Штамм энтерококков Enterococcus faecium L-3 для лечения и профилактики бактериальных и вирусных инфекций с использованием изготовленных на его основе лечебно-профилактических средств и продуктов питания и способ культивирования штамма энтерококков Enterococcus faecium L-3 Российский патент 2023 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и медицины, а именно к культивированию штамма бактерий энтерококков, Enterococcus faecium L-3 ND-79 ВНИИСХМ, предназначенного для лечения и профилактики бактериальных и вирусных инфекций посредством применения изготовленных на его основе фармацевтических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения.

Известны штаммы для получения бактериоциноподобной субстанции антимикробного действия из биомассы продуцента-штамма и способы их культивирования [1-7].

Известно получение [1 - Патент РФ на изобретение № 2532227 от 23.10.2013] бактериоциноподобной субстанции из биомассы продуцента - штамма Enterococcus mundtii «ГКПМ - Оболенск» B-7424, с использованием в качестве продуцента бактериоцинов с антилистериозной активностью; однако в патенте не приведены сведения об особенностях организации генома данного штамма, наличия или отсутствия генов патогенности и характера иммуномодуляторной активности, а также нет информации о безвредности использования штамма для человека и для животных.

Известно увеличение [2 – Патент EP2021457 от 25.05.2007] продукции бактериоцина 50-52 in vitro, в котором пептид, имеющий SEQ ID NO 5, добавляют к культуре клеток LWP 50-52 Enterococcus faecium (NRRL B -30746), а продукцию бактерициоцина индуцирует пептидный феромон PinA и он имеет ограниченную сферу использования, в основном, антибактериального действия.

Известен способ [3 - E.Yermolenko, A.Chernysh, A. Kolobov, A.Suvorov. Infiuence of synthetic peptide inducers on antibacterial activity of enterococci. Beneficial Microbes, XXX 2010)] стимуляции синтеза пробиотическим штаммом Enterococcus faecium L3 бактериоцинов синтетическими феромонами в котором используются синтетические феромоны Pher1, Pher2 и Pher3, которые имеют следующую аминокислотную последовательность:

Pher1 - Glu-Cys-Val-Phe-Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn-OH

Pher2 - Ala-Gly-Thr-Lys-Pro-Gln-Gly-Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Cys-Val-Phe-Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn-Он

Pher3 - Lys-Pro-Ala-Ser-Asn-Leu-Val-Glu-Cys-Val-Phe-Ser-Leu-Phe-Lys-Lys-Cys-Asn-OH.

Антагонистическая активность Enterococcus faecium L3 оценивалась только в отношении штаммов Listeria monocytogenes и Streptococcus agalactiae и была ниже, чем антагонистическая активность в отношении тех же штаммов при культивировании Enterococcus faecium L3 в сравнении с заявляемым изобретением, т.е. при использовании синтетического феромона Pher4, имеющего иную аминокислотную последовательность, как это показано ниже в примере 9.

Известен [4 - Патент РФ на изобретение № 2220199 от 03.07.2002] штамм энтерококков Enterococcus faecium L3 для изготовления лечебно-профилактических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения, обладающий антагонизмом к патогенным бактериям за счет выработки бактериоцинов, который является наиболее близким (по п.1 формулы изобретения) к заявленному изобретению по решаемой технической задаче и по технической реализации, который выбран в качестве прототипа.

Штамм Enterococcus faecium L3 депонирован в ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии» (ВНИИСХМ) под регистрационным номером “ND-79 ВНИИСХМ” в группе молочнокислых микроорганизмов; адрес коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии: шоссе Подбельского, д. 3, Пушкин-8, г.Санкт-Петербург, 196608. межународной коллекции штаммов г. Гент, Бельгия.

Указанный штамм в течение всего срока действия (с 2002г.) выданного на него патента РФ № 2220199 промышленно реализован.

