СУХАЯ ХРОМОГЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И E.coli (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12Q1/06 C12Q1/10 C12R1/19 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для обнаружения колиформных бактерий и Е.coli в образцах пищевых продуктов и воды при проведении бактериологических исследований.

Ведущими зарубежными фирмами ООО «ГЕМ» (Хромогенный агар ТВХ) [каталог Среды бактериологические 2009-2010, стр.97], MERCK (Chromocult Coliform Agar) [каталог Микробиология 2004/05, стр.389], HiMedia (HiCrome Coliform Agar w/SLS) [http//www.himedialabs.ru/] выпускаются сухие питательные среды для обнаружения колиформных бактерий и E.coli на основе пептонов с использованием хромогенных субстратов.

Наиболее близкой по назначению к предлагаемой среде является HiCrome Coliform Agar w/ SLS ХайХром селективный агар для обнаружения колиформных бактерий и E.coli производства HiMedia, состоящий из следующих компонентов г/л:

Пептон 3.0 Натрия хлорид 5,0 Натрия гидрофосфат 3,0 Калия дигидрофосфат 1,7 Пируват натрия 1,0 L-триптофан 1,0 Натрия додецилсульфат 0,1 Хромогенная смесь 0,2 Агар 12,0

Недостатком этой среды является слабовыраженное окрашивание колоний, что приводит к сомнительным дифференцирующим свойствам питательной среды.

Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды, достижение стабильности результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам, позволяющей упростить и исключить ложную идентификацию возбудителя, сократить время на исследование.

Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей:

- панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ) производства ФБУН ГНЦ ПМБ; или пептон мясной, а также натрий пировинограднокислый, которые удовлетворяют питательные потребности бактерий в аминном азоте и пептидах, а так же обеспечивают рост поврежденных бактерий;

- натрий додецилсульфат ингибирует рост сопутствующей микрофлоры;

- изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) является индуктором эн-зиматических реакций;

- триптофан дает возможность проведения индольного теста для окончательного подтверждения E.coli;

- комбинацию смесей хромогенных субстратов: 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon-GAL) - хромогенный субстрат для обнаружения фермента β-галактозидазы, характерной для колиформных бактерий, 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (X-GLUC) - хромогенный субстрат для обнаружения фермента β-глюкуронидазы, характерной для E.coli и колиформных бактерий;

- натрий фосфорнокислый двузамещенный и калий фосфорнокислый однозамещенный обеспечивают поддержание рН в процессе роста микроорганизмов;

- агар бактериологический придает плотность питательной среде.

Первый вариант: г/л:

Пептон мясной 3,0±0,5 Натрий хлористый 5,0±1,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7±0,15 Натрий пировинограднокислый 1,0±0,15 Триптофан 1,0±0,3 Натрий додецилсульфат 0,15±0,03 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,1±0,01 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,075±0,005 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,1±0,02 Агар бактериологический 10,0±3,0

Второй вариант: г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 3,0±0,5 Натрий хлористый 5,0±1,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7±0,15 Натрий пировинограднокислый 1,0±0,15 Триптофан 1,0±0,3 Натрий додецилсульфат 0,15±0,03 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,1±0,01 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,075±0.005 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,1±0,02 Агар бактериологический 10,0±3,0

Отличие предлагаемой питательной среды от среды HiCrome Coliform Agar w/SLS ХайХром селективный агар для обнаружения колиформных бактерий и E.coli производства HiMedia заключается в том, что в качестве белковой основы в среде ФБУН ГНЦ ПМБ наряду с мясным пептоном возможно применение панкреатического гидролизата рыбы. Увеличение концентрации додецилсульфата натрия с целью повышения ингибирующих свойств среды в отношении сопутствующих микроорганизмов не влияет на рост выделяемых микроорганизмов. Кроме того, предложенная нами концентрация хромогенных субстратов и дополнительно внесенный в состав питательной среды реактив 1-изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) позволили усилить интенсивность окрашивания колоний энтеробактерий для более достоверной идентификации микроорганизмов.

Комбинация смесей хромогенных субстратов позволяет одновременно определить колиформные бактерии и E.coli. Фермент β-D-галактозидаза, характерный для колиформных бактерий, расщепляет хромогенный субстрат Salmon-Gal, что приводит к окрашиванию колоний колиформных бактерий в розовый (красный) цвет. Фермент β-D-глюкуронидаза, характерный для E.coli, расщепляет хромогенный субстрат X-глюкуронид. E.coli имеет оба фермента, поэтому их колонии окрашиваются в темно-синий (фиолетовый) цвет и четко отличаются от колоний колиформных бактерий.

