СЕЛЕКТИВНАЯ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ВЫЯВЛЕНИЯ ВИДОВ РОДА STREPTOCOCCUS Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/14 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к микробиологии, и в частности к клинической и ветеринарной диагностике, контролю качества продуктов питания и исследованиям загрязнения окружающей среды, при которых необходимо выделение и выявление видов Streptococcus.

Стрептококки считаются родом, требовательных к питательным средам микроорганизмов, идентификация которых является чрезвычайно важной в клинической диагностике. В классификации, разработанной Lancefield, имеются многочисленные патогенные для человека виды, такие как: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Enterococcus avium, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, возбудители септицемии, неонатального менингита, эндокардита и инфекций мочевых путей (Giuseppe, N. y Vito Mar N., 1989, Diccionario de Bacteriologia Humana, ediciyn espacola Menarini). Хотя стрептококки не являются микроорганизмами, которые чаще вызывают сепсис мочевых путей, их выявление необходимо, так как, в частности, гемолитические стрептококки являются наиболее частой причиной неонатального сепсиса, поэтому их выявление позволяет интранатально профилактически вводить антибиотики и предотвращать перинатальную инфекцию данным микроорганизмом (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. y Salgado, M., 1998, Unilidad de un medio selectivo disao-caldo para la detecciyn de esreptococo del grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol 16(2). Частота раннего неонатального сепсиса составляет 1,48-4,08/1000 живых новорожденных детей со смертностью 8,7-10,5% (Montero, R.; Barbadillo, F.; Anso, S.; Marrero, M.; Carpintero I.; Sastre E. у Alonso В.: Sepsis neonatal por Streptococcus agalactiae. Qué hacer? An-Esp-Pediatr. 1998; 48(3), p.288-92; Juncosa, Т.; Bosch, J.; Dopico, E.; Guardia, C.; Lite, J.; Sierra, M.; Barranco, M.; Matas, L.; Sanchez, F.; Sanfeliu, I. y Vinas, L. 1998. Infeccion neonatal por Streptococcus agalactiae. Estudio multicéntrico en el área de Barcelona. Enferm-Infecc-Microbiol-Clin.; 16(7), p. 312-5).

Возбудителем указанного заболевания главным образом является Streptococcus agalactiae, обычный обитатель женских половых путей. Также обнаруживаются более новые, неизвестные патогены мочевых путей, такие как Streptococcus urinalis sp.nov., хотя они имеют сходство с Streptococcus pyogenes и Streptococcus canis. Предполагается новый вид рода Streptococcus, и его таксономическим названием является Streptococcus urinalis sp.nov., тип штамма CCUG 41590T (Collins, M.D.; Hutson, R.A.; Falsen, E.; Nikolaitchouk, N.; La Claire, L. and Facklam, R.R. 2000. An unusual Streptococcus from human urine, Streptococcus urinalis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol; 50 Pt 3, p. 1173-1178).

В настоящее время на рынке имеется много культуральных сред, которые разработаны для выделения и/или выявления различных видов рода Streptococcus. Среди них можно назвать: кровяной агар, кровяной агар Колумбия, триптон-соевый агар с добавлением крови, агар с настоем мозга и сердца и другие (Manual of cultivation Means OXOID. 1995. UNIPATH, Espaca; MERCK Microbiology Manual. 2000. Merck KgaA, Darmstadt; Manual DIFCO de Bacteriologia. 1984. Décima Editiyn, Francisco Soria Melguizo, S.A., Madrid).

Указанные неселективные среды не позволяют различать патогенные и непатогенные виды. Указанные среды являются неизбирательными и позволяют расти другим грамположительным и грамотрицательным бактериям, которые конкурируют со стрептококками за питательные вещества. Например, в случае Proteus штаммы, которые при развитии «расползаются», мешают выделению колоний-мишеней.

В составах сред нет высокопитательных веществ, поэтому необходимо добавление крови, что мешает обработке и повышает риск загрязнения. Кроме того, это не позволяет продлить срок годности среды, так как кровь является биологически нестабильным соединением.

Среду CLED, предлагаемую ранее упомянутыми фирмами, широко используют в лабораториях, и она считается одним из лучших вариантов. Она позволяет расти всем патогенам мочевых путей, в том числе Streptococcus, и другим грамположительным микроорганизмам, которые невозможно различить, так как они обладают одними и теми же характеристиками культуры. Рост Streptococcus является медленным. Энтерококки (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Enterococcus avium) можно спутать с видами Shigella.

В руководстве MERCK по культуральным средам (Merck Microbiology Manual, 2000, Merck KgaA, Darmstadt) описана агаровая среда и бульон для избирательного обогащения Streptococcus, в котором используют азид натрия и сульфит натрия в качестве ингибиторов грамотрицательных организмов. В качестве недостатка указанных сред можно назвать их высокую токсичность из-за присутствия азида натрия (высокотоксичного ингредиента) и невозможность отличать виды в бульоне, который используют специально для стимуляции роста микроорганизмов.

В руководстве OXOID (Manual of culture media, OXOID, 1995, UNIPATH, Spain) описана селективная среда для Streptococcus, которая требует добавления крови и селективной добавки, которая содержит сульфат колистина и оксолиновую кислоту. Однако для нее также обязательна инкубация в атмосфере 5% CO₂. Вместе с указанными выше трудностями для нее требуется добавление крови, использование антибиотиков в качестве добавки. Кроме того, это затрудняет приготовление среды и не гарантирует фактического ингибирования нежелательной сопутствующей микробиоты вследствие проявления, причем с каждым разом все более частого, явления резистентности к антибиотикам, главным образом у грамотрицательных организмов.

Кроме того, необходимость инкубировать среду в атмосфере 5% CO₂ делает неудобным способ выделения в тех случаях, когда этот способ не направлен на идентификацию или установление различий, так что необходимо использовать культуральную среду или биохимические и серологические тесты, чтобы идентифицировать виды-мишени Streptococcus.

В упомянутом выше руководстве также описан состав селективной среды для Streptococcus/Staphylococcus, которая требует добавления стерильной крови и добавки антибиотика, налидиксовой кислоты и сульфата колистина. Применение этого состава имеет такие же недостатки, как недостатки, указанные выше в отношении использования крови и антибиотиков.

Селективной средой для быстрого выделения Streptococcus agalactiae и других стрептококков, связанных с маститом у коров, является среда Эдварда (модифицированная). Она описана в руководстве OXOID 1995 г. Это среда с добавлением крови, и она содержит сульфат талия и кристаллический фиолетовый в качестве ингибиторов. Указанная диагностика обеспечивает рост Streptococcus agalactiae и других Streptococcus при использовании подобно принципу идентификации только гидролиза эскулина. Группа стрептококков D образует осадок в среде (черные колонии) вследствие их метаболической активности, а другие микроорганизмы дают отрицательный ответ (голубые колонии), и их невозможно различить.

Кристаллический фиолетовый, используемый в качестве селективного агента, может ингибировать рост клетки Streptococcus. Сульфат талия также считается высокотоксичным соединением, вредным для здоровья человека и чрезвычайно опасным для окружающей среды. Следовательно, в то же самое время это очень неудобно для способа производства, приготовления и избавления от отходов среды.