К недостаткам известного штамма относится ограниченный противо-инфекционный эффект в отношении узкого спектра патогенов. Вместе с тем, авторы патента РФ №2220199, выбранного в качестве прототипа, которые являются также и авторами заявляемого изобретения, обнаружили, что этот недостаток обусловлен относительно низким уровнем синтеза бактериоцинов и, соответственно, относительно узким спектром патогенов, в отношении которых на дату регистрации (2002г.) патента на разработанный авторами штамм Enterococcus faecium L3, ими было выявлено проявление антагонизма.

В связи с этим, в течение всего 20-ти летнего срока действия этого патента РФ (№2220199) его авторами были проведены фундаментальные и прикладные исследования, а также многочисленные клинические исследования с целью выявления и использования новых обнаруженных ими свойств штамма энтерококков Enterococcus faecium L3, за счет реализации которых станет возможным, прежде всего, существенное расширение сферы действия заложенного в штамме иммуномодулирующего и противоинфекционного эффекта, по лечению и профилактике бактериальных и вирусных инфекций.

За период проведенных исследований, авторами был полностью просеквенирован геном штамма (последовательность генома штамма Enterococcus faecium L3 депонирована в DDBJ/EMBL/GenBank под номером JRGX00000000 [5 - Karaseva A, Tsapieva A, Pachebat J, Suvorov A. Draft Genome Sequence of Probiotic Enterococcus faecium Strain L-3. Genome Announc. 2016 Jan 28;4(1):e01622-15. doi: 10.1128/genomeA.01622-15. PMID: 26823581; PMCID: PMC4732334.]; генетически подтверждена полная безвредность пробиотического штамма Enterococcus faecium L3, и обосновано, что штамм Enterococcus faecium L3 не является носителем генов патогенности и вирулентности, а, кроме того, были обнаружены гены еще двух бактериоцинов: наряду с указанными в прототипе энтероцинами А, В, авторами были выявлены новые бактериоцины Х-α и Х-β.

По результатам проведенных исследований штамма Enterococcus faecium L3, авторами были обнаруженные неизвестные ранее его свойства, дальнейшая апробация которых авторами позволила им подтвердить возможность нового и эффективного использования этого штамма в отношении более широкого круга, по сравнению с прототипом, вирусных и бактериальных инфекций, а также возможности его использования и против появившихся с 2019г. неизвестных ранее опасных для жизни человека инфекций. В частности, ими было создано изобретение, техническая сущность которого состояла в получении вектора для разработки и создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 [6- Патент РФ на изобретение №2745626 от 29.03.2021 «Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 и живая вакцина Enterococcus faecium L3- pentF-covid-19» авторы - Алехина Г.Г. и др.]

Полученные результаты научных исследований и экспериментальных испытаний по выявлению новых свойств разработанного авторами штамма Enterococcus faecium L3 позволили авторам заявляемого изобретения выявить также многократный (в 10 и более раз) усиленный по сравнению с действующим патентом противоинфекционный эффект разработанного ими штамма (по патенту РФ № 2220199) за счет увеличения синтеза бактериоцинов и, вследствие этого, существенное расширение спектра патогенов, в отношении которых было выявлено проявление антагонизма, причем не только в отношении стрептококков группы В, листерий, шигелл (Shigella flexneri, Shigella sonnei) и сальмонелл (Salmonella typhi, Salmonella typhimurium), но и в отношении стрептококков группы А, патогенных стафилококков, патогенных энтерококков, Klebsiella pneumonia, Candida spp, Sacharamices cerevisiae, Helycobacter pylori, Fusobacterium nucleatum, Esherichia coli enteropathogenic, а также Staphylococcus aureus, Clostridium difficile и вирусам (вирус герпес, вирус гриппа). Результаты этих многолетних исследований, полученные авторами, подтвердили реальную возможность дальнейшего и существенного расширения области промышленного использования разработанного ими по патенту РФ № 2220199 от 2002г. штамма Enterococcus faecium L3. По полученным результатам фундаментальных и прикладных исследований, касающихся выявления новых, в частотности, антагонистических свойств используемого в заявляемом изобретении штамма Enterococcus faecium L3, авторами за 20-ти летний срок действия и активного промышленного использования изобретения по патенту РФ №2220199 (2002г.) были опубликованы в отечественных и иностранных изданиях более 150 публикаций.

