СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N9/02 C07K1/14 

Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу оксидаз (пероксидаз) и гидролитического фермента (лизоцима) из растительного сырья.

Известные способы получения ферментов из растительного сырья с использованием экстракционных, сорбционных и других методов выделения предусматривают получение отдельных ферментов или нескольких ферментов в комплексе, в основном для препаративных целей.

Из RU 2388819 C2 известен способ получения пероксидазы из корневищ хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония, осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях рН и рК буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, затем лиофилизуют.

Из RU 2342431 C1 известен способ получения авидина и лизоцима из яичного белка посредством хроматографии яичного белка, проводимой на силохроме C-80 при нейтральном значении pH (7,0-7,5), балластные белки удаляют в 0,2 М глицин-NaOH буфере в присутствии 0,3 М NaCl при pH 9,39,5, целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером с 0,5-0,8 М NaCl, при pH 10,8-11,0 с последующим разделением белков гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является описанный выше способ получения пероксидазы из корневищ хрена, раскрытый в RU 2388819. Недостатками указанного способа являются многостадийность процесса, использование агрессивного и экологически небезопасного высаливающего агента, использование для очистки от балластных белков двух гелевых сорбентов.

Задача настоящего изобретения заключалась в разработке нового сорбционного способа получения ферментов из растительного сырья, при котором процесс их получения упрощен с возможностью получения пероксидазы и лизоцима в одном цикле работы сорбционной колонны. Преимуществом такого способа также является повышение выхода и чистоты получаемой пероксидазы.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения ферментов из растительного сырья, выбранных из пероксидаз и лизоцима, при котором предварительно измельченное растительное сырье подвергают водно-солевой экстракции 5 % раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5-3 ч при комнатной температуре. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию и сепарированию для удаления остатков сырья и балластных веществ, сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме со скоростью 50-240 мл/см² ч с последующей промывкой колонны 3-15 объемами дистиллированной воды или цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 4,0, элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 9,0-10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 25-160 мл/см² ч для получения элюата, содержащего пероксидазу, и последующей возможной элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 11 с 1 н. раствором (NH4)₂SO₄ со скоростью 25-160 мл/см² ч для получения элюата, содержащего лизоцим, и доводят значение рН в элюате(ах) до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного(ых) фермента(ов).

Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корнеплоды редьки черной.

Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корневища хрена.

Отличие предложенного способа от прототипа заключается в осуществлении процесса по гибкой технологии с использованием одного и того же сорбционного оборудования независимо от свойств целевого продукта с последующей очисткой индивидуально для каждого фермента.

Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:

- возможность выделения и очистки белков различной структуры на одних и тех же производственных мощностях в зависимости от потребности;

- сокращаются потери целевых продуктов и увеличивается съем ферментов с единицы сырья в среднем на 30%;

- улучшается качество готовых препаратов и условия труда.

Способ иллюстрируется следующими примерами

ПРИМЕР 1

Измельченные, обезжиренные и высушенные корнеплоды редьки черной подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см² ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см² ч при комнатной температуре, pH элюента 10,7. На выходе из колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу. Фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют, доводят рН элюата до 6,0, производят обессоливание и лиофильную сушку фермента пероксидазы.

ПРИМЕР 2

Измельченные, обезжиренные и высушенные корневища хрена подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H⁺-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см² ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см² ч при комнатной температуре, рН элюента 10,7. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л и определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. После десорбции пероксидазы колонну промывают 3 объемами цитратно-фосфатного буферного раствора с pH 4,0, после чего ведут десорбцию лизоцима раствором аммиака с рН 11,0-12,0 с 1 н. раствором (NH₄)₂SO₄ со скоростью 160 мл/см² ч. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность лизоцима; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. В полученных элюатах перокисдазы и лизоцима сдвигают рН до 6,0, после чего их подвергают обессоливанию и лиофилизации.

Изобретение относится к способу получения пероксидазы. Способ заключается в экстракции предварительно измельченных корнеплодов редьки черной 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием. Полученный экстракт подвергают сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н⁺-форме со скоростью 240 мл/см² ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды. Осуществляют элюцию с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см² ч для получения элюата. Доводят значения рН в элюате до 6, обессоливают элюат и лиофильно высушивают с получением указанного фермента. Способ позволяет сократить потери целевого продукта, увеличить выход фермента на 30%. 2 пр.

Способ получения пероксидазы из корнеплодов редьки черной, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием, сорбции полученного экстракта на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н⁺-форме со скоростью 240 мл/см² ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды, элюции с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см² ч для получения элюата, доведения значения рН в элюате до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного фермента.