ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕФРОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК A61K38/05 C07K5/72 A61P13/12 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается применения дипептида β-аспартил-аргинина (H-Asp(Arg)-OH) в качестве средства, обладающего нефропротекторной активностью.

Среди наиболее близких аналогов пептидной природы известно лекарственное средство, нормализующее функции почек [RU 2302868С1]. Данное вещество является полипептидным комплексом, выделенным из почек телят путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка. Использование данного полипептидного комплекса в качестве нефропротекторного средства может быть затруднено в связи со сложностью способов получения, малым выходом активных веществ, значительной вариабельностью их физико-химических свойств, а также из-за возможности возникновения у больных побочных реакций ввиду присутствия в природных препаратах балластных компонентов.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения средства пептидной природы, обладающего нефропротекторными свойствами, а также фармацевтической композиции на основе пептида, обладающего нефропротекторной активностью.

Технический результат изобретения заключается в применении пептида H-Asp(Arg)-OH в качестве средства, обладающего нефропротекторными свойствами, а также в создании фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, использование которой оказывает нефропротекторный эффект за счет стимуляции пролиферации и снижения воспалительных процессов в почечной ткани, а также активации метаболизма и нормализации синтеза тканеспецифических белков.

Предлагается применение пептида β-аспартил-аргинина формулы H-Asp(Arg)-OH для приготовления лекарственного средства, улучшающего функциональную активность почек.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, обладающей нефропротекторным действием, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида β-аспартил-аргинина формулы H-Asp(Arg)-OH и фармацевтически приемлемый носитель.

При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального, перорального, интраназального или местного способа введения.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа профилактики и лечения нефропатии различного генеза, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид формулы H-Asp(Arg)-OH, в дозах 0,1–10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день при внутримышечном введении, 1–10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день при интраназальном введении и 10–100 мкг/кг массы тела по крайней мере два раза в день при пероральном введении в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта – не менее 30 дней.

Пептид β-аспартил-аргинин формулы H-Asp(Arg)-OH получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид H-Asp(Arg)-OH, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве нефропротекторного средства.

Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению, эффективное количество пептида H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие «эффективное количество» подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, подходящей для парентерального, перорального, интраназального, местного способа введения.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза дипептида формулы β-аспартил-аргинин общей формулы H-Asp(Arg)-OH (пример 1), примерами испытания токсичности (пример 2) и биологической активности дипептида (примеры 3, 4, 5), примером исследования влияния фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, на морфофункциональное состояние тканей почек у старых крыс (пример 6), а также примером клинического применения фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество дипептида H-Asp(Arg)-OH, для лечения пациентов с хронической почечной недостаточностью (пример 7).

Пример 1. Синтез дипептида H-Asp(Arg)-OH

1. Название: β-аспартил-аргинин

2. Структурная формула: H-Asp(Arg)-OH

1. Брутто-формула: C₁₀H₁₉N₅O₅

2. Молекулярный вес без противоиона: 289,29

3. Противоион – ацетат

4. Внешний вид: белый порошок без запаха

5. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:

1. Характеристики готового препарата:

— растворимость: растворим в воде, изотоническом растворе хлорида натрия 0,9 % для инъекций; нерастворим в спирте 95 %, хлороформе, эфире и других органических растворителях;

— прозрачность и цветность раствора: раствор 0,05 г препарата в 10 мл воды прозрачен и бесцветен;

— содержание основного вещества: не менее 97 % (по ВЭЖХ, 220 нм);

— тонкослойная хроматография: ТСХ-индивидуален, R_f = 0,80 (ацетонитрил-вода 1:3);

— содержание влаги: не более 10 %;

— рН 0,001% раствора: 4,0-5,0 (потенциометрически);

— удельное оптическое вращение: [α]_D²²: от -33 ° до -37 ° (c=1, H₂O).

Пример синтеза дипептида H-Asp(Arg)-OH

1) Z-Asp(OSu)-OH (I), β-N-оксисукцинимидный эфир N-бензилоксикарбонил (α-бензил)-аспарагиновой кислоты (I). 2,21 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-аспарагиновой кислоты растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляют 0,71 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка N-оксисукцинимида. 1,27 г (6,2 ммоль) порошка N, N'-дициклогексилкарбодиимида растворяют в 20 мл диметилформамида. Оба раствора охлаждают до температуры -15 °С. Растворы объединяют и перемешивают при охлаждении льдом в течение 24 часов. Полученный раствор активированного эфира используют на следующей стадии.

2) Z-Asp(Arg-OBzl)-OBzl (II), α-бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(β- аргинил-бензилат)-аспарагиновой кислоты (II). К раствору активированного эфира Z-Asp(OSu)-OBzl (I), полученного на предыдущей стадии, добавляют 1,1 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка тозилата бензилового эфира аргинина и 0,86 мл триэтиламина. Перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем в реакционную смесь при перемешивании постепенно вливают 150 мл 2н раствора серной кислоты, продукт выпадает в виде масла, который затем растворяют в 50 мл этилацетата.

Затем содержимое реакционной колбы расслаивают в делительной воронке, нижнюю водную фазу сливают в стакан вместимостью 250 мл, а верхнюю органическую фазу - в стакан вместимостью 500 мл. Процедуру повторяют трижды с новыми порциями этилацетата (по 30 мл), затем все этилацетатные порции объединяют в исходной делительной воронке, в которую добавляют 20 мл 2 н раствора серной кислоты и осуществляют экстракцию, повторяя процедуру дважды. Затем этилацетатный раствор промывают последовательно водой (30 мл), дважды раствором бикарбоната натрия (30 мл), дважды раствором серной кислоты (30 мл) и водой (30 мл). Затем в этилацетатный раствор добавляют около 20 мг безводного сульфата натрия и оставляют на 10-12 часов.

Отфильтрованный этилацетатный раствор упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С на вакуумном роторном испарителе (Buchi Rotavapor R-114 или аналогичном) до прекращения отгонки растворителя и образования на дне колбы густого сиропа, который растворяют в 20 мл этилацетата, добавляя к раствору при постоянном перемешивании порциями гексан до появления устойчивой мути (около 20 мл). Колбу с полученной мутной системой оставляют в холодильнике при температуре 4°С в течение не менее 2 суток для завершения процесса кристаллизации.

Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают под вакуумом через пористый фильтр Шота, 2 раза промывают гексаном (5 мл), далее продукт переносят в чашку Петри без крышки. Окончательно продукт высушивают над пятиокисью фосфора в вакууме при температуре не выше 40 °С до постоянного веса.