Технический результат заявленного изобретения состоит в повышении (в 10 и более раз) антагонистической активности в отношении патогенов и существенном расширении спектра патогенов, что позволит существенно увеличить сферу его применения.

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению на способ культивирования пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 является указанный выше способ [3], заключающийся в усилении синтеза бактериоцинов за счет того, что в ростовую среду, в качестве которой использована среда BHI (Brain Heart Infusion (Gibco) Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), добавляют синтетический феромон, например, Pher1 или Pher2 или Pher3 в концентрации от 10^-5 до 10^-17 моль/л, после чего культивирование Enterococcus faecium L3 осуществляют при температуре 37 °С в течение 10 часов.

Недостатком известного способа культивирования является недостаточно высокая антагонистическая активность штамма Enterococcus faecium L3 в отношении патогенных штаммов бактерий и вирусов.

Технический результат заявленного способа культивирования состоит в повышении антагонистической активности пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 за счет существенного стимулирования к выработке им бактериоцинов.

Указанный технический результат достигается за счет того, что через 2-16 часов после начала культивирования в ростовую среду добавляют в концентрации от 10^-5 до 10^-17 моль/л, синтетический феромон Pher4 с аминокислотной последовательностью KPQGKPASNLVECVFSLFKKC; культивирование Enterococcus faecium L3 осуществляют в течение от 19 до 24 часов при той же, что и в прототипе, температуре 37°С. В качестве ростовой среды могут быть использованы, как и в прототипе, L-бульон, среда на основе «Supro Plus 2640»1,5% и молоко с 1,5% жира, а также иные среды, приведенные, в частности, в примерах конкретной реализации заявляемого способа культивирования, такие, например, как бульоны на безмолочной основе (овсяное, гречневое и другие виды не-молока, соевое молоко, бульоны на основе отрубей или растительных волокон и др.), молоко с 1,5% - 3% жира (коровье, козье и др.), грудное молоко и заменители грудного молока для приготовления жидких и сухих бактериосодержащих продуктов.

Кроме того, в заявляемом новом способе культивирования штамма Enterococcus faecium L3 указанное выше усиление антагонизма в отношении патогенов осуществляется за счет применения двухкомпонентного комплекса для применения внутрь, например, комплекса из двух капсул, в котором одна капсула содержит лиофилизированный пробиотический штамм Enterococcus faecium L3 в дозе 10⁶-10⁹ КОЕ/г, а вторая капсула, рекомендуемая для одновременного приема, - синтетический феромон Pher4 в дозе от 1,5 мг до 0,00000000015мг на 1кг сухого наполнителя (например, крахмала).

Заявленное изобретение поясняется следующими конкретными примерами реализации штамма Enterococcus faecium L3 и способа его культивирования.

Пример 1.

Результаты выращивания жидкой культуры штамма Enterococcus faecium L3 с многократно увеличенным количеством вырабатываемых бактериоцинов в условиях микробиологической лаборатории.

Стартовая культура бактерий штамма Enterococcus faecium L3, выращенная на жидких питательных средах с титром не менее 1х10⁹ колониеобразующих единиц в 1 грамме, переносится в молоко или среду на основе “Supro Plus 2640” и выращивается в термостате 16 часов. Соотношение посевной дозы к объему жидкой питательной среды должно составлять от 1:30 до 1:60. Синтетический феромон Pher4 вносится в 10^-5 M - 10^-17 M на литр выращиваемой биомассы через 2-16 часов от начала культивирования. Бактериальная стартовая биомасса в тех же объемных соотношениях может быть использована для выращивания больших объемов биомассы для производства жидких молочнокислых заквасок на основе штамма Enterococcus faecium L3 или заквасок на безмолочной основе (овсяное, гречневое и другие виды немолока, соевое молоко, бульоны на основе отрубей или растительных волокон) для приготовления жидких и сухих бактериосодержащих продуктов.