Среду Тодда-Хевитта с гентамицином и налидиксовой кислотой, колистиновый кровяной агар с колистином и налидиксовой кислотой, бульон Мюллера-Хинтона с 5% сывороткой и амикацином (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. у Salgado, M. 1998. Utilidad de un medio selectivo disco-caldo para la detecciyn de estreptococo del grupo В en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 16(2)) и среду с азидом, эскулином и оксолиновой кислотой уже использовали для выявления и идентификации конкретных видов Streptococcus. Среды имеют недостатки, сходные с описанными ранее (Figueras, 15 M.J; Inza, I.; Polo, F. and Guarro, J. 1998. Evaluation of the oxolinic acid-esculin-azide medium for the isolation and enumeration of faecal streptococci in a routine monitoring programme for bathing waters. Can. J. Microbiol. 44, p. 998-1002).

На группу изобретений, которые направлены на культивирование конкретных видов Streptococcus, поданы заявки на выдачу патентов или получены патенты. Некоторые из них указаны ниже.

De la Rosa Fraile описывает дегидратированную среду для идентификации Streptococcus группы B в патенте EP 1098002 A1, представленном 05.09.2001 (Dehydrated immediate reconstruction culture medium to identify group В Streptococci (Streptococcus agalactiae) by detection of their pigment), в которой дифференциацию осуществляют по продукции их собственного пигмента. Сущность изобретения заключается в добавлении к среде Granada сефадекса 200 в качестве гелеобразующего агента.

Ограничения указанных выше изобретений можно подытожить, как показано ниже:

- среда позволяет идентифицировать только Streptococcus agalactiae,

- необходимо добавление конской сыворотки,

- приготовленная среда имеет срок годности менее 2 месяцев вследствие нестабильности соединений,

- существует необходимость в дополнительном добавлении таких антибиотиков, как метронидазол и колистин, что уже представляет собой недостатки, сходные с недостатками, описанными для предыдущих составов,

- нельзя наблюдать характерные свойства культуры микроорганизма, так как среда является полутвердой.

Приготовление является сложным и включает в себя различные стадии, такие как приготовление основной среды, добавление геля, встряхивание, чтобы выловить пузырьки, добавление добавок и инкубирование в бульоне Maria.

За несколько лет до этого тот же самый автор разработал состав для выявления Streptococcus agalactiae Years before the same author developed a formulation for the detection of Streptococcus agalactiae (De La Rosa Fraile, Manuel; Patente: ES 2088827, 1996.09.16. Culture medium for Streptococcus agalactiae which activates the formation of pigment by amylases and/or (G((alpha 1-4)G) (n(2) glucooligosaccharides added as chemical compounds, as polysaccharide hydrolysates or generated in the same medium using enzymes and polysaccharides), который содержал антибиотики в форме добавки, амилазы, мальтоолигосахариды, крахмал для продукции характерного пигмента указанного микроорганизма. Этот состав сложен в приготовлении, он содержит нестабильные ферменты, вносимые в качестве добавки, и сложные химические и нестабильные соединения (мальтоолигосахариды). Поэтому его применение для получения культуральных сред не получило широкого распространения.

Другая среда, разработанная для идентификации гемолитических Streptococcus группы B, основана на образовании цветного оранжевого пигмента. Она была разработана Tanaka Yoshihiro и Takahashi Hisayoshi (JP 9313171 A2, 1997.12.09. Culture medium for group B hemolytic Streptococcus). Среда содержит глюкозу, пируват натрия, мясной пептон, MgSO₄, MOPS-фосфат, метотрексат и антибактериальное средство (неактивное по отношению к Streptococcus группы B). При использовании такого состава другие стрептококки не могут быть идентифицированы.

В патенте JP 59159797 (Kojima, H., et al. 1984.09.10. Culture medium for selective proliferation of Streptococcus hemolyticus) описана селективная среда для размножения Streptococcus hemolyticus. Она содержит липиды и жирные кислоты в качестве селективных агентов для стимуляции роста данного вида. Применение сои в этой среде усложняет ее приготовление, а также селективные агенты не ингибируют рост других видов-мишеней Streptococcus.

Deyloff John защитил патентом культуральную среду для дифференцированного выявления Streptococcus mutans (US 4468456, 1984.08.28. Medium for differentiating Streptococcus mutans), состоящую из фосфатных солей, агара, дрожжевого экстракта, сахарозы и индикатора pH. Приготовление продукта является сложным, так как он состоит из двух отверждаемых слоев. К одному из которых необходимо добавлять суспензию фосфата кальция, который труднорастворим. Среда является недостаточно ингибирующей для других грамположительных видов.

Другие среды и способы были разработаны для культивирования конкретных видов Streptococcus, чтобы получать некоторые метаболиты или даже для диагностики. Эти продукты в любом случае обеспечивают возможность дифференциации или выявления значительного количества видов Streptococcus. Среди них можно отметить Park et al. и Inoue et al. (US 5496726, 1996. Streptococcus zooepidemicus medium and process for preparing hyaluronic acid; US 4 306 024, 1981.12.15. Process for cultivation of hemolytic Streptococcus pyogenes).

Blareau Jean Pierre и соавторы (патент: FR 2723960-A1, 1994.08.31. Cultures of Streptococcus thermophilus to activite beta-galactosidase elevee, leur proceeds d'obtention, et leurs utilisations) запатентовали культуральную среду для Streptococcus thermophilus, которая содержит только гидролизаты белков молока, лактозу и дрожжевой экстракт. Среда не предназначена ни для клинической диагностики, ни для контроля за качеством пищевых продуктов и не является селективной средой для выявления Streptococcus.

Другая группа изобретений, наоборот, направлена на культивирование нескольких родов или видов Streptococcus и не позволяет осуществлять среди них дифференциацию или соответствующую идентификацию, различные примеры указаны далее.

В последние годы возросло применение хромогенных и флуорогенных субстратов, которые включали в традиционные среды или в новые культуральные среды, разработанные специально для некоторых микроорганизмов в соответствии с их метаболическими потребностями. Указанные хромогенные реакции имеют некоторые преимущества по сравнению с обычными средами, такие как быстрота получения результатов, высокая специфичность и чувствительность вследствие деградации специфичного субстрата фермента.

Manafi в различных статьях и всесторонних обзорах отмечал, что хромогенные и флуорогенные субстраты чаще используют в качестве соединений для культуральных сред. Кроме того, он дал объяснения их возможным применениям при идентификации некоторых видов Streptococcus. Например, в статье «New developments in chromogenic and fluorogenic culture media» (Manafi, M. 2000. International Journal of Food Microbiology 60, p. 205-218) он обращается к указанным средам, которые имеют некоторые ограничения или недостатки:

- Enterolert (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine) и планшет для микротитрования MUST (Sanofi, France), которые содержат специфичные флуорогенные субстраты для D-глюкозидазы, предназначенные для выявления энтерококков в воде. Хотя они не позволяют проводить дифференциацию и идентификацию других стрептококков и содержат в качестве специфичного маркера фермента только флуорогенный субстрат.

- Агар предназначали для подсчета энтерококков в морской воде или пресной воде. Он содержит налидиксовую кислоту, циклогексимид, хлорид трифенилтетразолия и индоксил-β3D-глюкозамид в качестве субстрата. Недостатком данной среды является применение антибиотиков в качестве селективных агентов, а также наличием единственного ферментативного маркера, который делает невозможной идентификацию других Streptococcus. Необходимо длительные периоды инкубации (24-48 часа), и чувствительность среды не так высока.

- Модификация указанной среды уменьшением концентрации хлорида трифенилтетразолия и увеличением концентрации индоксил-βD-глюкозида уменьшала период инкубации до 24 часов, но не увеличивала диагностические возможности среды.

