АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И ЛИЗОСТАФИНА Российский патент 2017 года по МПК A61K38/16 A61K31/722 A61K47/10 A61K47/30 A61P31/04 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и относится к композиции, обладающей антибактериальной активностью, характеризующейся тем, что она содержит активное вещество - лизостафин, вспомогательное вещество - высокомолекулярный хитозан, а также основу.

Борьба с инфекционными заболеваниями, вызываемыми резистентными штаммами бактерий рода Staphylococcus и, в частности, золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus), является одной из наиболее актуальных проблем медицины на протяжении длительного времени. Поэтому поиск новых лекарственных средств, альтернативных антибиотикам, а также разработка новых подходов в лечении стафилококковых инфекций представляется важной задачей.

Одним из таких средств является лизостафин - фермент (КФ 3.4.24.75), впервые выделенный более полувека назад из культуральной жидкости Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus [1]. Благодаря своей способности расщеплять пентапептидные глициновые мостики в структуре муреина, характерные именно для S. aureus, лизостафин рассматривается как перспективный антистафилококковый агент. Была показана высокая эффективность этого белка против S. aureus как в опытах in vitro, так и в клинических исследованиях на животных [2-4]. Однако использование лизостафина может иметь некоторые недостатки. Прежде всего - это 1) сложность его очистки от сопутствующих примесей, содержащихся в культуральной жидкости S. simulans, а также 2) потенциальная иммуногенность самого лизостафина. Первая проблема решается за счет получения рекомбинантной формы белка, что позволяет получать высокоочищенный фермент, однако порождает другую проблему - значительно повышает его стоимость. Вторая проблема может решаться за счет иммобилизации белка в матрице полиэтиленгликоля, что позволяет предотвратить его взаимодействие с антителами сыворотки и сохранить высокую активность фермента [5].

Решением вышеназванных проблем - высокой стоимости очищенного рекомбинантного белка и его потенциальной иммуногенности может служить подход, заключающийся в уменьшении концентрации используемого лизостафина при сохранении его высокой антистафилококковой эффективности. Уменьшение концентрации лизостафина можно достигнуть за счет его синергизма с другими антибактериальными веществами - классическими антибиотиками [6], антимикробными пептидами [7] и белками [8]. Однако использование антибиотиков в комплексе с лизостафином не может гарантировать сохранения эффекта синергизма в отношении всех штаммов стафилококка. Кроме того, и антибиотики, и антимикробные белки, и пептиды могут также иметь нежелательные иммуногенные свойства.

В патентах, в которых описывается использование антибактериальных свойств лизостафина, не ставится задача минимизации используемых концентраций фермента. Так, в патенте США 6,315,996 предлагается использовать лизостафин в качестве антибактериального агента без использования вспомогательных веществ [3]. В патенте США 5,760,026 лизостафин предлагается использовать совместно с некоторыми другими антибактериальными компонентами, причем с некоторыми из них наблюдается эффект синергизма [4].

В связи с этим целью заявленного изобретения является разработка антибактериальной композиции, включающей в свой состав лизостафин (антибактериальный компонент), высокомолекулярный хитозан (вспомогательное вещество), обладающей повышенной антибактериальной активностью в отношении золотистого стафилококка.

Поставленная задача достигается путем включения в состав композиции лизостафина и высокомолекулярного хитозана. В качестве загустителя возможно использование поливинилового спирта, глицерина, полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона.

Уменьшение концентрации лизостафина в композиции достигается за счет использования вспомогательного вещества - высокомолекулярного хитозана. Высокомолекулярный хитозан, за счет своих поликатионных свойств, взаимодействует с полианионными компонентами клеточных стенок S. aureus (тейхоевыми кислотами), что приводит к уменьшению связывания тейхоевыми кислотами положительно заряженного лизостафина и его большей вовлеченности в процесс лизиса клеток [9]. Также высокомолекулярный хитозан, связываясь с полианионными компонентами клеточных стенок S. aureus, способствует высвобождению из комплекса с тейхоевыми кислотами бактериальных автолизинов, которые в свою очередь вызывают гиперавтолиз собственных бактериальных клеток [9]. Иными словами высокомолекулярный хитозан подготавливает клетки-мишени, делая их более восприимчивыми к лизостафину, а значит и восприимчивыми к более низким концентрациям лизостафина. При этом концентрация используемого вспомогательного вещества - высокомолекулярного хитозана - требуется на порядок более низкой, чем самого лизостафина. Также в отличие от других возможных веществ хитозан отличает его биосовместимость, биодеградируемость, нетоксичность и гипоаллергенность [10]. Хитозан - сополимер глюкозамина и ацетилглюкозамина - является продуктом дезацетилирования хитина, который содержится в экзоскелетах ракообразных и насекомых, гладиусах кальмара, клеточных стенках грибов и некоторых водорослей. Хитозан является единственным положительно заряженным полимером (поликатионом) естественного происхождения, который получают в больших количествах с высокой степенью химической чистоты, и, что немаловажно, обладающего умеренной стоимостью [10]. Мировое количество хитина оценивается на уровне 10¹⁰ тонн, что, учитывая постоянный биосинтез, делает его неистощимым источником для получения хитозана.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка антибактериальной композиции, включающей в свой состав лизостафин, высокомолекулярный хитозан и наполнитель, обладающий высокой антибактериальной активностью в отношении золотистого стафилококка.