Пример 2.

Результаты сравнительного исследования антагонизма штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона с антагонизмом штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с настоящим изобретением (методом штриха).

Исследование проводилось методом перекрестного посева на агаризованных питательных средах. На чашки Петри с L агаром или соевым агаром наносились в виде линии штаммы индикаторных патогенных бактерий группы кишечной палочки (Escherichia coli), шигеллы (Shigella flexneri, Shigella sonnei), сальмонеллы (Salmonella typhi, Salmonella typhimurium), грамположительные бактерии стрептококки групп А и В (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae), стафилококки (Staphylococcus aureus)], грибы (Candida albicans), сахаромицеты (Sacharamices cerevisiae).

Перпендикулярно к линии бактериального роста исследуемых штаммов, на поверхность агара наносили бактерии штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду феромон Pher4 и с добавлением в ростовую среду феромона Pher4.

После инкубации чашек Петри при температуре 37°С в течение 18 часов оценивали характер роста указанных индикаторных бактерий по удаленности от места нанесения энтерококков. Степень подавления бактериального роста была прямо пропорциональна расстоянию начала появления бактериальных колоний от участка нанесения энтерококков. Было установлено, что вышеперечисленные индикаторные бактерии начинали расти на поверхности агара не ближе 17 мм от линии нанесения штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду феромона Pher4 и не ближе 30 мм от линии нанесения штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду феромона Pher4.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что антагонистическая активность штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду феромона Pher4 в количестве10^-6 M - 10^-17 M на литр выращиваемой биомассы в 1,7 раза превосходит антагонистическую активность штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду феромона в опыте на твердых питательных средах.

Пример 3

Результаты сравнительного исследования антагонизма штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона с антагонизмом штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с настоящим изобретением, по отношению к листериям и патогенным энтерококкам и эшерихиям (методом дисков).

Оценку антимикробной активности штаммов проводили с использованием модифицированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани на чашки Петри в количестве 10⁷ КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37 ⁰С и затем наносили на поверхность дисков по 10 мкл предварительно подготовленных исследуемых образцов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона (опыт 1) и штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с настоящим изобретением (опыт2) в виде капли диаметром 5±1 мм. Оставляли чашки Петри при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37 ⁰С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили измерением зоны задержки роста вокруг исследуемых образцов индикаторных культур. Оценивали величину стерильных зон с помощью линейки. Измеряли диаметр зон задержки роста индикаторных микроорганизмов вокруг капли, включая диаметр капли самого образца.

Стандартные суспензии индикаторных культур, используемые для оценки антимикробной активности были получены в результате культивирования чистых культур на соответствующих питательных средах в течение 16 часов при 37 ⁰С. Затем был произведен счетный высев индикаторных культур методом последовательных разведений с целью подсчёта КОЕ/мл и последующей стандартизации метода. Все индикаторные культуры были приведены к концентрации 10⁸ КОЕ/мл внесением необходимого количества суспензии клеток в стерильный физиологический раствор.

Для оценки антимикробной активности штамма Enterococcus faecium L3 использовали следующие индикаторные культуры: Listeria ivanovii DSM 20750, Listeria monocytogenes EDG, Enterococcus faecalis CCUG 52538 Escherichia coli АТСС 25922, Escherichia coli АТСС 25922, Klebsiella pneumonia ATCC BAA-2814, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Clostridium difficile ATCC 43255, Fusobacterium nucleatum АТСС 25586 из коллекции ООО «АВЕНА».

В таблице 1 представлены соответствующие результаты зоны задержки роста индикаторных культур при воздействии исследуемых образцов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, и штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявленным изобретением.

