СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОСТАФИНА Российский патент 1999 года по МПК C12N9/00 C12N1/06 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к получению ферментного препарата лизостафина.

Известны способы получения очищенных препаратов лизостафина [Sugai M., 1990; Патент Германия C 12 N 9/00; 9/96; 1/20; N 4033752], однако они сложны, многоэтапны, так как включают в себя комбинацию разных методов очистки: высаливание, диализ, многоступенчатая хроматография на различных носителях и требуют для своего исполнения сложного и дорогостоящего аппаратурного и реактивного обеспечения.

Ряд зарубежных фирм (ICN, Sigma) выпускают коммерческие препараты очищенного лизостафина, однако в связи с высокой валютной стоимостью они малодоступны.

Отечественные препараты лизостафина нам неизвестны.

Имеются данные об использовании лизостафина при дифференциальной диагностике стафилококков и микрококков [Pourell B., Caffin Y., 1981; Schleifer K. , Kloos W., 1975] и в молекулярно-биологических исследованиях для разрушения и изучения клеточной оболочки и выделения ДНК стафилококков [Ranhard Y., 1982, Kado C., Liu S., 1981].

При этом, как правило, применяют жидкие супернатанты микробных взвесей штамма-продуцента Staphylococcus simulans, содержащие комплекс экзопродуктов, в том числе, лизостафин. Однако они не обеспечивают стандартности проводимых работ, малоактивны, имеют короткий срок хранения.

Целью предлагаемого изобретения является повышение активности, выхода и стандартности конечного продукта - лизостафина за чет использования специально полученного штамма - суперпродуцента Staphylococcus simulans М-БУ 7-201, а выделение конечного ферментного препарата осуществляют методом ступенчатой диафильтрации.

Предлагаемый способ получения лизостафина с целью его последующего использования позволяет усовершенствовать дифференциальную диагностику стафилококков и выделение их ДНК с применением современных молекулярно-генетических методов исследования.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Штамм-продуцент.

В качестве исходного был использован штамм Staphylococcus spec. RN 3239, обладающий способностью продуцировать лизостафин. В ходе работы штамм был идентифицирован по фенотипическим и генотипическим признакам как Staphylococcus simulans. Методом химического мутагенеза с последующим клонированием был получен штамм-суперпродуцент лизостафина, существенно превосходящий по продуктивности исходный. Были изучены культурально-морфологические, фенотипические свойства и генетические особенности штамма.

Культурально-морфологические свойства: грамположительные клетки, образуют неправильные скопления, неподвижны, капсул и спор не имеют. На мясо-пептонном агаре (pH 7,0-7,4) через 18 часов роста образуют непрозрачные беловатые, круглые с ровным краем колонии, вызывают равномерное помутнение среды при росте в мясо-пептонном бульоне.

Не требователен к питательному субстрату, хемоорганотроф, растет в присутствии NaCl, 15% и 40% желчи.

Биохимическая активность: метаболизм дыхательный и бродильный. Утилизирует глюкозу с образованием кислоты без газа, не способен к утилизации арабинозы, маннозы, сахарозы, лактозы, мальтозы. Гидролизуют аргинин, лизин, отсутствует активность коагулазы, орнитиндекарбоксилазы и фенилаланиндезаминазы, образует каталазу и уреазу. Индол не образуется.

Штамм устойчив к лизоциму (100 мкг/мл), лизостафину (1 ед./мл), чувствителен к антибиотикам - бензилпенициллину, ампициллину, оксациллину, метициллину, стрептомицину, канамицину, гентамицину, линкомицину, левомицетину, хлорамфениколу, эритромицину, олеандомицину, тетрациклину, рифампицину. Нуклеотидный состав ДНК 33,5% ГЦ. Штамм лизируется серийным антистафилококковым бактериофагом.

Характерной особенностью штамма является способность продуцировать в большей степени, чем исходный, лизостафин, что было показано методом диффузии на твердой питательной среде с газоном контрольного штамма Staphylococcus aureus CCM 885. При этом за счет действия лизостафина через 24 часа при 37^oC образовывались зоны лизиса диаметром 7-10 мм.