Питательную среду готовят следующим образом:

Пример 1. Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:

Первый вариант

Пептон мясной 2,5 Натрий хлористый 4,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,9 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,55 Натрий пировинограднокислый 0,85 L-триптофан 0,7 Натрий додецилсульфат 0,12 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon-GAL) 0,09 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (Х-GLUC) 0,07 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,08 Агар бактериологический 7,0

Второй вариант: г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 2,5 Натрий хлористый 4,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,9 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,55 Натрий пировинограднокислый 0,85 Триптофан 0,7 Натрий додецилсульфат 0,12 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,09 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,07 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,08 Агар бактериологический 7,0

Навески тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, автоклавируют при температуре 121°С в течение 15 мин, охлаждают до температуры 45-50°С и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки подсушивают.

Для биологического контроля предлагаемой питательной среды используют культуры музейных штаммов: Escherichia coli Ewing (0124K 72) 227, Escherichia coli ATCC 25922, Citrobacter freundii 101/57, Klebsiella pneu-moniae 418, Salmonella enteritidis 11272, Salmonella typhimurium 79 из разведения 10^-6 Enterococcus faecalis 775 из разведения 10^-3. Все посевы инкубируют аэробно при температуре 37±1°С в течение 18 часов. При учете результатов учитывают наличие и характер роста колоний.

Через 18 часов культивирования в результате роста тест-штаммов Е.coli Ewing (0124K 72) 227, Е.coli ATCC 25922 101/57 отмечался рост круглых, гладких, блестящих, синего цвета с фиолетовым ореолом или без него колоний из-за одновременного расщепления Salmon-GAL и Х-GLUC (Фиг.1, 2). Микробная β-D-галактозидаза расщепляет Salmon-GAL, что приводит к окрашиванию колоний колиформных бактерий С.freundii 101/57 K. pneumoniae 418 в розовый цвет (Фиг.3). S.typhimurium 79 (Фиг.4) ввиду отсутствия вышеуказанных группоспецифических ферментов образуют бесцветные колонии. Рост Е.faecalis 775 подавлен полностью. Избирательное выявление высокоспецифичных ферментов вышеуказанных микроорганизмов позволяет одновременно дифференцировать колиформные микроорганизмы и кишечные патогены, а также сокращает время исследования. Внесенный в среду IPTG как индуктор галактозидазы способствует более яркому окрашиванию колоний по сравнению с контрольной средой HiCrome Coliform Agar w/SLS ХайХром селективный агар для обнаружения колиформных бактерий и E.coli производства HiMedia. На темно-синие колонии (предположительно E.coli) наносят реактив Ковача. Появление вишнево-красного окрашивания подтверждает их принадлежность к E.coli.

Пример 2. Для приготовления питательной среды компоненты берут в следующем количественном соотношении, г/л:

Первый вариант

Пептон мясной 3,0 Натрий хлористый 5,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7 Натрий пировинограднокислый 1,0 L-триптофан 1,0 Натрий додецилсульфат 0,15 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon-GAL) 0,1 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (X-GLUC) 0,075 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,1 Агар бактериологический 10,0

Второй вариант: г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 3,0 Натрий хлористый 5,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7 Натрий пировинограднокислый 1,0 Триптофан 1,0 Натрий додецилсульфат 0,15 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,1 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,075 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,1 Агар бактериологический 10,0

Готовят среду в соответствии с примером 1. На предлагаемой среде проверяют ростовые свойства тест-культур, как в примере 1.

Результаты проверки аналогичны примеру 1.

Пример 3. Питательную среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующем количественном соотношении, г/л:

Первый вариант

Пептон мясной 3,5 Натрий хлористый 6,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,85 Натрий пировинограднокислый 1,15 L-триптофан 1,3 Натрий додецилсульфат 0,18 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon-GAL) 0,11 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (Х-GLUC) 0,08 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,12 Агар бактериологический 13,0

Второй вариант: г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки 3,5 Натрий хлористый 6,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,85 Натрий пировинограднокислый 1,15 Триптофан 1,3 Натрий додецилсульфат 0,18 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,11 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,08 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,12 Агар бактериологический 13,0

Ростовые свойства тест-штаммов на предлагаемой среде идентичны результатам проверки по примеру 1.

Ростовые свойства тест-штаммов на предлагаемой среде, приготовленной по второму варианту, аналогичны результатам биологического контроля по примеру 1.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда чувствительна, обладает хорошими ростовыми свойствами, подавляет рост энтерококка.

Кроме того, внесенный в среду IPTG и оптимально подобранная концентрация хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида (X-GLUC) способствовуют более яркому окрашиванию колоний, чем среда-прототип.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая среда имеет ряд преимуществ:

- Дополнительно внесенный реактив 1-изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) и предложенная нами концентрация хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида (X-GLUC) в состав питательной среды позволили усилить интенсивность окрашивания колоний энтеробактерий, что исключает ложную интерпретацию результатов.