Таблица 1

Индикаторная культура Зона задержки роста индикаторных культур при воздействии Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона Pher4 Зона задержки роста индикаторных культур при воздействии Enterococcus faecium L3, выращенного добавлением в ростовую среду синтетического феромона Pher4 1 2 3 Listeria monocytogenes EDG 7 мм 15 мм Listeria ivanovii DSM 20750 7 мм 16 мм Enterococcus faecalis CCUG 52538 15 мм 32 мм Escherichia coli АТСС 25922 10 мм 14 мм Escherichia coli АТСС 25922 8 мм 20 мм Staphylococcus aureus ATCC 25923 15 мм 21 мм Fusobacterium nuceatum АТСС 25586 6 мм 11 мм Klebsiella pneumonia ATCC BAA-2814 8 мм 10 мм Clostridium difficile ATCC 43255 8 мм 24 мм

Как видно из таблицы 1, антагонистическая активность в отношении исследуемых патогенов, определяемая методом стандартных дисков, увеличивается в 2-3 раза при выращивании штамма Enterococcus faecium L3 с добавлением в ростовую среду синтетического феромона.

Пример 4

Сравнительное турбидометрическое исследование антагонизма штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона с антагонизмом штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявляемым изобретением, по отношению к листериям, по оценке минимальной ингибирующей концентрации.

Метод разведения бульона является количественным методом и используется для исследования микроорганизмов с различным уровнем роста. Результаты выражаются показателем MIC (минимальная ингибирующая концентрация), который отражает наименьшую концентрацию штамма-антагониста или его супернатанта, полностью подавляющую рост индикаторного микроорганизма после определенного инкубационного периода. В ходе этого исследования выполняется серийное разведение стартовой культуры антагониста или его метаболитов с последующим внесением соответствующих концентраций в бактериологические пробирки с питательной средой (бульон или агар), в которую затем инокулируются индикаторные микроорганизмы и инкубируются.

Турбидометрическое исследование (измерение оптической плотности) выполняется автоматическими системами, которые определяют влияние вещества на динамику роста и гибели микроорганизма. Данное исследование обеспечивает информацией относительно эффекта штамма или его метаболитов, которое может вызвать задержку lag фазы или снижение уровня роста при концентрациях ниже MIC.

Приготовление суспензии индикаторной культуры L. monocytogenes EGD описано в примере 3.

Индуктор Pher4 добавляли к культуре антагониста Enterococcus. faecium L3, которую вносили в бульон с листериями.

В таблице 2 представлены соответствующие результаты минимальной ингибирующей концентрация (MIC) штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, и штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявленным изобретением, подавляющее рост штамма L. monocytogenes EGD.

Таблица 2

Время совместной инкубации Enterococcus faecium L3 c L. monocytogenes EGD (час) MIC lg КОЕ/мл Со штаммом энтерококка Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду Pher4 Со штаммом энтерококка Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду Pher4 2 1,81±0,03 0,75±0,04 4 1,62±0,02 0,51±0,03 6 1,42±0,02 0,3±0,01

Как видно из таблицы 2, титр штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду Pher4, полностью подавляющего рост L. monocytogenes EGD, был более, чем на порядок (более, чем в 10 раз) ниже титра штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду Pher4.

Пример 5

Результаты сравнительного исследования антагонизма штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона с антагонизмом штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявленным изобретением, по отношению к патогенным стрептококкам, методом определения МИКА в двухслойном агаре.

Культуры антагонистов в нижнем слое выращивали в среде МРС-4 в различных концентрациях (0,25-7,46 lg КОЕ/мл) в течение 24 часов. Затем на поверхность верхнего слоя наносили по 10 мкл индикаторных культур, находящихся в стационарной фазе в концентрации 8 lg КОЕ/мл и инкубировали еще 24 часа.

Индикаторными культурами являлись стрептококки из групп A, B, C, G, которые выращивали на колумбийском сывороточном агаре.

Учет результатов осуществляли через 24 часа после подсева индикаторных культур, определяя минимальное ингибирующее количество антагониста, при котором рост чувствительных бактерий на верхнем слое агара полностью подавлялся (МИКА).