3) H-Asp(Arg)-OH, β-аспартил-аргинин (III). α-Бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(β-аргинилбензилат)-аспарагиновой кислоты, полученный на предыдущей стадии, растворяют в смеси метанола (60 мл), дистиллированной воды (20 мл) и уксусной кислоты (20 мл) в присутствии 3 мл катализатора палладия на угле (Pd/C).

Контроль за полнотой деблокирования проводят в режиме ТСХ на пластинках Silu-fol в системе бензол-ацетон (2:1), деблокированный продукт имеет нулевую подвижность, исходный продукт имеет Rf=0,75. Реакция деблокирования считается законченной, если имеются только следовые количества исходного продукта (визуально).

Объединенный фильтрат упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С.

Для очистки 290 мг препарата растворяют в 4 мл 0,01 % трифторуксусной кислоты и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250мм Diasorb-130-C16T, 7 мкм. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Sol-vent Module,168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования - А: 0,1 % трифторуксусная кислота; В: 50% раствор ацетонитрила в 0,1 % трифторуксусной кислоте; градиент В 0→5 % за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при длине волны 215 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин.

Отбирают фракции основного пика, свободного от примесей (в примерном интервале 58,0 мин. - 69,0 мин.), объединяют их и упаривают в вакууме до образования сиропа, повторяя упаривание ещё 5 раз каждый раз с новой порцией (10 мл) 10 % уксусной кислоты. Остаток в колбе сушат в вакууме при температуре не выше 40 °С над твердым КОН в течение не менее 2 суток. После сушки продукт не должен иметь запаха.

После упаривания и сушки в вакууме остаток растворяют в 20 мл деионизованной воды и лиофилизируют.

4) Анализ готового препарата

Содержание основного вещества определяют методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex C 18 LUNA 4,6x150 мм. A: 0,1 % TFA, B: MeCN; градиент B 0→100 % за 10 мин. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при длине волны 220 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества не менее 97 %.

ТСХ: на хроматограммах образцов, обработанных раствором нингидрина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) фиолетового цвета с совпадающими Rf; на хроматограммах образцов, обработанных раствором бензидина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) темно-синего цвета с совпадающими Rf (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

Содержание влаги: не более 10 % (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при температуре 100 °C).

рН 0,01% раствора: от 4,0 до 5,0 (потенциометрически).

Удельное оптическое вращение: от –33,0° до – 37,0° в пересчете на сухое вещество (0,1% водный раствор, температура 23 °С, D-линия спектра натрия)

Пример 2. Изучение токсичности дипептида H-Asp(Arg)-OH

Общетоксическое действие пептида исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. Часть 1» (Москва, Гриф и К, 2012. 944 с.) острой токсичности при однократном введении препарата, а также хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование острой токсичности проведено на 110 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-24 г. Животные были рандомизированно разделены на 11 равных групп по 10 животных в каждой группе. Препарат вводили животным однократно внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу (ТД), рекомендуемую для клинического изучения, которая составляет 0,0014 мг/кг) в объеме 0,25 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.

Таким образом, дипептид H-Asp(Arg)-OH в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций при внутримышечном или внутрижелудочном введении, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.

Хроническую токсичность дипептида H-Asp(Arg)-OH, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам с массой тела 150-250 мг. Животным ежедневно вводили внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) препарат в дозах 0,1 мг/кг (70 ТД), 1,0 мг/кг (700 ТД), 3 мг/кг (2000 ТД) в 0,5 мл физиологического раствора в течение 30 дней. Наблюдение за животными вели в течение 60 дней после начала эксперимента. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось еженедельно. В начале и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Изучение подострой и хронической токсичности дипептида H-Asp(Arg)-OH свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата внутримышечно или внутрижелудочно в дозах, превышающих терапевтическую в 70-2000 раз.

Пример 3. Влияние дипептида H-Asp(Arg)-OH на пролиферацию в органотипической культуре ткани почки крыс

Исследование проведено на 26 и 23 (контроль) фрагментах почек молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии «Wistar» с массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов содержала (из расчёта на 100 мл): раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Фрагменты почек помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри с коллагеновым покрытием дна в термостате при температуре З6,7 °С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид H-Asp(Arg)-OH до конечной концентрации 0,05 нг/мл (выявленная ранее эффективная концентрация). В качестве контроля выступала культура эксплантатов почки крысы с добавлением питательной среды без пептида.

Количественную оценку влияния дипептида H-Asp(Arg)-OH на развитие эксплантатов почки осуществляли морфометрическим методом по показателю индекса площади (ИП), который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%.

При культивировании фрагментов почки выявлено, что внесение пептида H-Asp(Arg)-OH в конечной концентрации 0,05 нг/мл в культуральную среду приводило к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов на 80±6% (n=25, p<0,05) по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n=23).

Наблюдаемые изменения свидетельствуют о способности пептида H-Asp(Arg)-OH стимулировать пролиферацию почечной ткани.

Пример 4. Влияние дипептида H-Asp(Arg)-OH на функциональную активность клеток почки эмбриона человека

Исследование проводили на диссоциированных культурах клеток почки эмбриона человека линии HEK-293. Клетки культивировали в культуральных флаконах площадью 25 см² в питательной среде, состоящей из среды DMEM (Биолот, Россия) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (Gibco BRL, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco BRL, США) и гентамицина (100 ед/мл). Флаконы помещали в инкубатор при температуре 37 °С в условиях постоянного поступления 5% СО₂. Клетки пересевали до 2 пассажей с использованием 0,25% трипсина и 0,02% версена в соотношении 1:2 – 1:3 по достижению уровня субконфлюентности с оптимальной плотностью для роста (3,0-5,0)х10⁴ кл/см²; полную смену среды проводили каждые 2 суток. На 3 пассаже клетки пересевали в 24-луночные планшеты (Биолот, Россия) для дальнейшего исследования.

Влияние пептида H-Asp(Arg)-OH на функциональную активность клеток почки эмбриона человека оценивали по результатам построения кривой клеточного роста и анализа экспрессии маркеров функциональной активности почек. Для этого культуры клеток линии HEK-293 на 3 пассаже были разделены на 2 группы: 1 группа - контроль (добавление питательной среды), 2 группа - добавление пептида H-Asp(Arg)-OH в концентрации 100 нг/мл. Пептид и соответствующее количество питательной среды добавляли в культуры клеток за 12 ч до забора клеток для построения кривой клеточного роста и проведения иммуноцитохимического исследования.