- Использование предлагаемой среды упрощает идентификацию возбудителя и позволяет одновременно дифференцировать колиформные микроорганизмы и кишечные патогены, сокращает время исследования до 18 часов, что повышает эффективность диагностики при проведении клинических и санитарно-микробиологических исследований.

- Не меняются стереотипы работы диагностических лабораторий практического здравоохранения.

- Повышается уровень доказательной медицины.

Таблица. Сравнительная характеристика роста контрольных тест-штаммов музейных культур на предлагаемой среде и среде-прототипе. Среда вариант I Биологические показатели сред (диаметр, морфология колоний) Е.coli ATCC 25922 E.coli Ewing (0124K 72) 227 С.freundii 101/57 K.pneumoniae 418 S.enteritidis 11272 S.typhimurium 79 E.faecalis 775 вариант II 10^-6 10^-6 10^-6 10^-6 10^-6 10^-6 10^-3 По примеру 1 1,4-1,6 1,8-2,5 1,8-2,5 2,0-2,5 1,6-2,0 1,6-2,0 Рост отсутствует Круглые, гладкие, блестящие колонии синего цвета с фиолетовым ореолом Круглые, гладкие, блестящие колонии темно-синего цвета с фиолетовым ореолом Круглые, гладкие, блестящие колонии ярко-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие колонии ярко-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии По примеру 2 1,4-1,6 1,8-2,5 1,8-2,5 2,0-2,5 1,6-2,0 1,6-2,0 Рост отсутствует Круглые, гладкие, блестящие колонии синего цвета с фиолетовым ореолом Круглые, гладкие, блестящие колонии темно-синего цвета с фиолетовым ореолом Круглые, гладкие, блестящие колонии ярко-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие колонии ярко-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии По примеру 3 1,4-1,6 1,8-2,5 1,8-2,5 2,0-2,5 1,6-2,0 1,6-2,0 Рост отсутствует Круглые, гладкие, блестящие колонии синего цвета с фиолетовым ореолом Круглые, гладкие, блестящие колонии темно-синего цвета с фиолетовым ореолом Круглые, гладкие, блестящие колонии ярко-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие колонии ярко-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии HiCrome Coliform Vgar w/SLS M1300 1,8-2,0 1,0-1,4 1,8-2,5 2,0-2,5 1,8-2,0 1,8-2,0 Рост отсутствует Круглые, гладкие, блестящие колонии светло-синего цвета Круглые, гладкие, блестящие колонии синего цвета Круглые, гладкие, блестящие колонии слабо-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие колонии слабо-розового цвета Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии Круглые, гладкие, блестящие, бесцветные колонии

Изобретение относится к медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для обнаружения колиформных бактерий и Е.coli в образцах пищевых продуктов и воды при проведении бактериологических исследований. Питательная среда содержит в качестве источника азота мясной пептон или панкреатический гидролизат рыбной муки, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий пировинограднокислый, L-триптофан, натрий додецилсульфат, 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon - GAL), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (X-GLUC), изопропил- β-D1-тиогалактопиранозид и микробиологический агар в заданном соотношении. Изобретения позволяет сократить время идентификации, повысить точность дифференциации колиформных бактерий и Е.coli и упростить способ приготовления питательной среды.2 н.з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Сухая хромогенная питательная среда для обнаружения колиформных бактерий и E.coli, содержащая источник азота, натрий хлористый, натрий додецилсульфат, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий пировинограднокислый, L-триптофан, 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon-GAL), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (X-GLUC), изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG), отличающаяся тем, что она дополнительно содержит реактив 1-изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) совместно с хромогенным субстратом 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида (X-GLUC) при следующем соотношении компонентов, г/л:
Пептон мясной 3,0±0,5 Натрий хлористый 5,0±1,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7±0,15 Натрий пировинограднокислый 1,0±0,15 L- триптофан 1,0±0,3 Натрий додецилсульфат 0,15±0,03 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,1±0,01 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,075±0,005 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,1±0,02 Агар бактериологический 10,0±3,0

2. Сухая хромогенная питательная среда для обнаружения колиформных бактерий и E.coli, содержащая источник азота, натрий хлористый, натрий додецилсульфат, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий пировинограднокислый, L-триптофан, 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (Salmon-GAL), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид (X-GLUC), изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG), отличающаяся тем, что в качестве источника азота она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, а также дополнительно содержит реактив 1-изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) совместно с хромогенным субстратом 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида (X-GLUC) при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки 3,0±0,5 Натрий хлористый 5,0±1,0 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0±0,1 Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7±0,15 Натрий пировинограднокислый 1,0±0,15 Триптофан 1,0±0,3 Натрий додецилсульфат 0,15±0,03 6-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид   (Salmon-GAL) 0,1±0,01 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид   (X-GLUC) 0,075±0,005 Изопропил-β-D1-тиогалактопиранозид (IPTG) 0,1±0,02 Агар бактериологический 10,0±3,0