- В бульоне для энтерококков Chromocult (CEB) (BBL) и бульоне для энтерококков Readycult (MERCK) используют 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид в качестве субстрата для идентификации Enterococcus и азид натрия для ингибирования других микроорганизмов. Однако в среде выявляются ложно-позитивные результаты, такие как Leuconostoc, Lactococcus lactis и Aeromonas sp. Другие стрептококки не идентифицируются, и среда содержит токсичные ингредиенты.

Ориентировочная среда CHROMagar (BBL) делает возможной предполагаемую одновременную идентификацию грамположительных, грамотрицательных организмов и дрожжей (Carricajo, A.; Boiste, S.; Thore, J.; Aubert, G.; Gille, Y and Freydiere, AM. 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Samra, Z.; Heifetz, M.; Talmor, J.; Bain, E. and Bahar, J. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol., 36(4), p. 990-994; Hengstler, KA; Hammann, R. and Fahr, AM. 1998. Evaluation of BBL CHROMagar orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol. 36(5), p. 1464; Merlino, L; Siarakas, S.; Robertson, GJ.; Funnell, GR.; Gottlieb, T and Bradbury, R. 1997. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiating and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcns species. J Clin Microbiol 35(8), p. 2190).

К микроорганизмам, которые можно идентифицировать, относятся стрептококки (группы D, B и C), хотя группы B и C невозможно различить, так что для их идентификации необходимы дополнительные биохимические тесты. Большое разнообразие окраски сильно затрудняет интерпретацию результатов, и в некоторых случаях требуется обращать особое внимание на морфологию, размер и характеристики колоний (блеск или непрозрачность), что еще больше мешает интерпретации результатов. Сходство окраски некоторых стрептококков с микроорганизмами родов Klebsiella, Enterobacter и Citrobacter заставляет проводить дополнительные тесты, что требует больше часов для осуществления. Также бросается в глаза, что среда является чувствительной к свету, который изменяет исходную окраску, инкубация и регистрация также должны проводиться немедленно.

Среда UTI medium (OXOID Inc.) предназначена для предполагаемой идентификации и дифференциации микроорганизмов, вызывающих инфекцию мочевыводящих путей. Она содержит хромогенный субстрат x-glu для идентификации энтерококков. Этот состав имеет тот недостаток, что другие стрептококки не могут быть идентифицированы, растут другие грамотрицательные микроорганизмы, которые вообще присутствуют при инфекциях мочевых путей в более высоких концентрациях, чем Streptococcus, и его применение ограничено образцами мочи.

В 1999 Alain Rambach запатентовал способ идентификации микроорганизмов по меньшей мере с использованием двух хромогенных субстратов (US 5962251, 1999.10.05 «Method for the identification of microorganisms with at least two chromogens»). Среда содержит агар, пептон, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и углеводы (глюкозу), а также хромогенные субстраты, производные индоксила (среди прочих броминдоксил, хлориндоксил, дихлориндоксил, хлорброминдоксил). Ее главное применение заключается в выявлении присутствия или отсутствия дрожжей, относящихся к роду Candida, в частности Candida albicans и Candida tropicalis, хотя микроорганизмы других родов, а также грамположительные и грамотрицательные организмы растут с разными тонами окраски и среди прочих стрептококки. Однако разнообразие развивающихся организмов, подобно предыдущему случаю, замедляет интерпретацию результатов. Имеет место большая конкуренция за субстраты, так что стрептококки могут быть ингибированы, и становится невозможно отличить друг от друга виды Streptococcus (не относящиеся к группе D).

Другая группа хромогенных культуральных сред, разработанных для выявления, подсчета и идентификации мочевых патогенов, которые, в частности, позволяют идентифицировать Streptococcus группы D, включает CPS ID2 (bioMerieux, France), Uriselect 3 (Sanofi Diagnostic) и Rainbow UTI (Biolog, USES) (Carricajo et al., 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Navarro et al., 1996. Evaluation of chromogenic medium CPS ID2 (bioMerieux) in urine cultures. Enferm Infecc Microbiol Clin Apr; 14(4), p.215-9; Reisner and Austin, 1997. Evaluation of CPS ID2 chromogenic agar as a single medium for urine culture. Diagn Microbiol Infect Dis Jul; 28(3), p.113-7; Willinger and Manafi, 1995. Evaluation of a new chromogenic agar medium for the identification of urinary tract pathogens. Lett Appl Microbiol May 20(5), p.300-2) и другие (Bochner B. US 5464755. 1995.10.07. Microbiological medium and method of assay; Yagupsky et al., 2000. Clinical evaluation of a novel chromogenic agar dipslide for diagnosis of urinary tract infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19, p. 694-698).

Chen, Chun-Ming и соавторы подали заявку на выдачу патента, относящегося к способу и среде для выявления резистентных к ванкомицину энтерококков (Chen, Chun-Ming et al. заявка на выдачу патента 20020132285-A1. 2002.09.19. Method and medium for detecting vancomycin-resistant enterococcus). Изобретение заключается в применении ингредиента, который дает реакцию, будучи метаболизированным микроорганизмами, в данном случае ферментов β-D-глюкозидазы и пирролидонилариламидазы. Следует отметить, что эта среда не позволяет идентифицировать ни чувствительные к ванкомицину энтерококки, ни другие виды Streptococcus. Ее приготовление является трудным, так как требует добавления антибиотиков, и ванкомицин не ингибирует некоторые грамотрицательные бактерии, которые могут расти в среде. Требуются дополнительные тесты для идентификации видов.

В заявке на выдачу патента США номер 20020086278-A1, 2002.06.04, Gosnell и соавторы (Chromogenic half containing blood or hemin) описывают среду, которая содержит кровь или гемин, а также хромогенные субстраты, такие как, среди прочих, фуксин, x-глюкозидаза, x-глюкуронид, Mag-фосфат. Среда дает возможность для роста и идентификации различных видов по морфологическим характеристикам, появлению разнообразных оттенков цвета, флуоресценции и гемолитическим реакциям. Это изобретение можно рассматривать как ближайший прототип, и указанная среда обладает следующими недостатками.

- Присутствие крови или гемина создает трудности для правильной интерпретации хромогенных реакций. Кроме того, эта композиция позволяет ингибировать грамотрицательные бактерии, среди которых большое разнообразие микроорганизмов с ферментативной активностью, сходной с активностью Streptococcus.

- Период стабильности среды ограничен вследствие присутствия биологических соединений (кровь или гемин), и ее приготовление неудобно.

- Эта культуральная среда не содержит ингибирующих агентов, не является селективной средой, таким образом, она позволяет развиваться другим грамположительным и грамотрицательным родам, которые конкурируют за питательные вещества, и, как следствие, микроорганизмы-мишени (Streptococcus) не могут расти соответствующим образом.

- Применение добавок крови и гемина осложняет приготовление этой среды и увеличивает риск ее загрязнения.

- Необходимо использование дополнительных биохимических тестов для дальнейшего дифференцированного выявления Streptococcus, что требует дополнительного времени для проведения соответствующей идентификации микроорганизмов-мишеней. В частности, необходимо проведение дополнительного теста PYR, чтобы дифференцированно выявить Streptococcus pyogenes группы D Streptococcus (Enterococcus).

- Для идентификации некоторых микроорганизмов необходимо учитывать морфологию, размер и другие характеристики колоний, которые очень изменчивы, так как они зависят, наряду с другими факторами, от типа образца, начальной концентрации микроорганизма и сопутствующей микробиоты.

