СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВИДИНА И ЛИЗОЦИМА Российский патент 2008 года по МПК C12N9/36 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения фермента лизоцима и белка авидина. Лизоцим находит применение в качестве лекарственного препарата, консерванта в пищевой промышленности, биотехнологии. Авидин - биологически активное соединение, находящее применение в медицине, химической, микробиологической и пищевой промышленности.

Известен способ получения лизоцима из яичного белка путем прямой кристаллизации при добавлении 5% по массе NaCl и доведения pH до 9,8 щелочным агентом с последующей очисткой лизоцима двукратной перекристаллизацией, причем на стадиях кристаллизации и перекристаллизации добавляют затравочные кристаллы, в качестве щелочного агента используют NaHCO₃ и к яичному белку, освобожденному от лизоцима, добавляют HCl, что позволяет его использовать в пищевой промышленности, например, для получения яичного порошка [1].

Известен способ получения авидина гомогенизацией яичного белка с последующим осаждением гомогенизата сульфатом аммония в диапазоне 40-100%, насыщения растворением осадка в воде, повторным осаждением с помощью полярного органического растворителя (этанола) при конечной концентрации последнего 40-75%, экстракцией из осадка авидина кислым буферным раствором при pH 1-6, хроматографией экстракта на колонке с КМ - целлюлозой с последующим элюированием, диализом и выделением авидина [2].

Недостатком этих способов выделения является многоступенчатость и длительность, при этом выделяют только один продукт, т.е. при получении авидина теряется лизоцим и наоборот.

Задача изобретения - упрощение способа получения лизоцима и авидина и повышение его эффективности.

Поставленная задача решается тем, что предложен способ получения лизоцима и авидина из яичного белка, включающий гомогенизацию яичного белка, хроматографию гомогенизата с последующей элюцией и выделением целевых продуктов, причем гомогенизат пропускают через колонку с высокопористым силохромом С-80 при нейтральных (7,0-7,5) значениях pH, затем удаляют балластные белки в 0,2 глицин-NaOH буфере при pH 9,3-9,5 в присутствии 0,3 М NaCl, а целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером с 0,5-0,8 М NaCl, при pH 10,8-11,0 с последующим разделением белков гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75.

Отличием предлагаемого способа является использование высокопористого (52 нм) силохрома С-80. Сорбция белков происходит при нейтральных значениях pH, а элюцию целевых продуктов с сорбента проводят совместно карбонатным буфером с NaCl при pH около или выше значения изоточек целевых продуктов, в дальнейшем разделяя их гель-фильтрацией на сефадексе G-75. Значение pH на колонке с силохромом быстро (2-3 мин, для того чтобы силохром был в щелочных условиях минимальное время) опускают до нейтральных значений, промывая водой.

Силохром известен как кремнеземный сорбент с очень слабыми ионообменными свойствами при нейтральных значениях pH. Поэтому до сих пор такие сорбенты широко использовались лишь для очистки вирусов [3], но не белков. Так как его изоточка равна 2,0-2,5, а рК˜9,0 (значение pH, при котором заряжена половина групп), то при нейтральных значениях pH определяющую роль в сорбции белков играют не ионные, а водородные связи и гидрофобные взаимодействия между белком и сорбентом. Лишь при приближении pH к 9,0, т.е. к значению рК, роль ионных взаимодействий резко возрастает. Поэтому щелочные белки (т.е, имеющие высокие изоточки) элюируются позже белков с более низкими изоточками. Таким образом получают очищенные белки.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Белок, полученный из 100 куриных яиц, разбавляют в 6 раз 0,02 М фосфатным буфером, pH 7,0 и пропускают при комнатной температуре через колонку с силохромом С 80 (8×15), уравновешенную тем же буфером до оптической плотности в промывных водах при 280 нм 0,01. После этого колонку уравновешивают 0,05 М глицин - NaOH буфером pH 9,3 с 0,3 М NaCl и промывают им так же, до оптической плотности при 280 нм 0,01. Колонку уравновешивают 0,5 М карбонатным буфером pH 10,8 с 0,5 М NaCl и элюируют авидин с лизоцимом со скоростью 80 мл/ч. Раствор белков нейтрализуют 5 М уксусной кислотой, доведенной до pH 6,0 щелочью (NaOH), концентрируют на мембране, отсекающей молекулярные массы >10 кДа до 4-5 мл и помещают на колонку (2×50), уравновешенную 0,05 М ацетатным буфером, pH 6,0. Затем проводят гель - фильтрацию со скоростью 10-12 мл/ч. Первый пик (меньший по размеру) - авидин. Второй пик - лизоцим. Оба белка получают электрофоретически чистыми (см. чертеж). Активность лизоцима и его выход по сравнению с общей активностью в начальном гомогенизате проверяют по гидролизу высушенных клеток Micrococcus lysodeicticus [4]. Активность авидина и его выход проверяют по связыванию с d-биотином [5].

Активность лизоцима составляет 12000 ед/мг.

Выход 84%.

Активность авидина 12 ед/мг

Выход 88%.