Для построения кривой клеточного роста клетки линии HEK-293 на третьем пассаже клетки в концентрации 10⁴ кл/мл и пептид H-Asp(Arg)-OH или соответствующее количество питательной среды добавляли таким образом, чтобы общий объем раствора в ячейке составлял 2 мл. На 2-5 сутки культивирования клетки снимали с поверхности ячеек планшета трипсин-версеном и подсчитывали их количество в камере Горяева с использованием инвертированного микроскопа Nikon и компьютера.

В качестве маркеров функциональной активности почек были выбраны матриксная металлопротеиназа 9 типа (ММР-9) и виментин.

ММP-9 относится к группе желатиназ (желатиназа В) и участвует в деградации желатинов (денатурированных коллагенов, коллагенов IV и V типов), ламинина и некоторых хемокинов. ММР-9 экспрессируется на протяжении всего нефрона (в клубочках, в проксимальных и дистальных канальцах, петле Генле, собирательных трубочках) [Nagase H, Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases. J Biol Chem. 1999 Jul 30;274(31):21491-4. doi: 10.1074/jbc.274.31.21491. PMID: 10419448]. Экспрессия ММР-9 в почечных канальцах и интерстиции повышается при ишемической острой почечной недостаточности (ОПН). В модели "ишемия-реперфузия" почки у крыс установлено, что повышенная активность ММР-9 сопровождается деградацией белка окклюдина в эндотелиальных клетках, ведущей к усиленной проницаемости эндотелия. С другой стороны, применение у крыс с ишемической ОПН миноциклина (тетрациклинового ингибитора ММР) и АВТ-518 (специфического ингибитора ММР-2 и ММР-9) нивелирует этот эффект ММР и позволяет корригировать повышенную микрососудистую проницаемость [Sutton TA, Kelly KJ, Mang HE, Plotkin Z, Sandoval RM, Dagher PC. Minocycline reduces renal microvascular leakage in a rat model of ischemic renal injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2005 Jan; 288(1):F91-7. doi: 10.1152/ajprenal.00051.2004. Epub 2004 Sep 7. PMID: 15353401]. Важно отметить, что результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют об увеличении экспрессии ММР-9 в ткани почки при IgА-нефропатии и мезангиопролиферативном хроническом гломерулонефрите (ХГН) [Bauvois B., Mothu N., Nguyen J., Nguyen-Khoa T., Noel L.H., Jungers P. Specific changes in plasma concentrations of matrix metalloproteinase-2 and -9, TIMP-1 and TGF-beta1 in patients with distinct types of primary glomerulonephritis. Nephrol. Dial. Transplant. 2007;22:1115–1122], АНЦА (антинейтрофильные цитоплазматические антитела) - ассоциированном ХГН [Bonaci-Nikolic B, Nikolic MM, Andrejevic S, Zoric S, Bukilica M. Antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated autoimmune diseases induced by antithyroid drugs: comparison with idiopathic ANCA vasculitides. Arthritis Res Ther. 2005;7(5):R1072-81], а также при сахарном диабете на стадии, предшествующей гломерулосклерозу и тубулоинтерстициальному фиброзу [Vallon V, Komers R. Pathophysiology of the diabetic kidney. Compr Physiol. 2011;1(3):1175-1232. doi:10.1002/cphy.c100049]. Приведенные данные позволяют считать ММР-9 маркером функциональной активности почечной ткани в норме и при почечных патологиях различного генеза.

Виментин – белок промежуточных филаментов соединительных тканей, который отвечает за поддержание формы клетки и обеспечивает её целостность. Виментин считается мезенхимальным маркером токсичности для печени и почек [de Matos A. C. C. et al. Vimentin expression is a predictor of renal dysfunction after kidney transplantation //Einstein. – 2007. – Т. 5. – №. 153. – С. e160.]. Отмечено, что виментин участвует в прогрессировании фиброза опухоли почек у пациентов с туберозным склерозом почек [Liang S, Salas T, Gencaslan E, Li B, Habib SL. Tuberin-deficiency downregulates N-cadherin and upregulates vimentin in kidney tumor of TSC patients. Oncotarget. 2014;5(16):6936-6946. doi:10.18632/oncotarget.2206]. Отмечено, что виментин может временно экспрессироваться в почках с острым и обратимым повреждением и хронически - с необратимым повреждением почек. Виментин рассматривается как индикатор регенерирующей и пролиферирующей активности канальцевых поражений почек [Gröne HJ, Weber K, Gröne E, Helmchen U, Osborn M. Coexpression of keratin and vimentin in damaged and regenerating tubular epithelia of the kidney. Am J Pathol. 1987 Oct;129(1):1-8. PMID: 2444108; PMCID: PMC1899694.]. Отмечалось, что виментин наряду с десмином, подоцином и синаптоподином является чувствительным маркером повреждения подоцитов как при остром, так и при хроническом повреждении клубочков почек у крыс [Funk J, Ott V, Herrmann A, Rapp W, Raab S, Riboulet W, Vandjour A, Hainaut E, Benardeau A, Singer T, Jacobsen B. Semiautomated quantitative image analysis of glomerular immunohistochemistry markers desmin, vimentin, podocin, synaptopodin and WT-1 in acute and chronic rat kidney disease models. Histochem Cell Biol. 2016 Mar; 145(3):315-26. doi: 10.1007/s00418-015-1391-6. Epub 2015 Dec 15. PMID: 26671788.]

Экспрессию ММР-9 и виментина анализировали иммуноцитохимическим методом с использованием первичных моноклональных антител anti-MMP-9 (1:50, Novocastra) и аnti-vimentin (1:50, Dako) и вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом Alexa Fluor 567 (1:1000, Abcam). Экспрессию ММР-9 и виментина в культуре клеток линии HEK-293 визуализировали с использованием конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000 (Япония) и количественно анализировали в программном обеспечении «Vidеotest Morphology 5.2» [Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия. - М.: Медицина, 2006. 192 с.] по параметру площади экспрессии. Площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0 с использованием критериев Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и U-критерия Манна-Уитни.

При исследовании влияния дипептида H-Asp(Arg)-OH на кривую клеточного роста были получены следующие результаты. Исходно (в начале первых суток культивирования, через 12 часов после введения пептида) количество клеток в каждой группе составило 2,0×10⁴ кл. На вторые сутки культивирования в контроле среднее количество клеток составило 2,8×10⁴ кл, при добавлении пептида H-Asp(Arg)-OH – 3,4×10⁴ кл. На третьи сутки культивирования в контроле среднее количество клеток составило 5,4×10⁴ кл, при добавлении пептида H-Asp(Arg)-OH – 7,3×10⁴ кл. На четвертые сутки культивирования в контроле среднее количество клеток составило 5,0×10⁴ кл, при добавлении пептида H-Asp(Arg)-OH – 7,5×10⁴ кл. На пятые сутки культивирования в контроле среднее количество клеток составило 3,7×10⁴ кл, при добавлении пептида H-Asp(Arg)-OH – 4,9×10⁴ кл. Таким образом, по ходу кривой роста культуры клеток почек, пептид H-Asp(Arg)-OH повышал количество клеток на 20-50% по сравнению с контролем, при этом максимальный эффект действия пептида наблюдался на 4 сутки культивирования.