- Возможность того, что микроорганизмы других родов растут подобно Proteus, основной характеристикой которых является «ползучее» образование в среде, делает невозможной идентификацию колоний.

- Другие микроорганизмы, которые обладают гидролитической способностью по отношению к белкам, могут гидролизовать альбумин и мешать идентификации.

- Для приготовления среды хромогенные субстраты могут быть добавлены к свежей среде, приготовленной асептически, так как некоторые из них нестабильны при высоких температурах, что осложняет их приготовление.

- Растворы хромогенных субстратов в некоторых случаях образуют нерастворимый осадок, который может быть более нестабильным после хранения в течение одной недели, что ограничивает период пригодности диагностики «in vitro».

- При использовании подобно основе шоколадного агара среду инкубируют в атмосфере 5% CO₂.

- Некоторые хромогенные субстраты необходимо растворять в органическом растворителе диметилсульфоксиде (ДМСО), что затрудняет приготовление среды.

- В некоторых случаях (пример 3) стрептококки группы D окрашиваются так же, как другие микроорганизмы (голубые), например: Candida albicans, Staphylococcus epidermidis и некоторые грамотрицательные организмы.

- Субстраты, в частности фуксин, могут делать более темной окраску кровяной среды после инкубации, что снижает ясность считывания информации и затрудняет наблюдение гемолитических реакций.

- Хромогенные субстраты, которые дают окрашивание до фиолетовых, красных и пурпурных колоний, не воспринимаются соответствующим образом на красном фоне среды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является получение селективной среды для выделения и выявления видов рода Streptococcus, облегчающей дифференциацию Streptococcus, имеющих клиническое значение, таких как: Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes и Streptococcus группы D (Enterococcus) в ранние периоды культивирования (2-24 часа) и с высокой чувствительностью и аналитической специфичностью.

Новизна предлагаемого изобретения заключается в комбинации специально подобранных основных питательных веществ в количестве от 15 до 58 г/л, что обеспечивает содержание общего азота, по существу полученного из белков, от 10 до 14%. Кроме того, новизна заключается в специально разработанной смеси ингибиторов грамотрицательных микроорганизмов в количестве от 0,55 до 1,63 г/л. Кроме того, новизна заключается в смеси хромогенных и/или флуорогенных субстратов, которая должна выявлять по меньшей мере один специфичный фермент каждого вида, в количестве от 0,3 до 1,5 г/л, и соединениях, являющихся индикаторами активности дезаминазы, в количестве от 1 до 3 г/л.

Исходная смесь питательных основ состоит из экстрактов и гидролизатов разного происхождения, в частности, выбранных из

- гидролизата бычьей крови от 5 до 10 г/л,

- экстракта бычьего сердца от 1 до 12 г/л,

- ферментативного гидролизата бычьей сердечной мышцы от 1 до 5 г/л,

- ферментативного гидролизата белков молока от 5 до 20 г/л,

- ферментативного гидролизата белков соевых бобов от 2 до 15 г/л,

- ферментативного гидролизата тканей животных 1-5 г/л,

- аутолизата или гидролизата дрожжей Saccharomyces cerevisiae от 2 до 15 г/л.

Ни разу не описанная специальная смесь ингибиторов включает в себя комбинацию

ацетата талия от 0,55 до 1,6 г/л,

налидиксовой кислоты от 0,005 до 0,030 г/л.

Другой особый признак изобретения заключается в применении смеси хромогенных и флуорогенных субстратов, которая выявляет активность фосфатазы, глюкозидазы и глюкуронидазы, чтобы дифференцировать различные виды Streptococcus. Смесь содержит пара-нитрофенилфосфатную соль динатрия (PNP) от 0,2 до 0,8 г/л; x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид, Mu-glu (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозид), Salmon-glu (6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид) от 0,05 до 0,4 г/л и x-gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида), Magenta-Gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида) и MUG (тригидрат 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида) от 0,05 до 0,2 г/л.

Указанные хромогенные вещества объединяются в нестандартной форме, чтобы обеспечить появление окраски или флуоресценции, разной для каждого выявляемого вида. Среди них можно назвать

a) PNP+x-glu+Magenta-gluc или MUG;

b) PNP+Salmon-glu+x-gluc или MUG;

c) PNP+MU-glu+Magenta glue или x-gluc.

Другой особый аспект изобретения заключается в том, что добавляют несколько соединений, которые показывают активность дезаминазы в среде, таких как соли тривалентных металлов, предпочтительно цитрат железа-аммония в количестве от 0,5 до 1,0 г/л, и ароматические аминокислоты, предпочтительно фенилаланин и триптофан, в количестве от 1,0 до 2,0 г/л.

К указанной выше композиции добавляют от 10,0 до 14,0 г/дл агара. Полученная среда позволяет наблюдать характеристики культуры организмов-мишеней.

Приготовленная среда имеет значение pH от 7 до 7,4, и ее концентрация в воде может варьироваться от 25 до 80 г/л.

Среда впервые позволяет выделять и выявлять исключительно различные виды Streptococcus, в основном патогены человека, только по специфичной окраске колоний некоторых родов и изменению окрашивания среды. Впервые предлагается селективная среда, которая помогает одновременно отличать стрептококки группы D (Enterococcus) от остальной их части и различать виды рода Streptococcus. Например, Streptococcus agalactiae и Streptococcus pyogenes, которые растут хорошо, в то время как другие грамположительные и грамотрицательные виды подавлены.

Преимущества среды, предлагаемой в настоящем изобретении, заключается в следующем.

- Впервые облегчается дифференцирование патогенных и большинства непатогенных видов Streptococcus.

- Среда является высокоселективной для Streptococcus, ингибирует большинство грамотрицательных видов бактерий, за исключением Proteus mirabilis ATCC 7002, рост которой сильно ингибирован в среде, кроме того, этот организм может быть идентифицирован по изменению окраски среды до окраски, отличной от среды в случае видов Streptococci. Также очень немного видов других ингибированных грамположительных организмов могут развивать минимальный рост в среде, и они принимают окраску, которая не мешает обильному росту микроорганизмов-мишеней.

- Среда содержит сложную и новую смесь питательных основ, полученных из различных источников с разными составами, которая обеспечивает присутствие аминокислот, пептидов, полипептидов, протеаз и пептонов, и неожиданно они способствуют обильному росту видов-мишеней и позволяют исключить нестабильные вещества, такие как гемин и кровь.

- Фактом значимости и новизны является исключение ферментативного гидролизата крови в указанной выше смеси. Это обеспечивает в среде веществ, полученных из крови или их фракций, которые необходимы для роста Streptococcus, и позволяет избежать трудностей при идентификации. С другой стороны, расщепленные белки крови не влияют на стабильность среды.

- Вследствие присутствия достаточного количества питательных веществ для быстрого роста стрептококков в среде и ингибирующих веществ, которые обеспечивают отсутствие других конкурирующих организмов, представители данного рода могут быть выявлены быстрее и могут быть выделены и идентифицированы не позже чем через 6-24 часа инкубации.

- Значения чувствительности и специфичности являются более высокими по той причине, что стрептококки не могут быть спутаны с грамотрицательными бактериями, такими как: Shigella и Escherichia coli, так как указанные микроорганизмы не растут в среде. Также немногие грамположительные виды, которые способны расти в среде (Staphylococcus xylosus и Staphylococcus saprophyticus) имеют другие характерные признаки культуры и являются почти полностью ингибированными, так, их нельзя спутать с остальной частью микроорганизмов. Если какой-либо штамм имеет характерные признаки роста, сходные с Streptococcus, его можно отличить по прямому каталазному тесту на планшете.