В таблице 3 представлены соответствующие результаты минимальной ингибирующей концентрации штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, и штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявленным изобретением по отношению к патогенным стрептококкам

Таблица 3

Штаммы стрептококков МИКА, lg КОЕ/мл Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду Pher4 Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду Pher4 S. pyogenes 16/49 0,25±0,03 0,05±0,002 S. agalactiae 58/59 2,34±0,04 0,51±0,03 41/59 (стрептококк группы С) 2,07±0,02 0,2±0,01 22/58 (стрептококк группы G) 2,79±0,02 0,2±0,02

Как видно из таблицы 3, минимальная ингибирующая концентрация штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду Pher4 была на порядок и на 2 порядка меньше (в 10 и в 100раз), чем у штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду Pher4.

Пример 6.

Результаты сравнительного исследования антагонизма метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона с антагонизмом метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявленным изобретением, по отношению к листериям, методом определения оптической плотности индикаторной культуры.

Стерильный супернатант антагонистов - в 1/3 объема добавляли в жидкую среду THB, а затем в полученный бульон вносили бактериальную индикаторную культуру. Засевная доза листерий составляла 10% при концентрации 6 lg КОЕ/мл. Индуктор Pher4 добавляли к культуре антагониста Enterococcus faecium L3, полученный из нее супернатант вносили в бульон с листериями.

В таблице 4 представлены соответствующие результаты антагонистической активности метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона и метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявляемым изобретением, в отношении штамма L.monocytogenes EGD.

Таблица 4

Время инкубации L. monocytogenes EGD после внесения метаболитов Enterococcus faecium L3 (час) Оптическая плотность культуры штамма L. Monocytogenes, OD640 Контроль штамм инкубации L. monocytogenes EGD С добавленными метаболитами штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду Pher4 С добавленными метаболитами штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду Pher4 0 0,02±0,001 0,02±0,001 0,02±0,001 2 0,05±0,003 0,03±0,003 0,02±0,001 4 0,15±0,002 0,06±0,002 0,02±0,001 6 0,36±0,003 0,22±0,002 0,02±0,001

Как видно из таблицы 4, при инкубации индикаторной культуры листерий в присутствии метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, наблюдалось существенное замедление роста листерий (по сравнению с контролем), а при добавлении метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавления в ростовую среду Pher4, наблюдалось отсутствие роста индикаторного штамма листерий.

Пример 7

Результаты сравнительного исследования протективности штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона с протективностью штамма Enterococcus faecium L3, выращенного, в соответствии с заявляемым изобретением, по отношению к вирусу гриппа (в биологическом эксперименте).

Эксперимент по сравнительной протективности пробиотика Enterococcus faecium L3, культивированного с добавлением и без добавления в ростовую среду синтетического феромона, проводился на 54 самках мышей инбредной линии Balb/c в возрасте 8-10 недель.

Мышей держали в отдельных клетках (по шесть мышей в клетке) в одинаковых условиях: температуре 18–22°C, освещении в течение 12 ч, шуме до 85 дБ и влажности 50–60%. Они также получили одинаковый корм для лабораторных крыс и мышей, ПК-120 ш. 1492, Госстандарт Р 50258-92 в гранулах диаметром 14 мм, Россия.

Все мыши были анестезированы эфиром, инфицированы интраназально десятью 50% смертельными дозами (десять LD50) вируса гриппа A / South Africa / 3626/2013 (H1N1) pdm, и разделены на 3 группы (по18 животных):

- в экспериментальной группе 1 (№18) - мыши получали пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, выращенный с добавлением в ростовую среду синтетического феромона, в дозе 1 × 10⁷ КОЕ / мышь каждый день, в том числе за день до вирусного заражения и 10 дней спустя.

- в экспериментальной группе 2 (№18) - мыши получали пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, выращенный без добавления в ростовую среду синтетического феромона, в дозе 1 × 10⁷ КОЕ / мышь каждый день, в том числе за день до вирусного заражения и 10 дней спустя.

- в контрольной группе 3 (№18) – мыши не получали пробиотика.

Оценивались потеря веса и летальность в течение 15 дней после заражения.