При исследовании влияния дипептида H-Asp(Arg)-OH на экспрессию маркеров функциональной активности почек были получены следующие результаты. В контроле значение площади экспрессии MMP-9 в культуре клеток почки эмбриона человека линии HEK-293 составило 5,24±0,38%. При добавлении пептида H-Asp(Arg)-OH площадь экспрессии ММР-9 уменьшилась в 2,72 раза по сравнению с контролем и составила 1,93±0,26%. Поскольку экспрессия ММР-9 возрастает в ткани почек при патологии (карцинома, острая почечная недостаточность, хронический гломерулонефрит), снижение экспрессии этого белка в 2,7 раза под действием пептида H-Asp(Arg)-OH указывают на его выраженные нефропротекторные свойства при патологии почек.

Площадь экспрессии виментина в контрольной культуре линии HEK-293 составила 45,31±1,06%. При добавлении пептида H-Asp(Arg)-OH площадь экспрессии виментина достоверно увеличилась на 31% и составила 59,42±1,15%. Экспрессия виметина, одного из основных белков цитоскелета, снижается в клетках почек при острых воспалительных процессах, что может быть связано с вступлением клеток в апоптоз. Повышение экспрессии виментина на 31% в клетках почек под действием пептида H-Asp(Arg)-OH свидетельствует о стимуляции внутриклеточного метаболизма и дифференцировки клеток почек. Полученные данные свидетельствуют о противовоспалительном и нефропротекторном эффектах пептида H-Asp(Arg)-OH и целесообразности создания лекарственного препарата на его основе.

Пример 5. Изучение взаимодействия дипептида H-Asp(Arg)-OH с дезоксирибонуклеиновой кислотой

Взаимодействие дипептида H-Asp(Arg)-OH с ДНК изучали с помощью молекулярного моделирования. Модели дипептида H-Asp(Arg)-OH и ДНК рассчитывали методом молекулярной механики по вычислению полной потенциальной энергии заданных молекул согласно закону Гука. Полную энергию рассчитывали с учетом силового поля, которое содержит набор силовых констант и стандартных значений длин связей, торсионных и валентных углов. Уравнение полной потенциальной энергии, минимизированной относительно начала координат, имело вид:

,

где E_tot - полная потенциальная энергия макромолекулы; Е_str - энергия деформации связей; E_bend - энергия деформации валентных углов; E_tors - энергия деформации торсионных углов; E_vdw - энергия вандерваальсовых взаимодействий; E_elec - энергия электростатического взаимодействия.

Вклад деформации связей в полную потенциальную энергию описывает изменения энергии при растяжении или сжатии связи относительно своей стандартной длины:

где: k_b - силовая константа растяжения связей; b₀ - стандартная длина связи; b – текущая длина связи.

Вклад деформации валентных углов в потенциальную энергию описывается уравнением:

где: k₀ - силовая константа деформации валентных углов; - равновесное значение валентного угла; - текущее значение валентного угла.

Вклад вращения вокруг двугранных углов в потенциальную энергию рассчитывается тригонометрическим уравнением:

где: – торсионный барьер (барьер вращения); - текущее значение торсионного угла; n – период (число минимумов энергии на один полный цикл); - стандартное значение торсионного угла.

Вклад ван-дер-ваальсовых взаимодействий между непосредственно связанными атомами в потенциальную энергию выражается потенциалом Леннарда-Джонса:

где: - коэффициент вклада отталкивания; - коэффициент вклада притяжения; - расстояние между атомами i и j.

Вклад электростатических сил в полную потенциальную энергию системы описывается уравнением кулоновского взаимодействия:

где: - диэлектрическая проницаемость; Q и Q - заряды на взаимодействующих атомах: r – межатомное расстояние.

В данной работе конформацию молекулы дипептида H-Asp(Arg)-OH рассчитывали с использованием полноатомного силового поля Amber12EHT, которое разработано для расчета конформаций белков, нуклеиновых кислот и малых молекул [Case D.A., Darden T.A., Cheatham T.E. AMBER 12, University of California, San Francisco. 2012.].

После построения компьютерной модели дипептида H-Asp(Arg)-OH производили геометрическую оптимизацию полученной структуры путем минимизации энергии методами скорейшего спуска и сопряженных градиентов. Метод скорейшего спуска основан на постепенном сдвиге атомов молекулы пептида вдоль координатных осей для нахождения нового положения с более низкой потенциальной энергией. Минимизация прекращалась при условии достижения энергетического минимума. Этот метод используется для структур, находящихся вдали от энергетического минимума. Для более точного расчета используется метод сопряженных градиентов, основная идея которого заключается в постепенном накоплении информации о минимизированной функции от итерации к итерации. Также учитывается градиент энергии на каждой стадии минимизации, который далее используется в качестве дополнительной информации для расчета нового вектора направления процедуры минимизации. Так, каждая последующая стадия непрерывно уточняет направление к минимуму.

Полученная после геометрической оптимизации молекула имеет множество изомеров, которым соответствуют различные значения энергии (конформеров). Затем проводили конформационный поиск, который заключался в поиске наиболее энергетически выгодных изомеров молекулы, которые имеют схожие значения полной потенциальной энергии в пределах определенных минимумов. Конформационный поиск проводили с помощью молекулярной динамики, который позволяет воспроизвести движение молекулы в заданный интервал времени, в данном случае 1 пс. Основой метода является классическое уравнение движения Ньютона:

,

где - сила, действующая на атом i в момент времени t; - масса i-го атома; - ускорение атома i в момент времени t.

Предполагается, что биологическая активность лекарственного вещества определяется одной, так называемой «биоактивной» конформацией его молекул, которую необходимо обнаружить среди множества всех низкоэнергетических конформаций [Ghose, A. K., Crippen, G. M., Revankar, G. R., McKernan, P. A., Smee, D. F., & Robins, R. K. Analysis of the in vitro antiviral activity of certain ribonucleosides against parainfluenza virus using a novel computer aided receptor modeling procedure. Journal of Medicinal Chemistry. 1989. N. 32(4). P. 746–56]. В связи с этим, для поиска низкоэнергетической конформации дипептида использовали метод LowModeMD, который позволяет рассчитать молекулярную динамику около 1 пс при постоянной температуре с последующей оптимизацией системы. Результат конформационного поиска представляет собой список низкоэнергетических конформеров молекулы, ранжированных по значению потенциальной энергии.