- В настоящем изобретении не используют ни высокотоксичных веществ, ни загрязнителей окружающей среды. По этой причине среду можно легко приготовить, например, как в промышленном масштабе, так и в лаборатории, при соответствующих и специальных условиях процесса.

- Эффективность ингибиторов, указанных в составе, позволяет избегать применения нестабильных антибиотиков, так что приготовление среды является простым, и не возникает ошибок идентификации вследствие явлений резистентности к противомикробным агентам.

- Комбинация ингибиторов и концентрация в среде и их соотношение с питательными веществами делает возможным то, что ни один вид Streptococcus не ингибирован в среде. Данный факт делает среду очень подходящей, как никогда ранее, для специфичной диагностики данного рода.

- Может быть получен более быстрый диагноз, поскольку когда стрептококки-мишени соответствующим образом выявляются и различаются с высокими значениями чувствительности и специфичности, нет необходимости в проведении дополнительных биохимических тестов.

- Приготовление этой среды чрезвычайно просто, так как в некоторых случаях не нужно автоклавировать, а в других необходимо добавить только одну добавку.

- Стабильность приготовленной среды высокая, поскольку она содержит ингибиторы большинства загрязнителей окружающей среды и не содержит нестабильных вещества (таких как гемин, кровь и антибиотики).

- Когда идентификацию бактерий-мишеней осуществляют только по характерным признакам культуры (окраска среду или колонии), то это исключает необходимость it excludes the necessity to observe подробно исследовать морфологические характеристики колоний, облегчая интерпретацию результатов для обученного, но не специального персонала.

- Применение более чем одного ферментного маркера для дифференциации разных видов рода Streptococcus увеличивает диагностическую специфичность и чувствительность.

- Состав, о котором сообщается в заявке, облегчает приготовление среды с разными концентрациями для множества применений (например, с основной концентраций в гелеобразной среде, двойной концентрацией в способе мембранного фильтрования или в форме бульона и еще более высокой концентрацией для миниатюрных систем).

- Указанной средой можно заменить применение разных традиционных или хромогенных сред, используемых при идентификации разных видов в пределах рода Streptococcus.

- Предлагаемый состав способствует его применению при скрининге Streptococcus в клинических или ветеринарных образцах, в воде и других элементах окружающей среды, а также в продуктах питания.

- Осуществляют выделение и одновременную идентификацию в одну стадию в итоге с уменьшением времени, ресурсов и персонала.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для определения состава среды компоненты, используемые в препарате, предпочтительно представляли собой твердые вещества. Описание стадий, которые должны быть осуществлены для приготовления среды, представлены ниже.

Смесь питательных основ, общее содержание азота в которых составляет от 10 до 14%, просеивают, чтобы получить однородность по размеру частиц.

Количество указанных ингредиентов белковой природы варьирует от 15 до 58 г/л. Конкретно пределы количества описаны ниже.

- гидролизат бычьей крови от 5 до 10 г/л,

- экстракт бычьего сердца от 1 до 12 г/л,

- ферментативный гидролизат бычьей сердечной мышцы от 1 до 5 г/л,

- ферментативный гидролизат белков молока от 5 до 20 г/л,

- ферментативный гидролизат белков соевых бобов от 2 до 15 г/л,

- ферментативный гидролизат животной ткани 1-5 г/л,

- аутолизат или гидролизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae от 2 до 15 г/л.

Селективные агенты выбраны из: ацетата талия от 0,55 до 1,6 г/л и налидиксовой кислоты от 0,05 до 0,030 г/л. Таким же образом их просевают, чтобы подготовить для смешивания с остальной частью соединений. Предварительно смешивают хромогенные и флуорогенные соединения для выявления активности глюкозидазы, фосфатазы и глюкуронидазы в количествах от 0,3 до 1,5 г/л. Кроме того, их можно перед гомогенизацией измельчить и просеять. Если процедура смешивания эффективна и при взвешивании количество предварительной смеси равно сумме количеств каждого компонента в композиции, то должно достигаться соответствующее распределение каждого компонента.

В соответствии с назначением среды хромогенные и флуорогенные субстраты могут быть выбраны из

пара-нитрофенилфосфатной соли динатрия (от 0,2 до 0,8 г/л);

x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозида, Mu-glu (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида), Salmon-glu (6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозида) (от 0,05 до 0,4 г/л);

x-gluc (циклогексиламмониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида), Magenta-Gluc (циклогексиламмониевой соли 5-бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида) и MUG (тригидрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида) (от 0,05 до 0,2 г/л).

Получали структуру смеси хромогенных и флуорогенных веществ, которые могут деградироваться по меньшей мере одним ферментом каждого вида. Комбинации, которые обеспечивают появление окрасок или различной флуоресценции для каждого вида, описаны ниже:

PNP+x-glu+Magenta-gluc или MUG

PNP+Salmon-glu+x-gluc или MUG

PNP+Mu-glu+Magenta-gluc или x-gluc

Гелеобразующий агент, предпочтительно агар, с плотностью от 400 до 700 г/см² используют в диапазоне от 10,0 до 14,0 г/л, в частности, для твердой среды. Перед добавлением к среде он должен быть высушен и просеян.

Все указанные выше соединения, а также предварительную смесь объединяют и гомогенизируют до достижения единообразной смеси со значением pH от 7,0 до 7,4. Смесь распределяют в плотно закрытые флаконы, которые защищают от света и хранят при температуре окружающей среды.

Порошок суспендируют в дистиллированной или деионизованной воде в количестве от 30 до 80 г/л.

Композицию можно приготовить в лабораторном масштабе, взвешивая ингредиенты по отдельности внутри сосуда и выдерживая указанные выше пропорции. Затем постепенно добавляют воду к порошкообразной смеси вплоть до достижения полного растворения. Тщательно перемешивают суспензию и оставляют по меньшей мере на 10 минут. Если необходимо приготовить твердую среду, то ее либо можно стерилизовать, либо нет, предусматривая добавление пара-нитрофенилфосфатной соли динатрия. Если были предприняты меры предосторожности при приготовлении, то достаточно нагревания до кипения, поскольку среда является в высокой степени ингибирующей для микроорганизмов окружающей среды, которые могли бы ее испортить. В противном случае среду необходимо стерилизовать в течение 10 минут при 115°C, и затем после ее охлаждения до 45-50°C добавляют стерильно профильтрованный раствор PNP. В случае жидкой среды ее всегда стерилизуют в автоклаве и затем добавляют стерильную добавку. Когда готовят бульон, он должен быть разлит в окончательных емкостях.

В зависимости от консистенции среды, твердой или жидкой, можно использовать разные способы инокуляции.

После инокуляции их инкубируют при температуре от 30 до 37°C в течение по меньшей мере от 2 до 6 часов в случае жидкой среды и от 18 до 24 часов в случае твердой среды.

Результаты регистрации получают в случае твердой среды, наблюдая окраску колоний, изолированных на поверхности среды. В случае жидкой среды наблюдают только изменение окрашивания среды и флуоресценцию. Таким образом можно отличить стрептококки группы D от остальных видов данного рода. Стафилококки, как правило, не развиваются в среде или могут быть сильно подавлены и наблюдаются в виде бесцветных небольших колоний (Staphylococcus saprophyticus) или с окраской колоний, отличающейся от стрептококков, и таким образом не мешают идентификации организмов-мишеней.