Пример 1. Антибактериальная композиция, включающая в свой состав: лизостафин в конечной концентрации 1 мкг/мл, высокомолекулярный хитозан с молекулярной массой от 200 до 600 кДа в концентрации 0,1 мкг/мл (то есть 10% к массе используемого лизостафина), поливиниловый спирт от 2 до 15 мас. %, остальное - вода.

Композиция в виде геля обладает повышенной антибактериальной активностью в отношении S. aureus по сравнению с отдельными компонентами композиции. Полученные результаты антибактериального теста заявляемой композиции представлены на рисунке 1.

Пример 2. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя глицерин от 10 до 90 мас. %.

Пример 3. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас. %.

Пример 4. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя поливинилпироролидон от 10 до 50 мас. %.

Пример 5. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но кроме поливинилового спирта от 2 до 15 мас. %., включающая и глицерин от 10 до 90 мас. %, и полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас. %, и поливинилпироролидон от 10 до 50 мас. %.

ЛИТЕРАТУРА

1. Schindler С.А., Schuhardt V.T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1964. V. 51. №3. P. 414-421.

2. Kumar J.K. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 80. №4. P. 555-561.

3. Пат. США. 6,315,996. Topical lysostaphin therapy for staphylococcus ocular infections.

4. Пат. США. 5,760,026. Method for treating mastitis and other staphylococcal infections.

5. Mierau I., Leij P., van Swam I., Blommestein В., Floris E., Mond J., Smid E.J. // Microb. Cell Fact. 2005. V. 4. №15. P. 1-9.

6. Polak J., Delia Latta P., Blackburn P. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1993. V. 17. №4. P. 265-270.

7. Desbois A.P., Coote P.J. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011. V. 30. №8. P. 1015-1021.

8. Becker S.C., Foster-Frey J., Donovan D.M. // FEMS Microbiol. Lett. 2008. V. 287. №2. P. 185-191.

9. Куликов C.H., Хайруллин P.З., Варламов В.П. / Влияние поликатионов на антибактериальную активность лизостафина // Прикладная биохимия и микробиология 2015. Т.51. №6. с. 610-615.

10. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Изд-во Наука, 2002. - 368 с.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и области медицинской биотехнологии и представляет собой антибактериальную композицию, включающую лизостафин в количестве от 1 до 1000 мкг/мл, высокомолекулярный хитозан, с молекулярной массой в диапазоне от 100 до 600 кДа в количестве 10% к массе используемого в композиции лизостафина, загуститель, выбранный из: поливинилового спирта в количестве от 2 до 15 мас. %, или глицерина в количестве от 10 до 90 мас. %, или полиэтиленгликоля в количестве от 1 до 20 мас. %, или поливинилпирролидона в количестве от 10 до 50 мас. % и воду - остальное. Изобретение обеспечивает высокую антибактериальную активность в отношении золотистого стафилококка. 5 пр., 1 ил.

Антибактериальная композиция, включающая лизостафин в количестве от 1 до 1000 мкг/мл, высокомолекулярный хитозан с молекулярной массой в диапазоне от 100 до 600 кДа в количестве 10% к массе используемого в композиции лизостафина, загуститель, выбранный из: поливинилового спирта в количестве от 2 до 15 мас. %, или глицерина в количестве от 10 до 90 мас. %, или полиэтиленгликоля в количестве от 1 до 20 мас. %, или поливинилпирролидона в количестве от 10 до 50 мас. %, и воду - остальное.