Полученный и охарактеризованный штамм-суперпродуцент лизостафина Staphylococcus simulans N М-БУ 7-201 депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича под номером 246.

Пример 2. Условия накопления целевого продукта (лизостафина).

С целью накопления лизостафина штамм-продуцент культивируют в шюттель-аппарате в течение 18-24 часов при температуре 28^oC на мясо-пептонном бульоне pH 7,0-7,4 в условиях непрерывного перемешивания при 45 об/мин. После окончания культивирования добавляют мертиолат до конечной концентрации 1: 10000. После этого микробные клетки отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 25 минут. Полученный супернатант используют для выделения целевого продукта.

Пример 3. Выделение лизостафина.

Выделение лизостафина проводят методом ступенчатой диафильтрации на полых волокнах по следующей схеме:
1) концентрирование 1 л супернатанта до 100 мл на модуле ВПУ-15 (0,2 м²) в течение 45 минут при 0,5 атм.

2) диафильтрация 100 мл концентрата на модуле ВПУ-15 (0,2 м²) против 1 л (10 объемов) 0,05 М фосфатного буфера pH 7,5 в течение 2 часов при 0,5 атм.

3) диафильтрация 100 мл диализата на модуле ВПУ-50 (0,2 м²) против 500 мл (5 объемов) 0,05 М фосфатного буфера pH 7,5 в течение 10 минут при 0,5 атм.

4) концентрирование 500 мл фильтрата на ВПУ-15 (0,2 м²) в течение 1 часа до 100 мл при 0,5 атм.

5) концентрирование 100 мл фильтрата на ВПУ-15 (0,02 м²) до 40-50 мл течение 30 минут при 0,5 атм.

Полученный конечный продукт содержит очищенный лизостафин, что подтверждается методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. При этом показано, что в конечном продукте содержится одна белковая зона с молекулярной массой 25 кДа. Примесей других белков не обнаружено. Соблюдение описанного выше режима выделения позволяет обеспечить высокий выход и стандартность конечного продукта.

Полученный лизостафин разливают по 5 мл в ампулы и лиофильно высушивают.

Пример 4. Испытание свойств очищенного лизостафина.

С целью проверки способности полученного лизостафина лизировать наружную оболочку стафилококков были проведены сравнительные исследования с различными видами микроорганизмов. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Из приведенных данных видно, что очищенный лизостафин способен лизировать большинство видов и штаммов стафилококков и не лизирует оболочку микрококков, а также представителей сарцин, бацилл и некоторых коагулазоотрицательных стафилококков. Таким образом, полученный лизостафин может быть использован при идентификации стафилококков и микрококков трудно дифференцируемых по другим фенотипическим характеристикам.

Кроме того, полученный очищенный лизостафин применяли для разрушения клеточной оболочки у различных видов стафилококков с целью последующего выделения и изучения их ДНК. Полученные результаты представлены в таблице 2 и 3.

Из приведенных результатов видно, что полученный описанным выше способом очищенный лизостафин обладает высокой активностью по лизису клеточной стенки при выделении ДНК из Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidеrmidis. Из 1 г клеток представителей этих видов извлекалось 2-3 мг нативной ДНК хорошего качества и чистоты. Клетки остальных исследованных видов лизировались существенно слабее.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, в частности к получению микробного ферментного препарата лизостафина. Способ включает выращивание продуцента Staphylococcus simulans М-БУ 7-201 на питательной среде и выделение конечного ферментного препарата методом ступенчатой диафильтрации. Предлагаемый способ увеличивает выход и стандартность конечного продукта, а также позволяет усовершенствовать дифференциальную диагностику стафилококков и выделение их ДНК с применением современных молекулярно-генетических методов исследования. 3 табл.

Способ получения лизостафина, предусматривающий выращивание продуцента Staphylococcus simulans на питательной среде с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Staphylococcus simulans М-БУ 7-201 (ГИСК N 246), а выделение целевого продукта осуществляют методом ступенчатой диафильтрации.