Для моделирования молекулы ДНК были построены все возможные комбинации последовательностей нуклеотидов ДНК, состоящих из 4 п.н. Количество таких комбинаций составило 141 последовательность.

Взаимодействия дипептида H-Asp(Arg)-OH с молекулой ДНК моделировали методом полугибкого докинга, который заключался в подстановке низкоэнергетической конформации дипептида H-Asp(Arg)-OH в сайт связывания с ДНК и расчет оптимальной взаимной ориентации молекулы дипептида и ДНК при их связывании и энтальпии (ккал/моль). Причем учитывали конформационную подвижность только дипептида, а азотистые основания ДНК были жесткими. При расчете оптимальных ориентаций исследуемого дипептида в двуцепочечной ДНК учитывали площадь контакта, число водородных связей, параметры гидрофобных и электростатических взаимодействий. Использовали силовое поле Amber99 и генетический алгоритм поиска Affinity dG. Решения докинга ранжировали по величинам оценочной функции (dH), которую рассчитывали по следующей формуле:

dH = C_hb f_hb + C_ion f_ion + C_mlig f_mlig + C_hh f_hh + C_hp f_hp + C_aa f_aa

Эта функция оценивает вклад энтальпии в свободную энергию связи, используя линейную функцию, где f означает частично рассчитанные атомные взаимодействия, C – коэффициенты, вносящие вклад в расчет аффинности, индекс hb – взаимодействия между донорно-акцепторными парами, ion – ион-ионные взаимодействия между заряженными группами, mlig – взаимодействия между азотами/серой и переходными металлами, hh – гидрофобные взаимодействия, hp –взаимодействия между гидрофобными и полярными атомами; aa – взаимодействия между любыми двумя атомами.

Решения докинга ранжировали по убыванию от наиболее энергетически выгодного решения до наименее энергетически выгодного решения. Из каждого решения докинга анализировали только первое, наиболее энергетически выгодное решение.

В ходе молекулярного моделирования была получена низкоэнергетическая конформация пептида H-Asp(Arg)-OH. Пептид состоит из двух а.о. β-аспарагиновой кислоты и аргинина. При рН 7 суммарный заряд молекулы равен -1. Пептид образует сеть внутримолекулярных водородных связей. При анализе результатов докинга выявлена последовательность ACTA в молекуле ДНК, с которой дипептид H-Asp(Arg)-OH образует наиболее энергетически выгодный комплекс, причем взаимодействие оказалось сильно выраженным, так как вклад энтальпии в свободную энергию связи составил 5,7 ккал/моль. Исследуемый дипептид связывался с молекулой ДНК со стороны малой бороздки и образовывал 2 водородные связи с атомом O₂ тимина и с сахаро-фосфатным остовом ДНК.

Таким образом, есть основания полагать, что нефропротекторные свойства фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, основаны на способности данного дипептида связываться с соответствующей молекулой ДНК в малой бороздке, регулируя тем самым экспрессию генов и синтез тканеспецифических белков.

Пример 6. Влияние фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, на морфофункциональное состояние тканей почек у старых крыс

Исследование проведено на 30 нелинейных белых крысах обоего пола в возрасте 20-24 месяца (старые животные) с массой тела 330-380 г, а также на 10 крысах в возрасте 3 месяца (молодые животные) с массой тела 140-160 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария с поддержанием постоянной температуры (18-22°С) и относительной влажности 50-55%, на стандартном сбалансированном пищевом рационе (полнорационный комбикорм) со свободным доступом к воде. Все исследования проведены в соответствии с Директивой Европейского союза 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях.

Животные были рандомизированно распределены на 4 равные группы: 1 группа – контроль (интактные молодые животные); 2 группа – контроль (интактные старые животные); животным 3 группы (старые животные) ежедневно в течение 10 дней внутримышечно вводили фармацевтическую композицию, содержащую эффективную концентрацию дипептида H-Asp(Arg)-OH в предполагаемой 10-кратной терапевтической дозе для человека (10 ТД) 0,014 мг/кг; животным 4 группы (старые животные) вводили в том же режиме и в той же дозе фармацевтическую композицию, содержащую эффективную концентрацию дипептида H-Asp(Arg)-OH внутрижелудочно (через зонд).

Функциональное состояние почек крыс исследовали в условиях водной нагрузки (внутрижелудочное введение питьевой воды в объеме 5% от массы тела с последующим сбором мочи в течение 2 ч). Животных выводили из эксперимента путем декапитации под тиопенталовым наркозом (80 мг/кг). Для оценки функционального состояния почек фотоколориметрическим методом определяли содержание креатинина в плазме крови и моче по реакции Яффе, концентрацию белка в моче – по реакции с сульфосалициловой кислотой, содержание ионов натрия и калия в плазме и моче – методом эмиссионной фотометрии в пламени, содержание титруемых кислот и ионов аммония в моче – титрованием раствором натрия гидрокарбоната.

Стандартизацию показателей проводили путем пересчета на единицу массы тела животных или на 100 мкл клубочкового фильтрата. На основании полученных данных рассчитывали показатели функций почек (скорость клубочковой фильтрации (СКФ), экскрецию белка, титруемых кислот, ионов аммония, ионов водорода, ионов натрия и калия, реабсорбцию воды, ионов натрия, проксимальный и дистальный транспорт ионов натрия).

Для оценки прооксидантно-антиоксидантного баланса определяли содержание малонового диальдегида (МДА), активность каталазы (КАТ) и глутатионпероксидазы (ГП) в гомогенате почек.

Гистологические срезы почек, окрашенные гематоксилином и эозином, изучали методом световой микроскопии (микроскоп «ЛЮМАМ-Р8», цифровая фотокамера Olympus C740UZ) с анализом в программе «ВидеоТест - Размер 5.0» («Видеотест», Россия).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS Statistics 17.0. Характер распределения в группе определяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность межгрупповых различий оценивали по параметрическому t-критерию Стъюдента (при нормальном распределении переменных), и непараметрическому U-критерию Манна-Уитни (в случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением). Наличие корреляционной взаимосвязи между показателями определяли с помощью r-критерия Спирмена. Уровень значимости различий оценивали при p<0,01 и p<0,05.