Энтерококки выглядят розовыми, или голубыми, или с флуоресценцией в соответствии с комбинацией используемых субстратов, в то время как в зависимости от используемой комбинации стрептококки выглядят желтыми, зеленовато-желтыми, зелеными, красными, голубыми или флуоресцирующими, когда используют цветной субстрат, отличающийся от используемого для выявления присутствия энтерококков.

ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ:

Пример 1

В данном эксперименте исследовали влияние серии смесей питательных основ в качестве пищевых компонентов в композиции. В экспериментах разрабатывали 3 варианта, состав которых показан в таблице 1. Ингредиенты перерастворяли в 100 мл воды и продолжали их обработку согласно подробному описанию настоящего изобретения.

Оценку способности стимулировать рост осуществляли с использованием коллекции штаммов по сравнению с эталонной средой (селективный бульон для обогащения стрептококков, Merck, партия: 86444327).

В каждую пробирку инокулировали 0,1 мл стандартизованного раствора при коэффициенте пропускания 50% для каждого микроорганизма.

Кривые роста показаны на фиг. 1, 2 и 3.

Результаты стимуляции роста стрептококков в высокой степени удовлетворительны. В случае Streptococcus agalactiae наблюдали, что 3 характерные композиции согласно настоящему изобретению стимулировали с большей интенсивностью развитие клеток во время первых 8 часов по отношению к контрольной среде, и вариант 1 стимулировал рост даже еще лучше вплоть до 9 часов.

В случае Streptococcus faecalis большее усиление роста наблюдали в первые 4 часа в экспериментальных вариантах по отношению к контролю, и в случае Streptococcus pyogenes, начиная с 6 часа, рост был значительно выше в новых предложенных композициях.

Таблица 1Композиция питательных основ в разных
экспериментальных вариантахКомпонентСостав (г/100 мл)V1V2V3Аутолизат Saccharomyces cerevisiae или дрожжевой гидролизат0,320,320,32Экстракт сердца коров0,240,240,24Ферментативный гидролизат белков молока0,970,970,97Ферментативный гидролизат белков соевых бобов0,32--Ферментативный гидролизат бычьей сердечной мышцы--0,22Ферментативный гидролизат животной ткани-0,46-Всего смеси1,851,991,75Всего азота в смеси13,3012,3612,31

Пример 2

Композицию готовили с ингредиентами в соответствии с примером 1, но взвешивали по отдельности внутри колбы Эрленмейера. В качестве агентов, стимулирующих рост, и ферментных маркеров использовали следующие ингредиенты:

Компонентг/100 млФерментативный гидролизат белков молока0,97Аутолизат Saccharomyces cerevisiae или дрожжевой гидролизат0,32Экстракт бычьего сердца0,24Ферментативный гидролизат белков соевых бобов0,32Пара-нитрофенилфосфатная соль динатрия0,04x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид)0,02

В композиции агар не использовали. К смеси твердых ингредиентов добавляли 100 мл деионизованной воды и продолжали приготовление композиции, как раскрыто в подробном описании.

Инокулировали коллекционные штаммы Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Указанные штаммы инокулировали в прямой форме в стандартизованном растворе при коэффициенте пропускания 50% в пробирки каждый отдельно.

Через 18 часов среда выглядела зеленовато-голубой в случае Enterococcus faecalis ATCC 29212 и 19433. Штамм Enterococcus faecium показывал темно-синее окрашивание, Streptococcus agalactiae выглядел зеленым и Streptococcus pyogenes выглядел зеленовато-желтым.

Результаты показывают скорость ответа микроорганизмов во времени и возможность отличать энтерококки (группы D) от остальной части стрептококков, поскольку они проявляют окрашивание от сине-зеленого до синего, и стрептококки, такие как: Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae, показывающие окрашивание зеленовато-желтое.

Чтобы проверить достоверность селекции c помощью хромогенного субстрата x-glu, готовили среду, состав которой был сходен с составом, описанным ранее, с тем отличием, что использовали эскулин. Используемое количеств составляло 0,1 г/100 мл, также добавляли соли железа в концентрации 0,05 г/100 мл.

Указанные градиенты навешивали по отдельности в колбе Эрленмейера, затем добавляли 100 мл деионизованной воды и подвергали обработке.

Инокулировали коллекционные штаммы Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212 и некоторые штаммы, выделенные из клинических образцов (4 штамма энтерококков и 4 штамма гемолитических стрептококков). Указанные штаммы инокулировали в прямой форме в стандартизованном растворе при коэффициенте пропускания 50%, в пробирки каждый отдельно.

Полученный ответ в случае обоих штаммов, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis, представлял собой изменение окраски среды до черной, что маскирует другие ферментные реакции, по которым некоторые виды могут быть положительными.

Оба штамма Streptococus pyogenes и Streptococcus agalactiae выглядели цвета зеленого оливкового дерева. 4 выделенных штамма энтерококков имели черную окраску, такой же ответ давали 3 гемолитических стрептококка. Наблюдали единственный гемолитический микроорганизм цвета зеленого оливкового дерева, такого же, как в случае Streptococus pyogenes и Streptococcus agalactiae.

Полученные результаты оценивали в ранней форме, однако черноватая окраска в результате гидролиза эскулина вследствие метаболической активности энтерококков группы D ограничивает идентификацию, потому что это не дает возможности регистрировать остальную часть реакций.

В заключение эксперимент позволил проверить, что следует включать x-glu в качестве ингредиента в составе среды, а не использовать эскулин.

Пример 3

Композицию среды готовили согласно примеру 2 с тем отличием, что увеличивали концентрацию питательных компонентов и ферментных маркеров. Их взвешивали по отдельности в колбу Эрленмейера в следующих количествах:

Компонентг/100 млФерментативный гидролизат белков молока1,94Аутолизат Saccharomyces cerevisiae или дрожжевой гидролизат0,64Экстракт бычьего сердца0,48Ферментативный гидролизат белков соевых бобов0,64Пара-нитрофенилфосфатная соль динатрия0,08x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид)0,04

К смеси твердых ингредиентов добавляли 100 мл деионизованной воды и подвергали обработке.

Инокулировали коллекционные штаммы, такие как: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056 и некоторые выделенные штаммы: Enterococcus avium (выделенный). Указанные штаммы инокулировали в прямой форме в лунки полипропиленового планшета (Планшет 250 pp, NUNC, партия: 046247), добавляя 0,1 мл стандартизованного раствора при 3,0 McFarland в 0,1 ил среды.

Через 2 часа наблюдали изменения окрашивания среды до зеленовато-голубого в случае Enterococcus faecalis ATCC 29212, синего в случае Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus avium выглядел зеленовато-желтым, Enterococcus faecium давал светло-голубую окраску, Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae выглядели интенсивно желтого цвета.

Ответ сохранялся с течением времени (вплоть до 6 часов). Результаты продемонстрировали скорость ответа на ферментативные реакции и возможность разработки быстрого теста для идентификации видов рода Streptococcus.

Пример 4

Композицию ингредиентов готовили согласно примеру 2 с добавлением гелеобразующего агента (агара) в концентрации 6,5 г/500 мл. Компоненты взвешивали по отдельности в колбу Эрленмейера и к смеси твердых ингредиентов добавляли 500 мл деионизованной воды. Затем обрабатывали согласно примеру 1.