Пример 2. Белок, полученный из 100 куриных яиц, разбавляют в 7 раз 0,02 М фосфатным буфером, pH 7,5 и пропускают при комнатной температуре через колонку с силохромом С 80 (8×15), уравновешенную тем же буфером до оптической плотности в промывных водах при 280 нм 0,01. После этого колонку уравновешивают 0,05 М глицин - NaOH буфером pH 9,5 с 0,3 М NaCl и промывают им так же, до оптической плотности при 280 нм 0,01. Колонку уравновешивают 0,5 М карбонатным буфером pH 11,0 с 0,8 М NaCl и элюируют авидин с лизоцимом со скоростью 80 мл/ч. Раствор белков нейтрализуют 5 М уксусной кислотой, доведенной до pH 6,0 щелочью (NaOH), концентрируют на мембране, отсекающей молекулярные массы >10 кДа до 4-5 мл и помещают на колонку (2×50), уравновешенную 0,05 М ацетатным буфером, pH 6,0. Затем проводят гель-фильтрацию со скоростью 10-12 мл/ч. Первый пик (меньший по размеру) - авидин. Второй пик - лизоцим. Оба белка получают электрофоретически чистыми (см. чертеж). Активность лизоцима и его выход по сравнению с общей активностью в начальном гомогенизате проверяют по гидролизу высушенных клеток Micrococcus lysodeicticus [4]. Активность авидина и его выход проверяют по связыванию с d-биотином [5].

Активность лизоцима составляет 12000 ед/мг.

Выход 85%.

Активность авидина 12 ед/мг.

Выход 90%.

Пример 3. Белок, полученный из 20-ти куриных яиц, разбавляют, как в примере 1, тем же фосфатным буфером и помещают в пластмассовый стакан с цилиндрическими стенками и плоским дном. Охлаждают до 4-5°С, вносят силохром С-80 в объеме 125 мл и осторожно перемешивают не менее 10 часов при температуре 4-5°С (механическая мешалка, 50-60 об/мин). Останавливают мешалку, силохром переносят в колонку (4×10 см) и при комнатной температуре промывают, как в примере 1. Далее, как в примере 1, используют глицин - NaOH и карбонатный буфер. Раствор белков, элюированных этим буфером, подкисляют, как в ранее указанном примере, 5 М уксусной кислотой, доведенной щелочью до pH 6,0, также концентрируют на мембране до объема 3-4 мл и помещают на колонку для гель-фильтрации (2×50), уравновешенную 0,05 М ацетатным буфером, pH 6,0. Элюируют так же, как в примере 1. Выход лизоцима и авидина 80% и 85% соответственно.

Пример 4. Белок, полученный из 20-ти куриных яиц, разбавляют, как в примере 2, тем же фосфатным буфером и помещают в пластмассовый стакан с цилиндрическими стенками и плоским дном. Охлаждают до 4-5°С, вносят силохром С-80 в объеме 125 мл и осторожно перемешивают не менее 10 часов при температуре 4-5°С (механическая мешалка, 50-60 об/мин). Останавливают мешалку, силохром переносят в колонку (4×10 см) и при комнатной температуре промывают, как в примере 2. Далее, как в примере 2, используют глицин - NaOH и карбонатный буфер. Раствор белков, элюированных этим буфером, подкисляют, как в ранее указанном примере, 5 М уксусной кислотой, доведенной щелочью до pH 6,0, также концентрируют на мембране до объема 3-4 мл и помещают на колонку для гель-фильтрации (2×50), уравновешенную 0,05 М ацетатным буфером, pH 6,0. Элюируют также, как в примере 2. Выход лизоцима и авидина 85% и 90% соответственно.

Таким образом, предлагаемый способ, в отличие от известных [1, 2], позволяет одновременно получать лизоцим и авидин с выходом 80-85% и 85-90% соответственно, тем самым, повышая эффективность способа, а также сократить число стадий выделения. Силохромная колонка в предлагаемом способе может выдерживать, по крайней мере, 10 циклов без потери активности.

Информация, принятая во внимание

1. RU патент №94025573 А1, Кучкаев Б.И. и др. Способ получения лизоцима из яичного белка (1996).

2. SU 1643554 А1, И.К.Залите и др. Способ получения авидина (1991), Бюл №15.

3. М.С.Балаян, Г.И.Беспалова, С.Е.Бреслер и др. (1971), Вопросы вирусологии, №4, с.478-482.

4. D.Shugar (1952), Biochim. Biophys. Acta, v.8, p.302-306.

5. N.M.Green (1963), Biochem J., v.89, p.599-603.

Изобретение относится к биотехнологии. Для получения фермента лизоцима и белка авидина из яичного белка, хроматографию гомогенизата яичного белка проводят на силохроме С-80 при нейтральном значении pH (7,0-7,5). Балластные белки удаляют в 0,2 М глицин - NaOH буфере в присутствии 0,3 М NaCl при pH 9,3-9,5. Целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером с 0,5-0,8 М NaCl, при pH 10,8-11,0 с последующим разделением белков гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75. Изобретение обеспечивает упрощение способа получения электрофоретически чистых белков и повышение его эффективности. 1 ил.

Способ получения лизоцима и авидина из яичного белка, включающий гомогенизацию яичного белка, хроматографию гомогенизата с последующей элюцией и выделением целевых продуктов, отличающийся тем, что гомогенизат пропускают через колонку с высокопористым силохромом С-80 при нейтральных (7,0-7,5) значениях pH, затем удаляют балластные белки в глицин-NaOH буфере при pH 9,3-9,5 с 0,3 М NaCl, а целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером при pH 10,8-11,0 с 0,5 М NaCl, с последующим разделением гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75.