Результаты исследования представлены в таблице 1. У интактных старых животных наблюдалось ухудшение функциональных показателей почек по сравнению с молодыми животными. Так, отмечалось снижение диуреза в 1,3 раза, СКФ в 1,2 раза и повышение показателя реабсорбции воды на 5% по сравнению с молодыми животными. Установлено, что фармацевтическая композиция, содержащая дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, оказывает диуретическое действие, на что указывает достоверное увеличение диуреза в 1,2 раза по сравнению с показателем у старых интактных крыс на фоне тенденции к росту СКФ и уменьшения реабсорбции воды. Обнаружено гипоазотемическое действие препарата, на что указывает уменьшение концентрации креатинина в плазме крови в 1,3 раза по сравнению с показателем у старых интактных животных; достоверно уменьшалось содержание белка в моче в 1,8 раза и его экскреция в 1,5 раза по сравнению с контролем старых животных. Со стороны кислоторегулирующей функции почек под влиянием фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, выявлено небольшое увеличение рН мочи на 1,5-2,2% на фоне достоверного роста экскреции ионов аммония в 1,3 раза и отсутствия изменений показателя экскреции титруемых кислот. Все перечисленные показатели у животных 3 и 4 групп, которым вводили фармацевтическую композицию, содержащую дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, внутримышечно или внутрижелудочно, приближались к показателям у интактных молодых животных и достоверно отличались от контрольных показателей у животных из 2 группы контроля (старые животные).

Таблица 1 — Влияние фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, на функциональное состояние почек старых крыс (М±SD)

Показатель Контроль молодые животные Контроль старые животные H-Asp(Arg)-OH 0,014 мг/кг
внутримышечно H-Asp(Arg)-OH 0,014 мг/кг
внутрижелудочно Диурез, мл/2 ч 4,58±0,29 3,51±0,14^ 4,30±0,14* 4,34±0,13* PCr, мкмоль/л 47,34±1,27 67,65±1,83^ 53,32±2,34* 56,19±2,67* СКФ, мкл/мин 640,27±33,87 516,32±39,12^ 602,22±30,27 598,67±34,37 RH₂O, % 93,24±0,34 98,19±0,40^ 95,38±0,37* 95,68±0,40* Upr, г/л 0,011±0,002 0,031±0,006^ 0,027±0,005* 0,022±0,004* Epr, мг/2 ч 0,005±0,001 0,108±0,017^ 0,063±0,002* 0,058±0,003* рН мочи 7,26±0,03 7,16±0,08 7,28±0,02* 7,29±0,04* ЕТК, мкмоль/2 ч 5,76±0,62 5,87±0,47 5,77±0,43 5,79±0,54 ЕNH⁴⁺, мкмоль/2 ч 20,47±0,86 18,32±0,95 20,54±0,86 19,05±0,91 ЕNa⁺, мкмоль/2 ч 2,96±0,25 1,36±0,14^ 2,69±0,19* 2,62±0,16* RNa⁺, мкмоль/мин 84,72±8,11 85,61±7,50 83,67±8,65 85,08±8,07 RFNa⁺, % 98,65±0,23 98,87±0,12 98,52±0,16 97,98±0,20 TpNa⁺, ммоль/мин 68,45±5,34 67,33±6,15 68,83±6,05 68,11±6,19 TdNa⁺, мкмоль/мин 3,99±0,19 3,97±0,18 3,89±0,17 4,02±0,22 TdNa⁺, мкмоль/100 мкл 0,83±0,07 0,79±0,06 0,80±0,07 0,81±0,05 PК⁺ , ммоль/л 5,92±0,44 5,96±0,36 5,90±0,47 5,98±0,35 ЕК⁺, мкмоль/2 ч 22,13±2,32 22,61±2,85 22,27±2,45 22,46±2,11

Статистически значимые различия:

* р<0,05 по сравнению с показателем у старых животных (контроль 2 группа);

^ р<0,05 по сравнению с показателем у молодых животных (контроль 1 группа).

Условные обозначения: PCr - концентрация креатинина в плазме крови; СКФ - скорость клубочковой фильтрации; RH₂O - реабсорбция воды; Upr - концентрация белка в моче; Epr – экскреция белка; ЕТК - экскреция титруемых кислот; ЕNH₄⁺ - экскреция ионов аммония; ЕNa⁺ - экскреция ионов натрия; RNa⁺ - абсолютная реабсорбция ионов натрия; RFNa⁺ - относительная реабсорбция ионов натрия; TpNa⁺ - проксимальный транспорт ионов натрия; TdNa⁺ - дистальный транспорт ионов натрия; РК⁺ - концентрация ионов калия в плазме крови; EК⁺ - экскреция ионов калия.

При исследовании влияния фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, на состояние ионорегулирующей функции почек была выявлена тенденция к росту экскреции ионов натрия с мочой, обусловленного увеличением диуреза. При отсутствии достоверных изменений абсолютной, относительной и проксимальной реабсорбции ионов натрия под влиянием исследуемой фармацевтической композиции наблюдалось усиление в 1,2 раза дистального транспорта ионов натрия, однако стандартизированный показатель оставался на уровне контрольных значений. В группах животных, которым вводили фармацевтическую композицию обеими способами (внутримышечно или внутрижелудочно), не обнаружено изменений экскреции ионов калия в моче (Таблица 1).

Состояние внутрипочечных механизмов авторегуляции является важным критерием комплексной оценки почечной функции в физиологических условиях, при развитии патологии, а также при изучении ренальных эффектов биологически активных веществ. В контрольных группах молодых и старых животных функционирование клубочково-канальцевого баланса отображалось прямой корреляцией между СКФ и абсолютной реабсорбцией ионов натрия (старые животные r = 0,921; молодые животные r = 0,933), проксимальным транспортом ионов натрия (старые животные r = 0,887; молодые животные r = 0,936), дистальным транспортом ионов натрия (старые животные r = 0,930; молодые животные r = 0,937), а канальцево-канальцевая связь выражалась обратной корреляцией между показателями проксимального и дистального транспорта ионов натрия (старые животные r = -0,878; молодые животные r = -0,891). Функционирование клубочково-канальцевого баланса в условиях применения фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, характеризовалось также наличием корреляционной зависимости между СКФ и абсолютной реабсорбцией ионов натрия (r = 0,915), проксимальным транспортом ионов натрия (r = 0,921), канальцево-канальцевая связь оставалась отрицательной (r = -0,875), как и у контрольных животных. Как следует из приведенных данных, корреляционные показатели у старых животных после введения им исследуемой фармацевтической композиции обоими способами приближались к показателям у молодых животных.