Инокулировали коллекционные штаммы, такие как: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Их инокулировали, распределяя микроорганизмы по поверхности среды, чтобы получить изолированные колонии.

Через 24 часа достигалось светло-зеленое окрашивание колоний с изменением среды до желтой в случае Streptococcus pyogenes. Штаммы Enterococcus faecalis ATCC 29212 и 19433 имели сходные характеристики культуры, выглядели синими с небольшим голубым ореолом вокруг. Что касается Enterococcus faecium, наблюдались колонии меньшего размера, чем для остальной части энтерококков, синей окраски с небольшим голубым ореолом вокруг.

Пример № 5

Композицию среды готовили, взвешивая ингредиенты по отдельности в колбу Эрленмейера согласно примеру 4 с тем отличием, что ферментные маркеры были в меньшей концентрации (0,2 г/л пара-нитрофенилфосфатная соль динатрия и 0,1 г/л 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид).

Способ приготовления представлял собой способ, описанный в примере 1.

Инокуляцию проводили, распределяя микроорганизмы по поверхности среды, чтобы достичь изолированных колоний коллекционных штаммов: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Staphylococcus aureus ATCC 25923 и выделенного штамма Enterococcus avium.

Регистрацию, осуществляемую через 24 часа, при оценке композиции с использованием коллекционных штаммов наблюдали, как показано в таблице 2.

Таблица 2Характеристики роста и колоний микроорганизмов
на твердой средеШтаммХарактеристика колоний и средыStreptococcus pyogenes ATCC 19615Зеленоватые колонии с изменением цвета среды до желтогоEnterococcus faecalis ATCC 29212Синие колонииEnterococcus faecium ATCC 6056Синие колонииStaphylococcus aureus ATCC 25923Белые колонии с изменением цвета среды до желтогоEnterococcus avium (выделенный)Синие колонии

Пример 6

Композицию готовили с ингредиентами согласно примеру 2, с тем отличием, что хромогенный субстрат x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид) заменяли Mu-glu (4-метилумбеллиферил-βD-глюкопиранозид) в концентрации 0,05 г/л. Способ приготовления был сходным со способом примера 2.

При оценке коллекционных штаммов использовали: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus lactis ATCC 11454 и выделенный штамм Enterococcus avium. Указанные штаммы инокулировали прямым способом в лунки полипропиленового планшета (Планшет 250 pp, NUNC, партия: 046247), добавляя 0,1 мл стандартизованного раствора при 2,0 McFarland в 0,1 мл среды.

Через 2 часа начинали выявление роста перечисленных микроорганизмов и синей флуоресценции в ультрафиолетовом свете (365 нм) в случае Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium.

Регистрация через 6 часов показала, что все инокулированные штаммы обладали глюкозидазной активностью, так как они отвечали синей флуоресценций, когда их облучали ультрафиолетовым светом.

Показано, что можно использовать флуорогенный субстрат Mu-glu (4-метилумбеллиферил-βD-глюкопиранозид), поскольку выявление стрептококков (Enterococcus) было быстрым.

Пример 7

Композицию среды готовили, взвешивая ингредиенты по отдельности в колбу Эрленмейера. Две смеси ингибиторов использовали в твердой среде. Далее описана композиция агентов, стимулирующих рост, ферментных маркеров и используемых ингибиторов:

Компонентг/200 млV1V2Аутолизат Saccharomyces cerevisiae или дрожжевой гидролизат1,9441,944Экстракт бычьего сердца0,6480,648Ферментативный гидролизат белков молока0,4860,486Ферментативный гидролизат белков соевых бобов0,6480,648Пара-нитрофенилфосфатная соль динатрия0,040,04Salmon-glu (глюкопиранозид)0,020,02x-gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкуронида)0,020,02Ацетат талия0,120,12Налидиксовая кислота0,0030,002Агар2,62,6

Затем обрабатывали согласно примеру 1.

Используемый для инокуляции способ представлял собой распределение микроорганизмов по поверхности среды, чтобы получить изолированные колонии. При оценке использовали коллекционные штаммы: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabilis ATCC 12433, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 и выделенный штамм Enterococcus avium.

Регистрацию осуществляли через 24 часа, результаты поведения микроорганизмов в среде показаны в таблице 3. Необходимо отметить, что результаты, полученные в обоих вариантах (V1 и V2), были сходными.

Таблица 3Характеристика среды и колонийШтаммРостЦвет среды и колонийStreptococcus agalactiae АТСС 12386+Зелено-голубые колонии с изменением цвета среды до желтогоEnterococcus faecalis ATCC 29212+Розовые колонииEnterococcus faecium ATCC 6056+Розовые колонииEnterococcus avium (выделенный)+Розовые колонииStaphylococcus saphyticus ATCC 15305плохойБелые колонииStaphylococus xylosus ATCC 29971+Голубые колонииStaphylococcus aureus ATCC 25923+Белые колонииProteus mirabilis ATCC 7002--Proteus mirabilis ATCC 12433--

Условные обозначения:

+: хороший рост

-: подавленный рост

Штаммы Proteus mirabilis оставались подавленными, свидетельствуя об ингибирующей способности среды для грамотрицательных организмов.

Некоторые штаммы Staphylococcus развивались в среде, однако они принимали другую окраску, отличную от стрептококков, а также осуществляли быстрый тест на каталазу, добавляя каплю реагента в среду, достигая полного дифференцирования обоих родов.

Пример № 8

Композицию ингредиентов готовили согласно примеру 7, компоненты взвешивали по отдельности в колбу Эрленмейера с той разницей, что x-gluc (циклогексиламмониевую соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкуронида) заменяли на Magenta-glue (циклогексиламмониевую соль 5-бром-6-хлор-3-индолил-βD-глюкуронида).

Способ приготовления был сходен со способом примера 7.

Инокулировали коллекционные штаммы Proteus mirabilis ATCC 7002, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 и выделенный штамм Enterococcus avium.

Результаты поведения микроорганизмов в среде показаны в таблице 4.

Таблица 4Характеристика среды и колонийШтаммРостЦвет среды и колонийStreptococcus pyogenes ATCC 19615+Белые колонии с изменением цвета среды до желтогоStreptococcus agalactiae АТСС 12386+Красные колонии с небольшим изменением окраски среды к желтойEnterococcus faecalis ATCC 29212+Розовые колонииEnterococcus faecium ATCC 6056+Розовые колонииEnterococcus avium (выделенный)+Розовые колонииStaphylococus saphyticus ATCC 15305--Staphylococus xylosus ATCC 29971+Красные колонииStaphylococcus aureus ATCC 25923+Белые колонииProteus mirabilis ATCC 7002--

Условные обозначения:

+: хороший рост

-: подавленный рост

Наблюдали ранний и дифференцированный рост видов Streptococcus с разной окраской, развивающейся в среде.

Некоторые штаммы Staphylococcus развивались в среде и принимали другую окраску, отличную от стрептококков, хотя Staphylococcus xylosus имел сходную окраску с Streptococcus agalactiae, но его также можно было отличить, так как он не изменял цвета среды до желтого. Тем не менее, осуществляли быстрый тест на каталазу, добавляя каплю реагента в среду, и осуществляли идентификацию рода Staphylococcus по освобождению H₂ и O₂ (образование пузырьков).

