предлагаемый нами способ может быть легко масштабирован изменением объема колонки с силохромом (т.е. быстрый переход от лабораторной к промышленной технологии получения целевого продукта).

Источники нформации

1. I.Marova and V. Dadak.. Folia Microbiol. (1993), v. 38, №3, p.245-252.

2. T.B Федоров, В.И.Суровцев, В.3.Плетнев, M.A.Бороздина, В.В.Гусев. (2003), Биохимия, 68, №1, с.61-65.

3. Л.А.Остерман (1985). Хроматография белков и нуклеиновых кислот, Москва, Медицина, с.247.

4. М.С.Балаян, Г.И.Беспалова, С.Е.Бреслер и др. (1971). Вопросы вирусологии, №4, с.478-482.

Изобретение относится к биотехнологии. Для получения фермента лизостафина хроматографическую очистку культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus проводят на силохроме С-80 при нейтральном значении pH 7,0-7,5. Балластные белки и цветные примеси удаляют в 0,2 М глицин - NaOH буфере в присутствии 0,2 М NaCl при pH 9,0-9,3. Элюцию лизостафина при pH 9,8-10,0 проводят смесью 0,4 М трис-HCl буфера с 0,2 М глицин - NaOH буфером 0,4 М NaCl. Изобретение обеспечивает повышение выхода электрофоретически чистого фермента и упрощение процесса его получения. 1 ил., 1 табл.

Способ получения лизостафина, включающий ультрафильтрацию, хроматографию культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus с последующей элюцией целевого продукта, отличающийся тем, что хроматографию культуральной жидкости проводят на силохроме С-80 при нейтральных значениях pH, балластные белки и цветные примеси удаляют в 0,2 М глицин - NaOH буфере с 0,2 М NaCl при pH 9,0-9,3, а элюцию целевого продукта проводят, используя смесь 0,4 М трис-HCl буфера с 0,2 М глицин - NaOH буфером с 0,4 М NaCl при pH 9,8-10,0.