На гистологических препаратах почек крыс 1 контрольной группы (молодые животные) отсутствовали патологические изменения морфологической организации ткани: клубочки нормального строения, эпителий проксимальных и дистальных канальцев без выраженных патологических изменений, все канальцы коркового вещества плотно упакованы, перикарионы эпителиоцитов компактны, ядра мономорфные, просветы канальцев свободные, интерстиций морфологически соответствует норме. В гистологических препаратах старых крыс (2 контрольная группа) присутствуют признаки обратимой гидропической дистрофии эпителиоцитов, в извитых канальцах отмечаются разной выраженности дистрофические изменения – от набухания эпителиоцитов до зернистой трансформации перикариона и их деструкции.

В почках крыс, которым вводили фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала дипептид H-Asp(Arg)-OH, внутримышечно или внутрижелудочно, выявлено обратимое гидропическое набухание 11% эпителиоцитов проксимальных канальцев почек преимущественно юкстамедуллярной зоны, что находится в пределах возрастной физиологической нормы. Эти изменения могут быть обусловлены влиянием препарата на транспортные процессы воды, белка и ионов в проксимальных канальцах почек, что коррелирует с функциональными показателями¸ приведенными в таблице 1.

Важным компонентом поддержания гомеостаза является постоянство прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма. Процессы перекисного окисления необходимы для нормального функционирования биосистем, регуляции физико-химических свойств мембран клеток. Активные формы кислорода (АФК) участвуют в метаболизме клеток как вторичные мессенджеры при передаче межклеточных и внутриклеточных регуляторных сигналов, в то время как усиление перекисного окисления приводит к развитию оксидативного стресса, который играет существенную роль в патогенезе многих заболеваний.

Исследование влияния курсового введения фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала двумя способами введения на показатели прооксидантно-антиоксидантного равновесия в почках крыс позволило выявить его основные антиоксидантные эффекты (табл. 2).

У старых животных контрольной группы наблюдалось достоверное снижение активности глутатионпероксидазы в 1,4 раза и каталазы в 1,1 раза, а также повышение содержания МДА в 1,5 раза по сравнению с соответствующими показателями у контрольных молодых животных (р<0,05 по всем показателям).

Под влиянием фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, наблюдалось снижение интенсивности перекисного окисления липидов в ткани почек крыс, выражавшееся в достоверном по сравнению с интактными старыми животными повышении активности глутатионпероксидазы в 1,2-1,3 раза и каталазы в 1,15 раза, сопровождавшееся существенным уменьшением содержания малонового диальдегида в 1,3 и 1,4 раза при внутримышечном и внутрижелудочном введении соответственно. Как видно из данных таблицы 2, показатели перекисного окисления липидов в ткани почек старых крыс после применения фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, приближались к показателям молодых животных, что свидетельствует о регулирующем действии препарата на функциональную активность основных тканей почек.

Таблица 2 — Влияние фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала на прооксидантно-антиоксидантный баланс в ткани почек старых крыс (М±SD)

Группа крыс Активность ГП,
нмоль/(мин×мг) Активность КАТ,
мкмоль/(мин×мг) Содержание МДА, мкмоль/г Контроль молодые крысы 149,62±3,11 8,21±0,24 19,73±0,97 Контроль старые крысы 109,33±6,33^ 7,74±0,30^ 29,72±0,57^ H-Asp(Arg)-OH 0,014 мг/кг внутримышечно 133,54±4,78* 8,31±0,22* 22,14±0,45* H-Asp(Arg)-OH 0,014 мг/кг внутрижелудочно 135,48±5,13* 8,25±0,27* 21,43±0,55*

Статистически значимые различия с контролем:

* р<0,05 по сравнению с показателем у старых животных (контроль 2 группа);

^ р<0,05 по сравнению с показателем у молодых животных (контроль 1 группа).

Условные обозначения: МДА – малоновый диальдегид; ГП – глутатионпероксидаза; КАТ – каталаза.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов можно сделать заключение о том, что при курсовом 10-дневном введении старым животным фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала в 10-кратной терапевтической рекомендуемой для человека дозировке, внутримышечно или внутрижелудочно дипептид положительно влияет на процессы канальцевого транспорта воды, белка и ионов в нефронах при сохранении внутрипочечных механизмов авторегуляции, проявляя при этом диуретическое действие. Наряду с этим, отсутствие значительных сдвигов прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза и патологических изменений гистоструктуры почек свидетельствуют об отсутствии у исследуемой фармацевтической композиции нефротоксических свойств. Результаты исследования указывают на безопасность и перспективность применения фармацевтической композиции, содержащей дипептид H-Asp(Arg)-OH в качестве активного начала, в качестве нефропротекторного лекарственного средства для профилактики и лечения патологии почек, в том числе и возраст-ассоциированной.

Пример 7. Клиническое применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Arg)-OH, для лечения больных с хронической почечной недостаточностью

В клиническое исследование были включены 134 пациента с хронической почечной недостаточностью, которые предъявляли жалобы на тошноту, потерю аппетита, частые ночные мочеиспускания, кожный зуд, быструю утомляемость, гипертонию. Все больные получали симптоматическую и патогенетическую терапию по поводу заболевания, которая способствовала временному уменьшению выраженности симптомов.

Больные методом рандомизации были разделены на 4 группы – контрольную (КГ, 15 человек) и 3 основных (119 человек). Больные контрольной группы получали только общепринятую терапию. 44 больных 1 основной группы (ОГ-1) дополнительно к общепринятой терапии получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH в дозах 10,0 мкг/кг (ОГ-1/1, n=19) или 100,0 мкг пептида на 1 кг массы тела (ОГ-1/2, n=25) перорально по 1 капсуле 2 раза в день ежедневно в течение 30 дней. Во вторую основную группу (ОГ-2) вошли 38 больных, которые получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH в виде раствора интраназально по 5 капель в каждый носовой ход в дозах 1,0 мкг/кг (ОГ-2/1, n=16) или 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-2/2, n=22) в день в течение 30 дней. В третью основную группу (ОГ-3) вошло 37 человек, которые получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH в виде раствора для внутримышечного применения по 1 мл в дозах 0,1 мкг/кг (ОГ-3/1, n=20) или 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-3/2, n=17) в день в течение 30 дней.