Пример 9

Композицию готовили согласно примеру 8, с тем отличием, что X-gluc заменяли флуорогенным субстратом MUG в концентрации 0,05 г/л. К смеси твердых ингредиентов добавляли деионизованную воду и обрабатывали композицию до процесса гелеобразования, как описано в примере номер 1.

Осуществляли инокуляцию распределением на поверхности среды микроорганизмов коллекционных штаммов Proteus mirabilis ATCC 7002, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 и выделенного штамма Enterococcus avium. Регистрацию осуществляли через 24 часа согласно таблице 5.

Таблица 5Характеристика роста и колоний через 24 часа инкубацииШтаммРостХарактеристика колоний и средыФлуорес-
ценцияStreptococcus agalactiae АТСС 12386+Белые колонии с изменением цвета среды до желтого+Streptococcus pyogenes ATCC 19615+Белые колонии с изменением цвета среды до желтого-Enterococcus faecalis ATCC 29212+Розовые колонии с изменением окраски среды до желтой-Enterococcus faecium ATCC 6056+Розовые колонии-Enterococcus avium (выделенный)+Розовые колонии-Staphylococus xylosus ATCC 29971±Белые колонии-Staphylococcus aureus ATCC 25923±Белые колонии-Staphylococus saphyticus ATCC 15305---Proteus mirabilis ATCC 7002---

Условные обозначения:

+: хороший рост и положительная флуоресценция

±: скудный рост

-: подавленный рост

Пример 10

Композицию среды готовили, взвешивая ингредиенты по отдельности в колбу Эрленмейера. Среду готовили с таким же отношением питательных основ, как в примере 7, за исключением того, что добавляли ферментативный гидролизат крови быка в количестве 1,911 г/300 мл. Также использовали два разных ферментных маркера в концентрации 1,0 г/л с добавлением 0,5 г/л цитрата железа-аммония и две других концентрации налидиксовой кислоты 0,015 г/л и 0,010 г/л. Далее описана композиция ферментных маркеров и используемых ингибиторов:

Компонентг/300 млг/300 млV1V2Пара-нитрофенилфосфатная соль динатрия0,060,06Salmon-glu ((6-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид)0,02250,0225x-gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкуронид)0,02250,0225Ацетат талия0,180,18Налидиксовая кислота0,00450,003Триптофан0,3-Фенилаланин-0,3Цитрат железа-аммония0,150,15Агар3,93,9

Обрабатывали согласно примеру 1.

Используемый способ инокуляции представлял собой распределение микроорганизмов по поверхности среды и в случае организмов, используемых в качестве позитивных контролей, также инокулировали с разведением (10^-4 и 10^-5). При оценке использовали коллекционные штаммы: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabilis ATCC 12433, Citrobacter freundii ATCC 8090, Citrobacter freundii ATCC 10625, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212 и выделенный штамм Enterococcus avium.

Результаты поведения микроорганизмов в среде показаны в таблице 6.

Таблица 6Оценка поведения различных микроорганизмов
(инкубация при 35°C в течение 24 час)ШтаммСредаХарактеристика и
окраска изолиро-
ванных колонийСтимуляция ростаКОЕ/млStreptococcus agalactiae АТСС 12386Эксперим.Зелено-голубые колонии с желтой средой365ATSБелые колонии330Enterococcus faecalis ATCC 29212Эксперим.Розовые колонии600ATSБелые колонии445Enterococcus faecium ATCC 6056 Эксперим.Розовые колонии310ATSБелые колонии65Enterococcus avium (выделенный)Эксперим.Розовые колонии240ATSБелые колонии110Citrobacter freundii ATCC 8090Эксперим.Подавлены-ATSБелые колонииCitrobacter freundii ATCC 10625Эксперим.Подавлены-ATSБелые колонииProteus mirabilis ATCC 7002Эксперим.Подавлены-ATSБелые колонииProteus mirabilis ATCC 12433Эксперим.Подавлены-ATSБелые колонии

Эксперим.: Композиция согласно настоящему изобретению

ATS: Триптон-соевый агар

КОЕ/мл: Колониеобразующих единиц в каждом мл при разведении 10^-5.

В среде наблюдали рост Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Enterococcus avium до высоких разведений, дифференцированный рост разных видов показан среди представителей рода Streptococcus.

Штаммы грамотрицательных микроорганизмов инокулировали, используя в качестве эталона традиционную среду, триптон-соевый агар. При сравнении с контрольной средой доказана ингибирующая способность композиции согласно данному изобретению, когда наблюдали общее ингибирование родов Citrobacter и Proteus.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Кривая роста Enterococcus faecalis ATCC 29212 в разных смесях питательных основ.

Фиг. 2: Кривая роста Streptococcus agalactiae ATCC 12386 в разных смесях питательных основ.

Фиг. 3: Кривая роста Streptococcus pyogenes ATCC 19615 в разных смесях питательных основ.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации видов Streptococcus по появлению трех разных оттенков выявляемых микроорганизмов и появлению испускания флуоресценции в дополнение к изменениям окраски среды. Селективная среда содержит специфичные соотношения смесей питательных основ, которые богаты соединениями белковой природы (полипептидами, пептидами, протеазами, аминокислотами) и витаминами, которые способствуют обильному росту представляющего интерес вида, группу ингибиторов, смесь деградируемых хромогенных и флуорогенных веществ и индикаторы дезаминазной активности. Изобретение обеспечивает идентификацию с высокой степенью чувствительности и специфичности. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл.

1. Селективная культуральная среда для выделения и раннего выявления видов рода Streptococcus, отличающаяся тем, что она содержит следующие компоненты, г на 1 л воды:

группу питательных веществ из питательных основ, которые обеспечивают общее содержание азота, получаемого, по существу, из белков, от 10 до 14%, выбранных из гидролизата бычьей крови, экстракта бычьего сердца, ферментативного гидролизата бычьей сердечной мышцы, ферментативного гидролизата белков молока, ферментативного гидролизата белков соевых бобов, ферментативного гидролизата животной ткани, аутолизата или гидролизата дрожжей Saccharomyces cerevisiae и их смесей - 15-58;

группу ингибиторов:

ацетат талия - 0,55-1,6;

налидиксовая кислота - 0,005-0,030;

смесь деградируемых хромогенных и флуорогенных веществ по меньшей мере для фермента каждого вида, выбранных из пара-нитрофенилфосфатной соли динатрия; 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозида, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида, (6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозида), циклогексиламмониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида, циклогексиламмониевой соли 5-бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида и тригидрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида - 0,3-1,5; соединения, являющиеся индикаторами дезаминазной активности - 1-3.

гидролизат бычьей крови5-10экстракт бычьего сердца1-12ферментативный гидролизат бычьей сердечной мышцы1-5ферментативный гидролизат белков молока5-20ферментативный гидролизат белков соевых бобов2-15ферментативный гидролизат животной ткани1-5аутолизат или гидролизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae2-15

пара-нитрофенилфосфатная соль динатрия (PNP) - 0,2-0,8;

5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид (x-glu), 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозид (Mu-glu), 6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид (Salmon-glu) - 0,05-0,4;

циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида (x-gluc), циклогексиламмониевая соль 5-бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида (Magenta-Gluc) и тригидрат 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида (MUG) - 0,05-0,2.

цитрат железа-аммония0,5-1,0ароматические аминокислоты, предпочтительно фенилаланин и триптофан1-2

PNP+x-glu+Magenta-gluc или MUG;

PNP+Salmon-glu+x-gluc или MUG;

PNP+Mu-glu+Magenta-gluc или x-gluc.