Мыши из двух экспериментальных групп, которые ежедневно получали Enterococcus faecium L3, теряли меньше веса после инфицирования вирусом гриппа по сравнению с мышами из контрольной группы, которая не получала энтерококки.

В экспериментальной группе 1 выжило 12 животных (67%), в экспериментальной группе 2 выжило 4 животных (20%), в группе контроля к 9 дню эксперимента погибли все животные.

Таким образом, как показали результаты эксперимента, протективный эффект штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, в 3.3 раза ниже протективности штамма Enterococcus faecium L3, выращенного в соответствии с заявляемым изобретением (по отношению к вирусу гриппа A / South Africa / 3626/2013 (H1N1) pdm.

Пример 8.

Результаты сравнительного исследования протективности штамма Enterococcus faecium L3 в присутствии синтетического феромона с протективностью штамма Enterococcus faecium L3, и без синтетического феромона, по отношению к вирусу гриппа (в биологическом эксперименте).

Эксперимент по сравнительной протективности пробиотика Enterococcus faecium L3, аналогично, как это описано в примере 7, проводился на 54 самках мышей инбредной линии Balb/c в возрасте 8-10 недель и, как и в примере 7, мыши получали внутрь (через рот), совместно с синтетическим феромоном, и пробиотика Enterococcus faecium L3 без синтетического феромона. В отличие от предыдущего эксперимента, штамм Enterococcus faecium L3 выращивался без добавления в ростовую среду синтетического феромона Pher4, а синтетический феромон Phe4 давался животным экспериментальной группы внутрь (через рот) на следующий день после того, как они начинали получать Enterococcus faecium L3.

Экспериментальная группа 1 (№18) - мыши получали пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, выращенный без добавления в ростовую среду синтетического феромона, в дозе 1 × 10⁷ КОЕ / мышь каждый день (в том числе, за день до вирусного заражения и 10 дней спустя) и со дня вирусного заражения в течение 10 дней по 0,5 мл физиологического раствора с растворенным в нем синтетическим феромоном в концентрации10^-11 M на литр одновременно с пробиотиком.

Экспериментальная группа 2 (№18) - мыши получали пробиотический штамм Enterococcus faecium L3, выращенный без добавления в ростовую среду синтетического феромона, в дозе 1 × 10⁷ КОЕ / мышь каждый день, в том числе, за день до вирусного заражения и 10 дней спустя.

Контрольная группа 3 (№18) – мыши не получали пробиотика.

Оценивались потеря веса и летальность в течение 15 дней после заражения.

Мыши из двух экспериментальных групп, которые ежедневно получали Enterococcus faecium L3, теряли меньше веса после инфицирования вирусом гриппа по сравнению с мышами из контрольной группы, которая не получала энтерококки.

Результаты выживаемости животных оказались такими же, как и в примере 7, когда синтетический феромон не давался животным, а добавлялся в ростовую среду при выращивании пробиотика: в экспериментальной группе 1 выжило 12 животных (67%), в экспериментальной группе 2 выжило 4 животных (20%), а в группе контроля к 9-му дню эксперимента погибли все животные. Таким образом, протективный эффект штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона в 3.3 раза ниже протективности штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, но даваемого совместно с феромоном (по отношению к вирусу гриппа A / South Africa / 3626/2013 (H1N1) pdm).

Протективность штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду синтетического феромона, не отличается от протективности штамма Enterococcus faecium L3, выращенного без добавления в ростовую среду синтетического феромона, но поступающего в организм в комплексе с синтетическим феромоном.

Пример 14

Результаты сравнительного исследования антагонизма метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением в ростовую среду синтетических феромонов Pher1, Pher2 и Pher3 с антагонизмом метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного, в соответствие с заявляемым изобретением с добавлением в ростовую среду синтетических феромонов Pher4 по отношению к листериям, методом определения оптической плотности индикаторной культуры.