В результате проведенных исследований установлено, что применение дополнительно к общепринятой терапии фармацевтической композиции на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH при пероральном, интраназальном и внутримышечном способах введения способствовало сглаживанию клинических проявлений хронической почечной недостаточности в 78% случаев. Показательными были данные лабораторного исследования. На фоне приема фармацевтической композиции наблюдалась активация метаболизма почечных тканей, сопровождающаяся усилением секреторной функции почек, что отражалось в динамике биохимических показателей крови больных. Как видно из данных, приведенных в таблице 3, в контрольной группе после лечения пациентов общепринятыми методами наблюдалось улучшение биохимических показателей крови, отражающих функцию почек, по сравнению с показателями до лечения. Однако эти показатели не достигали нормальных значений. У больных основных групп биохимические показатели крови приближались к нормальным значениям. Так, содержание остаточного азота в крови составил в среднем у больных всех групп до лечения 38,2±0,6 ммоль/л, а после лечения в контрольной группе - 32,1±0,2 ммоль/л (p<0,05), однако у больных 1 основной группы этот показатель снизился до 29,8±0,4 ммоль/л (ОГ-1/1) и 28,5±0,2 ммоль/л (ОГ-1/2), у больных ОГ-2 – до 30,4±0,6 ммоль/л (ОГ-2/1) и 28,1±0,3 ммоль/л (ОГ-2/2), у больных ОГ-3 – до 28,3±0,5 ммоль/л (ОГ-3/1) и 27,6±0,1 ммоль/л (ОГ-3/2), что достоверно ниже по сравнению с показателем в контрольной группе и соответствует верхней границе нормы (28,6 ммоль/л). Такая же тенденция прослеживается в динамике содержания мочевины в крови: снижение повышенного исходно показателя отмечается у больных всех четырех групп, однако после лечения у пациентов ОГ-1 показатель составил 9,2±0,6 ммоль/л (ОГ-1/1) и 8,7±0,4 ммоль/л (ОГ-1/2), у пациентов ОГ-2 - 9,8±0,4 ммоль/л (ОГ-2/1) и 8,8±0,5 ммоль/л (ОГ-2/2), у пациентов ОГ-3 - 8,7±0,3 ммоль/л (ОГ-3/1) и 8,2±0,6 ммоль/л (ОГ-3/2), что приближает показатели у пациентов основных групп к верхней границе нормальных значений (8,3 ммоль/л). Характерны также изменения содержания креатинина в крови: до лечения средний показатель у пациентов всех групп составил 0,45±0,08 ммоль/л, что значительно превышает нормальное значение (0,044-0,1 ммоль/л) и свидетельствует о II стадии хронической почечной недостаточности. У пациентов контрольной группы после общепринятого лечения содержание креатинина в крови снизилось достоверно по сравнению с показателем до лечения (0,25±0,05 ммоль/л, р<0,05), однако оставалось существенно выше нормальных значений. После дополнительного применения фармацевтической композиции на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH содержание креатинина в крови снизилось достоверно по сравнению с показателями как до лечения, так и после лечения с применением общепринятых средств: у пациентов ОГ-1 - до 0,17±0,03 ммоль/л (ОГ-1/1) и 0,19±0,05 ммоль/л (ОГ-1/2), у пациентов ОГ-2 – до 0,18±0,06 ммоль/л (ОГ-2/1) и 0,15±0,03 ммоль/л (ОГ-2/2), у пациентов ОГ-3 – до 0,13±0,02 ммоль/л (ОГ-3/1) и 0,1±0,05 ммоль/л (ОГ-3/2), приближаясь в верхней границе нормы (р<0,05 для показателей в трех основных группах).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о терапевтической эффективности применения фармацевтической композиции на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH в комплексном лечении больных с хронической почечной недостаточностью и другими заболеваниями, связанными с нарушением функции почек.

Таблица 3 – Влияние фармацевтической композиции на основе дипептида H-Asp(Arg)-OH на биохимические показатели крови больных с хронической почечной недостаточностью

Показатель Норма До лечения После лечения КГ ОГ-1 ОГ-2 ОГ-3 Остаточный азот, ммоль/л 14,3-28,6 38,2±0,6 32,1±0,2* ОГ-1/1
29,8±0,4*#
ОГ-1/2
28,5±0,2*# ОГ-2/1
30,4±0,6*#
ОГ-2/2
28,1±0,3*# ОГ-3/1
28,3±0,5*#
ОГ-3/2
27,6±0,1*# Мочевина, ммоль/л 2,5-8,3 16,8±0,8 13,3±0,7* ОГ-1/1
9,2±0,6*#
ОГ-1/2
8,7±0,4*# ОГ-2/1
9,8±0,4*#
ОГ-2/2
8,8±0,5*# ОГ-3/1
8,7±0,3*#
ОГ-3/2
8,2±0,6*# Креатинин, ммоль/л 0,044-0,1 0,45±0,08* 0,25±0,05* ОГ-1/1
0,17±0,03*#
ОГ-1/2
0,19±0,05*# ОГ-2/1
0,18±0,06*#
ОГ-2/2
0,15±0,03*# ОГ-3/1
0,13±0,02*#
ОГ-3/2
0,1±0,05*#

* - р<0,05 по сравнению с показателем в той же группе до лечения.

# - р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе.

Изобретение относится к применению β-аспартил-аргинина формулы H-Asp(Arg)-OH для приготовления фармацевтической композиции, обладающей нефропротекторной активностью, и способу лечения нефропатии различного генеза, заключающемуся во введении пациенту фармацевтической композиции, обладающей нефропротекторным действием, в форме для парентерального, перорального, интраназального, местного способа введения, при этом композиция содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида β-аспартил-аргинина формулы H-Asp(Arg)-OH и фармацевтически приемлемый носитель, при этом при парентеральном введении доза лекарственного средства составляет 0,1–10 мкг/кг массы тела один раз в день, при интраназальном – 1,0–10 мкг/кг массы тела один раз в день, при пероральном – 10,0–100 мкг/кг массы тела два раза в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Технический результат изобретения заключается в нефропротекторном действии пептида H-Asp(Arg)-OH за счет стимуляции пролиферации и снижения воспалительных процессов в почечной ткани, а также активации метаболизма и нормализации синтеза тканеспецифических белков. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.

1. Применение β-аспартил-аргинина формулы H-Asp(Arg)-OH для приготовления фармацевтической композиции, обладающей нефропротекторной активностью.

2. Способ лечения нефропатии различного генеза, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, обладающей нефропротекторным действием, в форме для парентерального, перорального, интраназального, местного способа введения, при этом композиция содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида β-аспартил-аргинина формулы H-Asp(Arg)-OH и фармацевтически приемлемый носитель, при этом при парентеральном введении доза лекарственного средства составляет 0,1–10 мкг/кг массы тела один раз в день, при интраназальном – 1,0–10 мкг/кг массы тела один раз в день, при пероральном – 10,0–100 мкг/кг массы тела два раза в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.