Индукторы Pher1, Pher2, Pher3 и Pher4 добавляли к культуре антагониста Enterococcus faecium L3 (10⁹ КОЕ/мл) в концентрации 10^-11 моль/л и через 12 часов культивирования при температуре 37°С получали супернатанты, которые вносили в концентрациях от 10% до 50% по объему в бульон с листериями L. monocytogenes EGD (10⁶ КОЕ/мл) и продолжали культивирование листерий при температуре 37°С в течение 10 часов. После этого оценивали антагонистическую активность метаболитов Enterococcus faecium L3 методом измерения оптической плотности культуры L. monocytogenes EGD.

Полное подавление роста листерий наблюдалось при внесении в культуру листерий 28±3,1% по объему супернатанта Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением синтетического феромона Pher4 и при 41±2,8%, 43±3,0% и 45±2,1% супернатанотов Enterococcus faecium L3, выращенного с добавлением синтетических феромонов Pher3, Pher2 и Pher1 соответственно.

Из приведенного примера подавления роста культуры L. monocytogenes EGD видно, что антагонистическая активность метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавления в ростовую среду синтетического феромона Pher4, в полтора раза превышает антагонистическую активность метаболитов штамма Enterococcus faecium L3, выращенного с добавления в ростовую среду синтетических феромонов Pher1, Pher2 и Pher3.

Результаты проведенных исследований, как показали приведенные выше примеры конкретной реализации заявленного изобретения, подтверждают новые свойства штамма Entrococcus faecium L3: существенное усиление антагонистической активности штамма в отношении бактериальных и вирусных патогенов, а также значительное расширение спектра патогенов за счет использования нового способа культивирования штамма в присутствии синтетического феромона Pher4. Это расширяет возможности применения как самого штамма, так и его метаболитов.

Использованные источники информации

1. Патент РФ № 2532227 от 23.10.2013 на изобретение «Штамм Enterococcus mundtii, продуцирующий субстанцию пептидной природы с антилистериозной активностью».

2. EP2021457 Cipla Medpro. Probiotic strain and antimicrobial peptide derived therefrom, 2007-05-25.

3. E.Yermolenko, A.Chernysh, A. Kolobov, A.Suvorov. Infiuence of synthetic peptide inducers on antibacterial activity of enterococci. Beneficial Microbes, XXX 2010.

4. Патент РФ № 2220199 от 03.07.2002 на изобретение «Штамм энтерококков Enterococcus faecium L3 для изготовления лечебно-профилактических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения»; авторы - Алехина Г.Г., Суворов А.Н. (прототип по п.1 формулы).

5. Karaseva A, Tsapieva A, Pachebat J, Suvorov A. Draft Genome Sequence of Probiotic Enterococcus faecium Strain L-3. Genome Announc. 2016 Jan 28;4(1):e01622-15. doi: 10.1128/genomeA.01622-15. PMID: 26823581; PMCID: PMC4732334 (прототип по п.2 формулы).

6. Патент РФ №2745626 от 29.03.2021 на изобретение «Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 и живая вакцина Enterococcus faecium L3- pentF-covid-19»; авторы - Алехина Г.Г. и др.

7. Вершинин А. Е. и др. «Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков». Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - N 5. - С. 83-87. - ISSN 0372.9311.]

Изобретение относится к способу культивирования штамма Enterococcus faecium L-3. Способ предусматривает культивирование штамма Enterococcus faecium L-3 при температуре 37°С в течение 19-24 часов на ростовой среде. При этом через 2-16 часов после начала культивирования в ростовую среду добавляют синтетический феромон Pher4 с аминокислотной последовательностью KPQGKPASNLVECVFSLFKKC в концентрации от 10^-5 до 10^-17 моль/л. Изобретение обеспечивает повышение антагонистической активности штамма Enterococcus faecium L-3. 4 табл., 9 пр.

Способ культивирования штамма Enterococcus faecium L-3, предусматривающий культивирование при температуре 37°С в течение 19-24 часов на ростовой среде, при этом через 2-16 часов после начала культивирования в ростовую среду добавляют синтетический феромон Pher4 с аминокислотной последовательностью KPQGKPASNLVECVFSLFKKC в концентрации от 10^-5 до 10^-17 моль/л.